植物细胞培养及原生质体培养
植物组织培养重点
器官培养：即离体器官的培养。
植株培养：对完整植株材料的培养。
组织或愈伤组织培养:是对植物体的各部分组织进行培养或对由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养，二者均通过再分化诱导形成植株.细胞培养:是对由愈伤组织等进行液体振荡培养所得到的能保持较好分散性的离体单细胞或花粉单细胞或很小的细胞团的培养.原生质体培养:是用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的培养。
初代培养：芽、茎段、叶片、花器等外植体在离体培养条件下诱导愈伤组织、侧芽或不定芽、胚状体过程植物组织培养：是指通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体），接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照、湿度）进行培养，使其产生完整植株的过程。
愈伤组织：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在植物体切面上产生。
外植体：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。
植物细胞全能型：任何具有完成细胞核的植物细胞，能拥有形成一个完整植株所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。
脱分化:已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分生组织状态的过程。
再分化:脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。
胚状体：在离体过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。
褐变现象：指在接种后，其表面开始褐变，有事甚至会使整个培养基褐变的现象。
继代培养材料的玻璃化：当植物材料不断的进行离体繁殖时，有些培养物的嫩芽，叶片往往会呈半透明水迹状，这种现象通常成为玻璃化。
人工种子：通过植物组织培养的方法获得的具有正常发育能力的材料，外被有特定的物质，在适宜的条件下可以发芽成苗的植株幼体。
植板密度：形成的细胞团数/植板的细胞总数×100%对称融合：双方原生质体均带有核基因组和细胞质基因组的全部遗传信息。
非对称融合：指一方亲本的全部原生质与另一方亲本的部分核物质及细胞质物质重组产生不对称杂种。
植物组织培养第七章植物原生质体培养及细胞融合
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第 七 章 植物原生质体培养及细胞融合
陈传红 制作 2007 / 5
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本章内容提要： 原生质体培养的发展与意义 原生质体的分离 原生质体的培养 植物细胞的融合 体细胞杂种鉴定方法
1975年柑桔原生质体培养成功；
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现有：苹果、猕猴桃、柿、枇杷、马铃薯、番茄、矮牵牛等作物的原生质体培养成功；木本植物中柑桔最为成功。
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陈传红 制作 2007 / 5
番茄+马铃薯？
陈传红 制作 2007 / 5
3、融合方法
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1、机械分离（Machanical isolation）
Cut plasmolyzed tissue and subsequent deplasmolysis results in expansion and release of the protoplasts from the cut ends of the cell.
高度液泡化的细胞
陈传红 制作 2007 / 5
2、 酶解分离（Enzymatic isolation）
双子叶外植体/培养细胞
单子叶植物胚性细胞
2.1 材料 应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。叶肉细胞分离原生质体，来源方便，有明显的叶绿体，便于在融合中认识。 但禾本科叶肉原生质体往往不能分裂,因此常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料，最适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞。
