植物细胞培养及原生质体培养
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(1)固相化培养的特点:
A. 消除剪切力; B. 细胞生长缓慢,促进次生代谢过程; C. 细胞之间紧密接触,形成梯度,利于产 物积累; D. 便于操作,不易污染。 E. 便于产物收集。
(2) 固相化培养系统:
A. 平床培养:生长慢,代谢产物多,但不易放
大。
B. 填充床培养:条件控制困难。
C. 膜生物反应器:采用一定孔径和选择透性膜 来固定营养物,营养物可以通过膜渗透到细胞中。
1. 悬浮培养法:
植物细胞悬浮培养(cell suspension culture) 即植物细胞或小的细 胞聚集体在液体培养基中于摇床 上进行悬浮 培养,这些
细胞和小的聚集体来自愈伤组织,某个器官 或组织,甚至幼嫩的植株,通过物理或化学 的方法进行分离而获得。
(1) 优良的悬浮细胞培养体系必需满足:
第 十 章 植物细胞及原生质体培 养
一、植物细胞培养:
在一定条件下,通过人工供给营养物质及生 长因子,使离体植物细胞生长繁殖的方法。
细胞培养技术主要用于研究细胞生长、发育 与分化等理论以及用于植物次生代谢物质生产。
(一)细胞培养(cell culture)的特性:
1. 植物细胞较微生物细胞大,具有纤维素细 胞壁,抗剪切力差;
3.单细胞培养:对单离的细胞进行培养的方 法。
(1)平板培养法:分散的植物细胞接种于含薄层固 体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。。
方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶 酶等)消化分散的细胞,洗涤离心除酶,细胞浓缩物 经计数及稀释,接种到加热熔化而刚冷却至35℃左 有的固体培养基中充分混匀,倾入培养皿中,石蜡 密封,于25℃含5%CO2空气的培养箱中培养,细胞 即可生长成团。
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(二) 植物细胞培养的营养需求及培养基
1. 营养需求: 植物细胞生长所需营养较微生物细胞复杂, 除水分外,其它营养成分可分为如下几类:
(1) 无机营养: 如N、 P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、B、Mo、I 等;
(2)维生素:如维生素B1、B6、烟酸、肌醇、生物素、泛酸钙及叶酸 等;
(3) 碳源: 如蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及山梨醇等;
(4)天然物: 如水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取液、香蕉 汁、荸荠汁、生梨汁及苹果汁等;
(5) 植物激素: 如生长素 、赤霉素、细胞分裂素 、脱落酸;其它有 油菜素内酯、三十烷醇、肽类、半支莲醇、月光花素、石蒜素、玉米 素等;
(6)氨基酸类: 如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、 亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、组氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氯酸、 苏氨酸、酪氨酿、精氨酸、丙氨酸及半胱氨酸等;
4. 悬浮培养; 5. 悬浮细胞的继代与选择; 6. 悬浮细胞的同步化; 7. 悬浮愈伤组织形成及植株再生。
A. 悬浮培养物分散性好,细胞团较小,一般由 几十个以下的细胞组成。
B. 均一性好,细胞形状和细胞团大小大致相同。
C. 生长迅速,悬浮细胞的量一般2—3天甚至更
短时间便可增加一。
(2) 培养过程:
将愈伤组织、无菌苗、吸涨胚胎或外植体芽尖、根 尖及叶肉组织,经匀浆器破碎、纱布或不锈钢网过滤, 单细胞滤液作为按种材料,接种于液体培养基中振荡培 养。
2. 细胞生长速度慢,易受微生物污染,有 时需用抗生素;
3. 细胞生长的中期及对数期,易凝聚为 直径达350 um一400 um 的团块,悬浮培养较困 难;
4. 培养时需供氧,培养液粘度大,不能耐 受强力通风搅拌;并具有群体效应
5. 培养细胞产物滞留于细胞内,且产量较 低,培养过程具有结构与功能全能性。
(7) 核酸及其水解物: 如DNA、RNA、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、鸟 嘌呤及胸腺嘧啶等;
(8) 其它成分: 如氯化胆碱、胆质素、胶氨酸、苹果酸及反丁烯二酸 等.
2. 培养基:
(1)固体培养基:添加琼脂等
(2) 液体培养基:ห้องสมุดไป่ตู้加琼脂等
(三) 植物细胞培养技术
实验室中有悬浮培养、固相化培养、单细 胞培养(微室培养、平板培养、看护培养、悬滴 培养、微滴培养)等多种培养方式。
(3) 悬浮培养特点:
培养过程中细胞总数不断增加,一定时间后产量达 最高点,生长趋于停止。然后进行移植继代培养,其过 程表现出严格可重复周期性变化,细胞增长规律与微生 物相同,有延迟期、对数生长期、减慢期及静止期等阶 段。植物细胞接种时要达到一定细胞浓度,通常为0. 25 x l0‘细胞/ml 一0. 5 x 10‘细胞/m1。
分缓慢转动培养(1-2rpm)、震荡培养 (100rpm)、快速转动培养(80-120rpm)和搅拌培养。
B. 连续培养(Continuous culture):
是用一定容积的非密闭系统进行 细胞培 养的方法,在培养过程中不断注入新鲜培养基, 而使营养物连续得到补充,细胞生长和增殖连续 进行,同时有等体积的培养物排除系统。
最大特点是细胞生长速率标准一致,新形 成的细胞补偿了被排出的细胞,系统内细胞密度、 生长速度、化学成分、细胞代谢活性都维持恒定。 可通过改变培养基及培养条件建立恒定系统。
恒化控制:通过营养液或某一成分
恒浊控制:比浊计测定浑浊度而进行流量 控制。
2. 固相化培养技术:
细胞固定在一定的惰性基质中,如琼脂、海藻 酸盐、聚丙烯酰氨纤维膜上,细胞不能运动,但营养 液可以在基质中流动。
(4)悬浮培养类型:
A. 成批培养(Batch culture):
成批培养是在一个封闭的系统中进行细胞培 养。细胞材料生长在已固定体积的培养基中。随着细胞 数量的增加,培养基营养的消耗及某些其他因子的积累 会使细胞停止生长。
继代培养需取出少量培养物转接于新鲜培养液 中。生长过程包括延迟期、指数期、静止期等。
(2)看护培养法:从悬浮培养物或脆弱愈伤组织上 用针或玻璃毛细管分离单细胞,每个细胞放在一个 方形滤纸片的上表面,而滤纸片放在活跃生长的愈 伤组织上进行培养的方法。
(3)微室培养法:悬 浮单细胞接种于凹玻 片或玻璃环与盖玻片 组成的微室内的固体 培养基中的培养方法。
(四)细胞培养过程: 1. 择适宜的外植体; 2. 诱导疏松愈伤组织; 3. 选择适宜的培养基;