形态学科研基础1B

5 样本量的设定问题
一般形态研究可将标本分为四级，实验动 物个体为一级样本，组织块为二级标本， 切片为三级样本，视野或照片为四级样本。 如以每组4只动物计算，其二级样本应做812个包埋头块；研究时从中随机选6块以上 进行切片，如果每块切选4-5张切片，就得 到 约30张切片（三级样本），经染色处理 后，每张切片随选2-3个视野作为定量研究 样本，这样每组的四级样本量就达到定量 分析的要求。
6 选定合理的参数、对照参数问题
结构定量参数有相对参数和绝对参数之 分。目前绝大多数的形态结构定量数据都 是相对参数，这是由于相对参数的测试方 法较容易掌握，干扰因素较少，也能较客 观地说明常见的一些结构定量的问题。除 切片厚度在研究细胞器和一些较小的胞质 内颗粒时需要考虑外，一般不考虑器官、 组织、细胞的收缩率和实际体积等因素。
4 避免由于染色的非特异性造成的假阳性
为避免发生这种现象，应尽力提高研究者 的技术水平，并认真分析发生染色假阳性 的原因，找出消除的办法。下面是几种常 见应对方法，仅供参考：（1） 适当稀释 染液浓度（包括抗体浓度和反应底物浓 度）；（2） 缩短染色时间；（3） 改用其 它染色试剂；（4） 有条件的情况下可采 用双标记方法等。
❖ 如以研究某器官毛细血管腔或肺泡腔的 体积变化，来论证所在器官的病理改变 和功能问题，就有很大的变异性和不确 定性，因为影响毛细血管腔或肺泡腔的 体积变化因素很多，其中组织灌注固定 不均、切片时的组织挤压和生理性肺组 织收缩等因素都能造成的随机取样时误 差偏大。所以，这类研究在可行性方面 多采用管壁厚度测量，或测定管腔变异 系数。
1 对所要开展的形态结构研究的领域要有一 个较全面的了解
形态结构研究定量是必然趋势。各研究 领域有其特殊的要求，但多数是将特殊染 色与计算机图象分析技术结合进行，可通 过面积、数量、形态、比色等定量指标进 行实验组间或组内比较，并客观给出结构 参数和统计图表等。
1 对所要开展的形态结构研究的领域要
3 保证所选取的样本具有无偏、随机性
取材时应避免人为的有选择性取材的 做.事实上如果组织细胞间的差异确实 存在，只要遵照科学的无偏和随机取材， 阳性结果是会反映出来的。如果组间差 异不显著或标准误差过大，只能通过增 加样本量来解决。无偏和随机取材的正 确做法是：把要取材的器官切分为多个 小组织块，再对它们进行编号，从中再 随机抽取数块，包埋处理。培养组织或 细胞的取材也应如此处理。
基本测量
1 点计数（分测点计数和交叉点计数）
2 特征物计数（包括轮廓面计数和粒子 计数） 禁线法则（禁线为下、左两线， 计数线为上、右两线）
长度测量
1 费莱特直径 (d1+d2)/2
2 截距测量
反映长条形特征物的宽度，所测截 距应是穿过其两侧的测线线段长度， 测线如从同则穿出，不应测量截距
wenku.baidu.com
3 点取截距测量 先计数含测点的特征物，再 逐一测量并计算均值
测试格的类型及选择
1. 网状方格
2.
测试面积
3.
测试线
4.
测试点
5. d—小方格边长
6. L2=2d·P
A=d2·P
2. 关联短线测格 测点、测线 测面之间的 关系：
L=d/2·P A=d2·P
1. 平行等距直线测格 测线与测点的关系： L=d·P
通常在所有切片的所有测试视野内， 特征物的计数或测试项目（如点计数、 长度测量、特征物计数等）的总数，不 必超过200个。
第三部分 形态测量学
概述 生物形态定量分析是利用特制测试格、
线对待测结构进行二维图像测量，求出 特征物的面积、长度和数目等，再根据 二维图像与三维结构的数学关系进行计 算，最后得出特征物的三维结构参数。
特征物断面的定量特征，可较准确地、 间接地反映其三维的定量特征。特征物的 形态定量特征，包括度量特征（如体积、 表面积、高度、长度、厚度、平均曲率等） 和拓扑特征（如粒子或轮廓面数目等）。 拓扑是指与度量特征无关的、不受任意连 续变形（如伸缩、肿胀、皱缩等）所影响 的特征。
有一个较全面的了解
如需开展形态结构定量研究，就必须首 先对本专业研究领域的相关进展情况有较 充分的了解。同时，还要对研究对象的结 构定量研究的可靠性与可行性进行评估， 有条件的必须先做预实验。为随后的工作 奠定良好的基础。
2 所选研究对象是否具有说服力、代表性和技
术上的可行性
说明形态学变化的结构定量指标应具 有研究操作上的可行性，以及同类研究 间的可比性。使定量描述的内容具代表 性，如肝脏的功能是由肝细胞实现的， 所以肝细胞的形态、数量和代谢水平的 定量变化就具代表性。
常用形态测量的定量参数：
1 面积 细胞或结构平面所包涵的实际面积 2 周长 细胞或结构边缘的实际长度 3 面积体积与细胞面积相等的球的体积 4 周长体积 与细胞周长相等的球的体积，由于 海岸线效应周长体积要大于面积体积 5 长、短径 6 异形指数 7 形状因子
常用形态特征描述参数：
1 总面积 一幅图象中所有细胞面积之 和
形态定量分析结果的准确性，不仅取决 于准确地测量特征物和精确地运算获得的 结果， 而且也取决于测量组织图像质量 的好坏、 抽样方法的正确与否，以及切 片组织的变化大小等。因此，减少定量分 析结果与真实值之间的误差，准确地和客 观地反映特征物，才是形态定量研究的目 的。
常用测量工具包括：
显微刻度尺、目镜测试格、 图像测试格等
2 参考面积 所定义测量的面积 3 面积百分比（面密度） 总面积与参考 面积之比
4 场数目 一幅图象中细胞的个数 5 平均空间距 细胞间的平均距离
图象分析系统的操作基本步骤：
1 系统操作程序的调试（如定义测量窗口、 调亮度、调灰度、测背底等） 2 图象采集 3 图象存档 4 图象测量（自动测量、手动测量） 5 选定细胞或结构的确认 6 数据分析（数据方式、直方图方式） 7 定量资料、统计资料的打印
定量分析的影响因素
一 误差分析 1 过失误差（测量、记录、计算） 2 测量误差（属于随机误差） 3 系统误差（包括测试工具误差、图象 失真误差、抽样不随机误差等） 4 抽样误差
定量分析的影响因素
二 切片组织变化的影响 （组织皱缩、切片压缩、组 织变化的影响）
三 切片厚度的影响（景深）
形态学科研设计注意事宜