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清新立春时节
什么是原生质体（Protoplast）？
1880, Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质 含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。
原生质体培养名词解释
原生质体培养名词解释原生质体培养是一种常用的植物组织培养技术，用于繁殖植物和研究植物基因转化等问题。
本文将介绍原生质体培养的定义、原理和应用等方面的名词解释。
下面是本店铺为大家精心编写的4篇《原生质体培养名词解释》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。
《原生质体培养名词解释》篇11. 原生质体（Protoplast）原生质体是指从植物细胞中除去细胞壁后剩余的细胞质部分，包括细胞膜、质体、线粒体、质体小体、微管和微丝等细胞器。
原生质体是一个高度液态的细胞质体系，其形态和功能类似于一个微小的细胞。
原生质体可以通过融合实现远缘杂交，从而扩大植物遗传资源的利用范围。
2. 原生质体培养（Protoplast Culture）原生质体培养是指将离体的植物原生质体在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
原生质体培养的主要目的是通过原生质体的融合，克服远缘杂交障碍，实现植物遗传资源的利用和改良。
3. 原生质体融合（Protoplast Fusion）原生质体融合是指两个或多个原生质体合并成一个细胞的过程。
原生质体融合可以通过电激、化学处理或生物方法等手段诱导。
融合后的细胞称为杂种细胞，可以用于植物遗传资源的利用和改良。
4. 再生（Regeneration）再生是指通过培养技术，使离体的植物组织或细胞重新分化、再生为新的植株或组织。
再生是原生质体培养的重要应用之一，也是植物组织培养技术的基础。
5. 遗传转化（Genetic Transformation）遗传转化是指将外源基因或基因组导入植物细胞内，并使其表达的过程。
遗传转化是植物基因工程的重要组成部分，也是原生质体培养的应用之一。
通过原生质体培养技术，可以将目的基因导入植物细胞内，并实现植物的遗传转化。
6. 植物组织培养（Plant Tissue Culture）植物组织培养是指将离体的植物组织或细胞在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
植物原生质体的培养与体细胞杂交
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植物细胞组织培养(PPT)
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主要有:
➢ 原生质体（Protoplast）培养 ➢ 悬浮细胞培养 ➢ 组织（愈伤组织Callus、茎尖分生组织）培
养 ➢ 器官（胚，花药，子房，根和茎）培养
其中最常见的是愈伤组织培养。
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植物细胞组织培养范畴：
（广义）又叫离体培养：指从植物体分离出 符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等， 通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养 以获得再生的完整植株或生产具有经济价值 的其他产品的技术。
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三、植物组织培养的生理依据
植物生长调节物质对于植物细胞组织的分化和决定具 有关键性作用。它包括：生长素类、细胞分裂素类、 赤霉素、脱落酸、乙烯等
生长素类主要用于愈伤组织的形成，体细胞胚的产生及试管 苗的生根。常用的有2,4-D、NAA、IBA、IAA等。其作用强 弱为2,4-D>NAA>IBA>IAA。
细胞分裂素类则有促进细胞的分裂与分化，延迟组织的衰老， 促进芽的产生等作用。常用的有Zip(异戊烯腺嘌呤)、KT、6BA、ZT等作用强弱顺序为。Zip>KT>6-BA>ZT。
