重组蛋白分离与纯化技术 ppt!!!
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重组蛋白质表达、复性与纯化.ppt
为什么要 • HA-tag (YPYDVPDYA)
• Flag-tag (DYKDDDDK)
加 tag ? • Myc-tag (EQKLISEEDL)
有前景的特殊用途的tag
• Biotinylation-tag
100多AA的结构域, 在大肠杆菌中被识别为生 物素化的位点. Promega的PinPointTM Xa-1; Invitrogen的pET104-DEST. • 未命名 DVEAWLGAR, 被用来和streptoavidin结合 (个人通讯)
在大肠杆菌中表达 重组蛋白质
• 如果目的蛋白质有二硫键并需要 正确的立体结构, 尽可能进行可 溶性表达;
• 如果目的蛋白质没有二硫键或只 用来制备抗血清, 采用包含体表达 比较好;
• 如果目的多肽的分子量小于 10 kDa, 一定要进行融合表达
大肠杆菌表达载体分类
按蛋白质类型分
• 单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体 • 融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc • 分泌表达: pel/ompT分泌肽
• 质粒不稳定，尚无商品化的表达 载体
其他
•乳酸菌 (Lactic acid bacteria) •沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) •苏云金杆菌
(Bacillus thuringiensis)
真核细胞表达体系
酵母细胞 昆虫细胞 植物细胞/组织 哺乳动物细胞/组织
酵母细胞
两种主要的分子伴侣
Type I: chaperones which are functionally responsible for the correct folding, assembly and transport of newly synthesized peptide– HSP family,GroELS,ect.
• Flag-tag (DYKDDDDK)
加 tag ? • Myc-tag (EQKLISEEDL)
有前景的特殊用途的tag
• Biotinylation-tag
100多AA的结构域, 在大肠杆菌中被识别为生 物素化的位点. Promega的PinPointTM Xa-1; Invitrogen的pET104-DEST. • 未命名 DVEAWLGAR, 被用来和streptoavidin结合 (个人通讯)
在大肠杆菌中表达 重组蛋白质
• 如果目的蛋白质有二硫键并需要 正确的立体结构, 尽可能进行可 溶性表达;
• 如果目的蛋白质没有二硫键或只 用来制备抗血清, 采用包含体表达 比较好;
• 如果目的多肽的分子量小于 10 kDa, 一定要进行融合表达
大肠杆菌表达载体分类
按蛋白质类型分
• 单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体 • 融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc • 分泌表达: pel/ompT分泌肽
• 质粒不稳定，尚无商品化的表达 载体
其他
•乳酸菌 (Lactic acid bacteria) •沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) •苏云金杆菌
(Bacillus thuringiensis)
真核细胞表达体系
酵母细胞 昆虫细胞 植物细胞/组织 哺乳动物细胞/组织
酵母细胞
两种主要的分子伴侣
Type I: chaperones which are functionally responsible for the correct folding, assembly and transport of newly synthesized peptide– HSP family,GroELS,ect.