赤霉素则有促进已分化的芽伸长生长，打破种子休眠的作用。 常用的为GA3。
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四、植物组织培养的原理
★植物细胞全能性（Cellular totipotency）： 任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成
种子培养
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3. 组织或愈伤组织培养(tissue， callus culture) ：是对植物体的各部分
组织进行培养，如茎尖分生组织、形成层、 木质部、韧皮部、表皮组织、胚乳组织和薄 壁组织等等；或对由植物器官培养产生的愈 伤组织进行培养，二者均通过再分化诱导形 成植株.
园艺生物技术
园艺生物技术一、名词解释1、组织培养：指在无菌条件下，将植物的离体器官、组织、细胞、胚胎、以及原生质，接种在到人工配制的培养基上，在人工控制的条件下进行培养，使其生长、分化，并长成完整植株的过程。
2、植物细胞的全能型：指植物的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育成为完整的植株的潜在能力。
3、植物细胞分化：指在个体发育过程中，细胞在邢台、结构和功能上的特化过程。
4、无病毒苗：是指不含有该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物内的存在表现为阴性反应的苗木。
5、立体快速繁殖：指通过无菌操作，将外植体接种于培养基上，在人工控制的营养和环境条件控制下进行培养，，使其在较短的时间内快速的再生出大量完整植株的方法。
6、脱分化：指植物离体的器官、组织、细胞在培养条件下，经过多次细胞分裂，而失去原来的分化状态，形成无结构的愈伤组织或细胞团，并使其恢复到胚性细胞状态的过程。
7、再分化：指离体培养的植物组织或细胞可以由脱分化状态再度分化成另一种或几种类型的细胞、组织、器官、甚至是最终再生成完整植株的过程。
8、体细胞无性系变异：在培养阶段发生变异，进而导致再生植株亦发生遗传改变的现象。
9、种质资源的离体保存：是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要时重新恢复其生长，并再生植株的方法。
10、园艺植物的细胞工程：指应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的试验方法和技术，在细胞水平上研究改造园艺植物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或园艺植物新品种的科学。
11、基因工程：将外源基因通过体外的重组后导入受体细胞内使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译、表达的系列操作技术总称。
12、限制性内切酶：从细菌中分离提纯的内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点----分子手术刀。
13、基因文库：指将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA 片段随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列。
植物原生质体培养名词解释
植物原生质体培养名词解释嘿，朋友们！今天咱来唠唠植物原生质体培养这档子事儿。
你说这植物原生质体培养啊，就好比是给植物来一场特别的“变身之旅”。
植物细胞大家都知道吧，就像一个小小的城堡，外面有厚厚的城墙，那就是细胞壁啦。
而原生质体呢，就是去掉了这层城墙之后的精华部分。
想象一下，植物就像是一个有好多宝贝的大箱子，细胞壁就是那箱子的外壳。
咱们把外壳去掉，不就能更直接地接触到里面的宝贝啦？原生质体培养就是这么个道理呀。
这原生质体培养有啥用呢？用处可大啦！它能让我们更好地了解植物的秘密呀。
比如说，我们可以通过培养原生质体，看看植物是怎么生长发育的，就像看着一个小娃娃一点点长大一样。
而且啊，这还能帮我们培育出更好的品种呢！就好像是给植物来个大改造，让它们变得更厉害、更优秀。
培养原生质体可不是一件容易的事儿啊，就跟照顾小婴儿似的，得小心翼翼的。
首先得把细胞壁去掉吧，这可得有专门的技术和方法，可不是随随便便就能做到的。
然后呢，还得给它们提供合适的环境，就像给小婴儿准备温暖的小床和充足的食物一样。
培养的过程中还可能会遇到各种各样的问题呢。
哎呀，有时候就像小孩子会生病一样，原生质体也可能会出点小状况。
这时候就得靠我们这些“植物医生”啦，得赶紧想办法解决问题，让它们能健康成长。
你说这植物原生质体培养难不难？当然难啦！但这也是它有趣的地方呀。
就好像爬山，虽然过程很辛苦，但当你爬到山顶，看到那美丽的风景时，一切都值啦！咱们研究植物原生质体培养，不就是为了让植物世界变得更美好嘛。
让那些花儿开得更艳，那些树长得更高更壮。
这多有意思呀！所以啊，朋友们，可别小瞧了这植物原生质体培养。
它就像是一把神奇的钥匙，能打开植物世界的大门，让我们看到更多的奇妙和美好。
让我们一起加油，去探索这个充满神秘和惊喜的植物原生质体培养的世界吧！怎么样，是不是很有意思呢？。
第八章第九章植物原生质体培养与体细胞杂交ppt课件
烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的 健康皮 肤进行 自体移 植，但 对于大 面积烧 伤病人 来讲， 健康皮 肤很有 限，请 同学们 想一想 如何来 治疗该 病人
第二节 植物原生质体培养的发展与意义
原生质体的培养技术，近年来也有很大改进，特别 值得指出的是单个原生质体培养再生植株的成功 （Spangenberg等，1986）。
利用这一技术，可以在单细胞水平上研究不同类型原 生质体的生理特性，相互之间的作用以及单个原生质体 的遗传操作。对不同亲本单个原生质体进行融合的研究 也是有利的（Schweigo等，1987）。
饲养层培养法可大大提高水稻（Kyozu等，1987）、 玉米（Rhodes等，1988）等作物原生质体的植板率。 已有不少报道说明，琼脂糖能促进原生质体的分裂 （Shillto等，1983），并有利于对原生质体生长过程 的观察。
第一节
植物原生质体的定义及特点
（5）能摄取外来物质，可作遗传转化工具。
外来物质如核酸、蛋白质等高分子物质乃至病毒、 叶绿体、细胞核和细菌等，是进行遗传转化研究的 理想工具。
（6）变异为单细胞，变异性状易纯。
原生质体在培养中会发生变异，由于其是纯粹单 细胞，因此变异原生质体再生植株的变异性状会更 纯。
第三节 植物原生质体培养方法
2、酶法分离原生质体： 即用细胞壁降解酶，脱除植物细胞壁，获得原生
质体的方法（Cocking,1960）。目前多用此法。 常用的细胞壁降解酶种类有：纤维素酶、半纤维
素酶、果胶酶、R-10（日本纤维素酶）、蜗牛酶 胼胝质酶、EA3-867酶等。 国内常用EA3-867酶是一种复合酶，其成分含 纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶（上海植物生化研 究所产）。
特别是一直认为难以培养的禾谷类作物，例如，水 稻（Fujimura等，1985）、玉米（蔡起贵等，1987； Rhodes等，1988）、小麦（Harris等，1988；王海 波等，1989）、谷子（夏镇澳等，1989），以及高粱 的原生质体培养都已相继成功。
植物原生质体培养方法
植物原生质体培养方法原生质体培养办法主要有固体培养法、液体培养法和固一液结合培养法。
另外对于低细胞密度的原生质体培养，还可以采纳饲养层培养法、共培养法和微滴培养法等。
而在原生质体应用于生物转化中时，常常采纳固定化原生质体培养技术举行固定培养。
一、固体平板培养法原生质体的培养办法和对培养条件的要求常与单细胞培养相像。
故原生质体的培养也可根据单细胞的平板办法举行。
首先把原生质体悬浮在液体培养基中(密度为104个／mL左右)，与高压灭菌后冷却至42～45℃的培养基(2倍固化剂浓度)用大口刻度吸管快速等量混匀，并快速转移到培养皿中，旋转培养皿，眨眼便凝固，用石蜡膜带密封，暗培养。
培养基层不宜过厚，普通2～3mm。
培养5～7d原生质体开头分裂，3周左右观看细胞植板率。
待形成大细胞团后，转移到去除渗透压调整剂的新奇固体培养基中继代培养。
近年来发觉，用琼脂糖代替琼脂粉可以提高植板率。
特殊是对于那些在琼脂培养基上不易发生分裂的原生质体，用法琼脂糖可能会取得比较好的效果。
低熔点琼脂糖可在30℃左右溶化，与原生质体混合不影响原生质体的活力。
该办法的优点：原生质体分布匀称，有利于分裂；简单获得单细胞株系；可定位观看单个原生质体的生长发育状况。
缺点：原生质体易受热损害；易破裂；原生质体始终处在高渗透压胁迫下，生长发育缓慢，植板率低。
二、液体浅层培养法尽管固体培养有上述优点，但无数讨论者还是喜爱用法液体培养基，这是由于，当用法液体培养基的时候，经过几天培养之后，可用有效的办法把培养基中的渗透压降低；另外，假如原生质体群体中的蜕变组分产生了某些能杀死健康细胞的有毒物质，可以随时更换培养基；再有，经过几天高密度培养之后，可把细胞密度降低，或把目标细胞分别出来。