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定(共14张PPT)
而增加
原理
蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分
子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用增强， 因而溶解度增加
盐析的影响因素
➢蛋白质的种类：
分子量越大，沉淀所需盐的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）
蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀
➢温度：
高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水沉淀 低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范
常为凝胶柱床体积的1%-10% ➢洗脱速度要恒定
➢实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，
严禁将凝胶丢弃或倒入水池中
实验三脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1.硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋 白质形成沉淀。
➢从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀 ➢实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(硫酸铵溶液)
➢SephadexG-25：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300µm，筛 孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子
从内水体积流出。
实验一卵清球蛋白的盐析分离
0.7ml卵清+0.7ml饱和硫酸铵溶液（每组2个EP管）
混合均匀（避免产生气泡）
静置3-5分钟，蛋白质析出
3000rห้องสมุดไป่ตู้m，离心3分钟 用移液枪去除上清（含卵清白蛋白）
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定
➢材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
➢前处理及裂解细胞（匀浆器、研钵、超声波、反复冻融、
酶解等） ➢蛋白质粗分级分离（水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂、
盐析、有机溶剂分级分离、等电点分离）
原理
蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分
子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用增强， 因而溶解度增加
盐析的影响因素
➢蛋白质的种类：
分子量越大，沉淀所需盐的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）
蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀
➢温度：
高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水沉淀 低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范
常为凝胶柱床体积的1%-10% ➢洗脱速度要恒定
➢实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，
严禁将凝胶丢弃或倒入水池中
实验三脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1.硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋 白质形成沉淀。
➢从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀 ➢实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(硫酸铵溶液)
➢SephadexG-25：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300µm，筛 孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子
从内水体积流出。
实验一卵清球蛋白的盐析分离
0.7ml卵清+0.7ml饱和硫酸铵溶液（每组2个EP管）
混合均匀（避免产生气泡）
静置3-5分钟，蛋白质析出
3000rห้องสมุดไป่ตู้m，离心3分钟 用移液枪去除上清（含卵清白蛋白）
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定
➢材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
➢前处理及裂解细胞（匀浆器、研钵、超声波、反复冻融、
酶解等） ➢蛋白质粗分级分离（水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂、
盐析、有机溶剂分级分离、等电点分离）
基因工程重组蛋白的分离纯化放映课件
• 包括允许杂质种类和最大允许含量，特殊 杂质种类和最大允许量。
• 以及杂质对使用的影响、产品剂型、贮存 稳定性等。
基因工程重组蛋白的分离纯化放映
8
三．蛋白质分离纯化应遵顺的原则
①具有良好的稳定性和重复性。尽量不变或少受发酵工艺、条件及原材料来源的影响， 使产品规格统一。必须明确严格控制的步骤和技术，以及允许的变化范围。
基因工程重组蛋白的分离纯化
生物工程下游技术 第七组 马夕尧
基因工程重组蛋白的分离纯化放映
1
仍 有 很 大 差 距 。
质 纯 化 处 理 与 先 进
国 家
相 比
，
但 “ 下 游 ” 技 术 ，
尤 其
是 蛋
白
“ 上 游 ” 已 与 国 外
差 距
缩 小
，
过 多 年 的 努 力 ， 我 国 基 因 工 程