本办法是用液体培养基举行原生质体培养。
把纯化后的原生质体用液体培养基调节好密度，用吸管转移到培养皿中，石蜡膜带密封，在培养室暗培养。
培养基层厚2～3mm。
培养5～10d细胞开头分裂，此时开头降低培养基中的渗透压。
植物细胞培养及原生质体培养
3.单细胞培养：对单离的细胞进行培养的方 法。
（1）平板培养法：分散的植物细胞接种于含薄层固 体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。。
方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶 等)消化分散的细胞，洗涤离心除酶，细胞浓缩物经 计数及稀释，接种到加热熔化而刚冷却至35℃左有 的固体培养基中充分混匀，倾入培养皿中，石蜡密 封，于25℃含5％CO2空气的培养箱中培养，细胞即 可生长成团。
(3) 悬浮培养特点：
培养过程中细胞总数不断增加，一定时间后产量达 最高点，生长趋于停止。然后进行移植继代培养，其过 程表现出严格可重复周期性变化，细胞增长规律与微生 物相同，有延迟期、对数生长期、减慢期及静止期等阶 段。植物细胞接种时要达到一定细胞浓度，通常为0. 25 x l0‘细胞／ml 一0. 5 x 10‘细胞／m1。
•植物细胞培养及原生质体培养
（四）细胞培养过程： 1. 择适宜的外植体； 2. 诱导疏松愈伤组织； 3. 选择适宜的培养基； 4. 悬浮培养； 5. 悬浮细胞的继代与选择； 6. 悬浮细胞的同步化； 7. 悬浮愈伤组织形成及植株再生。
•植物细胞培养及原生质体培养
水稻细胞悬浮培养及植株再生：
1.愈伤组织的诱导： (1)取水稻种子，人工去皮后用70％酒精表面消毒2 分钟，再用2．5％次氯酸钠水溶液浸泡并轻轻搅动 30分钟。 (2)将种子用无菌蒸馏水冲洗3次，按每瓶3粒接入 附加2mg／L 2，4—D、3％蔗糖、0．3％酵母提取 物的Ms固体培养基中，25℃黑暗下培养、诱导愈伤 组织。 (3) 3周后，将从胚部长出的愈伤组织切割，并转移 到新鲜培养基上继代培养，每2周继代1次。 (4)挑选疏松、易碎的愈伤组织进行继代、增殖．
•植物细胞培养及原生质体培养
植物原生质体培养的技术流程
植物原生质体培养的技术流程
内容:
植物原生质体培养是一种重要的植物组织培养技术,主要用于快速培养和大量繁殖目的植物的原生质体。
其技术流程主要包括以下几个步骤:
1. 选择培养原料。
选择健康、无病害的植株作为原生质体的供体,常选择嫩茎、嫩叶等组织。
2. 消毒和预处理。
使用烧瓶或培养皿,在无菌操作台进行表面消毒,然后剪切或撕取原生质体,进行预培养。
3. 建立原生质体悬浮培养系统。
将预培养的原生质体转移到含有培养基的烧瓶或培养皿中,保持液面悬浮状态培养。
4. 原生质体增殖。
在光照培养箱中培养,原生质体进行分裂增殖。
适时传代培养。
5. 原生质体发育。
当原生质体增殖到一定数量后,改变培养基成分,促进原生质体发育为细胞组织块体。
6. 组织块体生长。
继续培养,组织块体继续生长,并通过组织分化形成完整植株。
7. 移栽和驯化。
将组织块体或小植株移植到培养基中生根定植,然后
逐渐转移到土壤中,进行环境驯化,最后完全转入盆栽或野外栽培。
通过上述技术流程,可以实现大量快速培养目标植物的原生质体,并最终获得完整的植株,实现规模化种植。
植物的原生质体培养PPT课件
酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类
保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力
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3）原生质体分离过程：一步法 （以烟草叶片为例）
▪ 第一步：预处理即对烟草植株限制供水
▪ 第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥 去外表皮切成4cm的小块
▪ 第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶 0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol
5、稳定性较差: 失去了细胞壁的保护作用，稳定性较差，易
于受到渗透压等条件变化的影.响。
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原生质体用途
信息传递、能量转换 细胞壁合成机理 膜的结构与功能 核质关系 杂交或自交不亲和的机理 细胞间的相互作用 植物激素的作用机理
融合产生体细胞杂种 分离各种细胞器 引入各种细胞器 导入外源基因 诱发突变体
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2）酶解法
1960年英国诺丁汉大学的科金第一次用酶解法从番 茄幼苗根尖中大量制备出原生质体；
常用酶：纤维素酶类、果胶酶类、半纤维素酶、蜗 牛酶等；
优点：条件温和、原生质体完整性好、活力 高、得率高，而且几乎所有的植物或它们的器 官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。
缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过 氧化物酶以及酚类物质，影响所获原生质体的 活力。
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二、 原生质体的制备
不同的植物细胞，由于细胞壁的组成、结 构和性质有所不同，原生质体的制备方法也不 一样。
1、用于分离原生质体的材料准备：选取生长旺盛 的细胞，幼嫩的组织。
无菌试管苗叶片
上胚轴和子叶
培养细胞（愈伤组织）
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2、原生质体的分离 1）、机械法：利刃机械切割 2）、酶解法：果胶酶和纤维素酶处理
植物原生质体培养的技术流程
植物原生质体培养的技术流程一、原生质体的分离解离液的准备：解离液的组成和浓度直接影响原生质体的分离效率。
常用的解离液包含酶类，如纤维素酶和果胶酶，它们能够分解植物细胞壁。
根据不同植物材料的特性，调整酶液的浓度和pH值，确保其能有效地分解细胞壁而不损伤细胞质。
原生质体的分离与纯化：解离后，将混合液通过筛网过滤，以去除未解离的细胞碎片。
然后，将过滤后的液体转移到离心管中，以低速离心收集原生质体。
使用适当的密度梯度离心技术进一步纯化原生质体，去除细胞碎片和其他杂质。
二、原生质体的培养培养基的选择与准备：原生质体的培养需要合适的培养基，通常选择含有碳源、矿质元素、维生素和生长调节剂的培养基。
培养基的配方会根据不同植物物种和实验目的进行调整。
培养基在使用前需要经过高压灭菌，以确保无菌条件。
原生质体的接种：将纯化后的原生质体悬液接种到固体或液体培养基上。
对于固体培养基，可以将原生质体悬液均匀地涂布在培养基表面。
对于液体培养基，则将原生质体悬液直接倒入培养瓶中。
接种后，培养基应保持无菌环境，并在适宜的温度和光照条件下进行培养。
培养环境的控制：原生质体的培养环境包括温度、湿度、光照等。
一般情况下，原生质体的培养温度为2528℃，光照条件则根据植物种类和培养目的进行调整。
保持适宜的环境条件，有助于原生质体的生长和分化。
三、原生质体的再生诱导再生：在适宜的培养条件下，原生质体开始分化成愈伤组织或小芽。
根据不同植物的需求，可能需要在培养基中添加特定的生长调节剂，如细胞分裂素、赤霉素等，以促进愈伤组织或芽的形成。
转化与选择：对于转基因实验，可能需要使用农杆菌介导的转化方法将外源基因导入原生质体中。
转化后的原生质体应在选择培养基上培养，以筛选出成功转化的细胞。
选择培养基通常含有抗生素，以筛选含有抗性基因的细胞。
分化与生根：成功转化的细胞在培养基中继续生长，并开始分化为完整的植物组织。
此阶段通常需要切换到生根培养基，以促使愈伤组织或芽生根。
植物原生质体培养及细胞融合
2．染色观察
• 取一滴0.02％的FDA液与一滴原生质体悬 浮液在载玻片上混匀，25E室温染色5～ 10min。用荧光显微镜观察，激发光波长 330～500nm，活的原生质体产生黄绿色 荧光。用计数器计算存活百分率。
(二)酚藏花红染色法
• 酚藏花红(phenosafranine)是一种碱性 染料，溶于水显红色并带黄色荧光，其 最大激发和射波长分别为527nm和588nm 。酚藏花红能被活的原生质体吸收而呈 红色，无活性的原生质体因无吸收能力 而五色。
(三)不连续梯度离心法
• 在离心管中首先放人不同浓度的Ficoll 溶液，构成不同的浓度梯度，在上部滴 人1～2ml酶一原生质体混合液，在150g 下离心5min，不同比重的原生质体漂浮 在不同的浓度梯度的界面上，用吸管收 集原生质体，悬浮洗涤备用。该方法的 优点是获得的原生质体大小均匀致，纯 度高；缺点是操作繁杂，原生质体的收 率低。
(五)分离方法 • 1．机械分离法 • 但由于该方法获得的原生质体产量低， 不能满足实验需要，而且液泡化程度低 的细胞不能采用该方法，因此，机械分 离法没有得到广泛应用。 • 2．酶分离法
• 1960年，德国诺丁汉大学的Cocking首先利用 纤维素酶从番茄幼苗根尖中分离获得原生质体 ，而且收率高、完整性好、活力强。经过数十 年的不断完善，目前酶分离法已成为植物原生 质体分离最有效的方法。 • 酶分离法又分为两步法和一步法。两步法是先 用果胶酶处理材料，游离出单细胞，然后再用 纤维素酶处理单细胞，分离出原生质体。其优 点是所获得的原生质体均匀一致、质量好。但 由于操作繁杂，目前已逐渐被淘汰。 • 一步法是将纤维素酶和果胶酶等配制成混合酶 溅处理材料，一步获得原生质体。因操作简便 ，目前几乎均采用该方法。
原生质体培养-课件
目的与要求
掌握植物细胞原生质体培养的意义，了解原生质 分离方法，原生质纯化方法和活力测定方法。掌握植 物原生质体的培养方法及其特点，以及存活率、密度、 产量的测定方法。掌握原生质体融合概念、介绍原生 质体融合方法，了解杂种细胞的筛选、鉴定和杂种植 株的鉴定方法。
具备原生质体分离、纯化基本认知，具有原生质 体培养基本能力，能够理解原生质体融合概念及方法。
一般起始密度为5000-10000个/ml，看护培养可降 低培养密度。 3、渗透压稳定剂
在原生质体培养中除用2-3%蔗糖作为稳定剂外， 还使用0.3-0.5mol/l的甘露醇。有的用葡萄糖完全或 部分取代甘露醇，效果也很高。
五、影响原生质体培养的因素
4、培养基成分 1）基本培养基：MS,B5，Nitsch、N6、KM-8P 2）碳源：葡萄糖（大多数用） 3）无机盐浓度和氮形态：无机盐浓度不宜过高，尤 其铵态氮浓度不宜过高。 4）植物生长调节剂的浓度配比：
（一）双醋酸盐荧光素染色法测定存活率 存活率=存活原生质体数/总原生质体数×100
（二）测定原生质体的密度 原生质体的密度（个/ml）=（原生质体数/1区域）
×104×稀释倍数
四、影响原生质体培养的因素
1、原生质体活力 选择生长健康植株上的外植体，或分裂旺盛的愈
伤组织或悬浮细胞，在酶解处理时酶制剂浓度不要过 高。 2、原生质体起始密度
四、杂种植株的鉴定 1、形态学鉴定 2、细胞学观察 3、DNA内切图谱分析法 4、同工酶分析法
思考题： 1、说明机械分离法和酶分离法的特 点 2、原生质体纯化方法有哪些？原生 质体活力的测定方法有哪些？ 3、简述原生质体五种培养方法及特 点 4、原生质体融合有哪几种方法？
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最大特点是细胞生长速率标准一致，新形 成的细胞补偿了被排出的细胞，系统内细胞密度、 生长速度、化学成分、细胞代谢活性都维持恒定。 可通过改变培养基及培养条件建立恒定系统。
恒化控制：通过营养液或某一成分
恒浊控制：比浊计测定浑浊度而进行流量 控制。
2. 固相化培养技术：
细胞固定在一定的惰性基质中，如琼脂、海藻 酸盐、聚丙烯酰氨纤维膜上，细胞不能运动，但营养 液可以在基质中流动。
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(二) 植物细胞培养的营养需求及培养基
１. 营养需求： 植物细胞生长所需营养较微生物细胞复杂， 除水分外，其它营养成分可分为如下几类：
(1) 无机营养: 如N、 P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、B、Mo、I 等；
(2)维生素：如维生素B1、B6、烟酸、肌醇、生物素、泛酸钙及叶酸 等；
(3) 悬浮培养特点：
培养过程中细胞总数不断增加，一定时间后产量达 最高点，生长趋于停止。然后进行移植继代培养，其过 程表现出严格可重复周期性变化，细胞增长规律与微生 物相同，有延迟期、对数生长期、减慢期及静止期等阶 段。植物细胞接种时要达到一定细胞浓度，通常为0. 25 x l0‘细胞／ml 一0. 5 x 10‘细胞／m1。
A. 悬浮培养物分散性好，细胞团较小，一般由 几十个以下的细胞组成。
B. 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。
C. 生长迅速，悬浮细胞的量一般2—3天甚至更
短时间便可增加一。
(2) 培养过程：
将愈伤组织、无菌苗、吸涨胚胎或外植体芽尖、根 尖及叶肉组织，经匀浆器破碎、纱布或不锈钢网过滤， 单细胞滤液作为按种材料，接种于液体培养基中振荡培 养。
(4)悬浮培养类型：
A. 成批培养(Batch culture)：
成批培养是在一个封闭的系统中进行细胞培 养。细胞材料生长在已固定体积的培养基中。随着细胞 数量的增加，培养基营养的消耗及某些其他因子的积累 会使细胞停止生长。
继代培养需取出少量培养物转接于新鲜培养液 中。生长过程包括延迟期、指数期、静止期等。
（1）固相化培养的特点：
A. 消除剪切力； B. 细胞生长缓慢，促进次生代谢过程； C. 细胞之间紧密接触，形成梯度，利于产 物积累； D. 便于操作，不易污染。 E. 便于产物收集。
(2) 固相化培养系统：
A. 平床培养：生长慢，代谢产物多，但不易放
大。
B. 填充床培养：条件控制困难。
C. 膜生物反应器：采用一定孔径和选择透性膜 来固定营养物，营养物可以通过膜渗透到细胞中。
2. 细胞生长速度慢，易受微生物污染，有 时需用抗生素；
3. 细胞生长的中期及对数期，易凝聚为 直径达350 um一400 um 的团块，悬浮培养较困 难；
4. 培养时需供氧，培养液粘度大，不能耐 受强力通风搅拌；并具有群体效应
5. 培养细胞产物滞留于细胞内，且产量较 低，培养过程具有结构与功能全能性。
分缓慢转动培养（1-2rpm）、震荡培养 （100rpm）、快速转动培养（80-120rpm）和搅拌培养。
B. 连续培养(Continuous culture):
是用一定容积的非密闭系统进行 细胞培 养的方法，在培养过程中不断注入新鲜培养基， 而使营养物连续得到补充，细胞生长和增殖连续 进行，同时有等体积的培养物排除系统。
第 十 章 植物细胞及原生质体培 养
一、植物细胞培养：
在一定条件下，通过人工供给营养物质及生 长因子，使离体植物细胞生长繁殖的方法。
细胞培养技术主要用于研究细胞生长、发育 与分化等理论以及用于植物次生代谢物质生产。
（一）细胞培养(cell culture)的特性：
1. 植物细胞较微生物细胞大，具有纤维素细 胞壁，抗剪切力差；
(7) 核酸及其水解物: 如DNA、RNA、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、鸟 嘌呤及胸腺嘧啶等；
(8) 其它成分: 如氯化胆碱、胆质素、胶氨酸、苹果酸及反丁烯二酸 等.
2. 培养基：
(1)固体培养基：添加琼脂等
(2) 液体培养基：不加琼脂等
(三) 植物细胞培养技术
实验室中有悬浮培养、固相化培养、单细 胞培养（微室培养、平板培养、看护培养、悬滴 培养、微滴培养）等多种培养方式。
1. 悬浮培养法：
植物细胞悬浮培养(cell suspension culture) 即植物细胞或小的细 胞聚集体在液体培养基中于摇床 上进行悬浮 培养，这些
细胞和小的聚集体来自愈伤组织，某个器官 或组织，甚至幼嫩的植株，通过物理或化学 的方法进行分离而获得。
(1) 优良的悬浮细胞培养体系必需满足：
3.单细胞培养：对单离的细胞进行培养的方 法。
（1）平板培养法：分散的植物细胞接种于含薄层固 体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。。
方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶 酶等)消化分散的细胞，洗涤离心除酶，细胞浓缩物 经计数及稀释，接种到加热熔化而刚冷却至35℃左 有的固体培养基中充分混匀，倾入培养皿中，石蜡 密封，于25℃含5％CO2空气的培养箱中培养，细胞 即可生长成团。
（2）看护培养法：从悬浮培养物或脆弱愈伤组织上 用针或玻璃毛细管分离单细胞，每个细胞放在一个 方形滤纸片的上表面，而滤纸片放在活跃生长的愈 伤组织上进行培种于凹玻 片或玻璃环与盖玻片 组成的微室内的固体 培养基中的培养方法。
（四）细胞培养过程： 1. 择适宜的外植体； 2. 诱导疏松愈伤组织； 3. 选择适宜的培养基；
(3) 碳源: 如蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及山梨醇等；
(4)天然物: 如水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取液、香蕉 汁、荸荠汁、生梨汁及苹果汁等；
(5) 植物激素: 如生长素 、赤霉素、细胞分裂素 、脱落酸；其它有 油菜素内酯、三十烷醇、肽类、半支莲醇、月光花素、石蒜素、玉米 素等；
(6)氨基酸类: 如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、 亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、组氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氯酸、 苏氨酸、酪氨酿、精氨酸、丙氨酸及半胱氨酸等；