• 非机械破碎法包括酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击 法。酶溶法就是利用生物酶将细胞壁和细胞膜溶解的方法。常用 的酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖昔酶、肤链内 切酶、壳多糖酶等。溶菌酶对细菌类作用效果好，其他酶对酵母 作用效果好。利用酶溶法处理细胞时必须根据细胞的结构和化学 组成选择合适的酶.并确定相应的使用次序，控制好温度、pH值和 酶量。化学渗透法利用一些有机溶剂(苯、甲苯)等可以改变细胞壁 或细胞膜的通透性，从而使内含目的产物有选择地渗透出来。
点对比
基因工程重组蛋白的分离纯化放映
3
一．获得基因工程产品的特点
⑴ 目的产物在初始物料中含量低，而且往往在细胞内。含目的产物 的初始物料组成复杂，除了目的产物外，还含有大量的细胞、代 谢物、残留培养基、无机盐等，特别是产物降解酶、产物类似物 等对目的产物的分离影响很大。
• 以及杂质对使用的影响、产品剂型、贮存 稳定性等。
基因工程重组蛋白的分离纯化放映
8
三．蛋白质分离纯化应遵顺的原则
①具有良好的稳定性和重复性。尽量不变或少受发酵工艺、条件及原材料来源的影响， 使产品规格统一。必须明确严格控制的步骤和技术，以及允许的变化范围。
基因工程重组蛋白的分离纯化
生物工程下游技术 第七组 马夕尧
基因工程重组蛋白的分离纯化放映
1
仍 有 很 大 差 距 。
质 纯 化 处 理 与 先 进
国 家
相 比
，
但 “ 下 游 ” 技 术 ，
尤 其
是 蛋
白
“ 上 游 ” 已 与 国 外
差 距
缩 小
，
过 多 年 的 努 力 ， 我 国 基 因 工 程
• 非机械破碎法包括酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击 法。酶溶法就是利用生物酶将细胞壁和细胞膜溶解的方法。常用 的酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖昔酶、肤链内 切酶、壳多糖酶等。溶菌酶对细菌类作用效果好，其他酶对酵母 作用效果好。利用酶溶法处理细胞时必须根据细胞的结构和化学 组成选择合适的酶.并确定相应的使用次序，控制好温度、pH值和 酶量。化学渗透法利用一些有机溶剂(苯、甲苯)等可以改变细胞壁 或细胞膜的通透性，从而使内含目的产物有选择地渗透出来。
点对比
基因工程重组蛋白的分离纯化放映
3
一．获得基因工程产品的特点
⑴ 目的产物在初始物料中含量低，而且往往在细胞内。含目的产物 的初始物料组成复杂，除了目的产物外，还含有大量的细胞、代 谢物、残留培养基、无机盐等，特别是产物降解酶、产物类似物 等对目的产物的分离影响很大。
《蛋白质分离、纯化》PPT课件
聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP）
整理ppt
15
带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
16
凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
整理ppt
43
蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
整理ppt
44
• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
整理ppt
12
一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
整理ppt
13
凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
整理ppt
15
带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
16
凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
整理ppt
43
蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
整理ppt
44
• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
整理ppt
12
一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
整理ppt
13
凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
蛋白质的分离与纯课件
蛋白质的分离与纯化
纯化目的: 研究其结构、组成、性质和功能等。 纯化方法的依据：蛋白质的基本性质
1）溶解性：盐析等。 2）分子大小和形状：凝胶过滤（分子筛过滤）， 透析，超离心，超滤等。 3）电荷（酸碱性质）：电泳，离子交换层析，等 电聚焦等。 4）吸附性质：吸附层析，疏水互作层析。 5）特异结合亲和性：亲和层析。
• 有的方法利用了蛋白质几个方面的性质。 • 一般要连续采用多种方法才能达到纯化的目的。
Selection of protein source 蛋白质原料的 选择
• 选含“目的”蛋白多的原料。 • 选来源广、容易得到的原料。 • 用重组DNA技术（recombinant DNA technique）
（二）有机溶剂沉淀蛋白质：
• 凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，
如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀 蛋白质。
• 沉淀原理是：① 脱水作用；② 使水的
介电常数降低，蛋白质溶解度降低。
• 为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，
有机溶剂浓度不能太高(30%-50%)，而且
需要在低温条件下进行。
（三）层析：
反过来可根据某物质的Ve或Ve/V0推测出其分子 量。
1）制作标准曲线 2）待测样品过柱或 与标准物质混合过柱。
测定其Ve和V0值。 查标准曲线。
Ion exchange chromatography 离子交换层析（2）
• 基本原理： 根据物质的电离性质进行交换，然后用 适当的洗脱液进行洗脱。由于各种被分离的物质离 子的净电荷量不同，与载体上与可解离基团的结合 力大小不同，所以被先后洗脱下来。
SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰凝胶电泳（1）
• SDS-PAGE ：利用SDS处理蛋白质后，在变性条件下进 行的聚丙烯酰凝胶电泳。即“变性”电泳。
纯化目的: 研究其结构、组成、性质和功能等。 纯化方法的依据：蛋白质的基本性质
1）溶解性：盐析等。 2）分子大小和形状：凝胶过滤（分子筛过滤）， 透析，超离心，超滤等。 3）电荷（酸碱性质）：电泳，离子交换层析，等 电聚焦等。 4）吸附性质：吸附层析，疏水互作层析。 5）特异结合亲和性：亲和层析。
• 有的方法利用了蛋白质几个方面的性质。 • 一般要连续采用多种方法才能达到纯化的目的。
Selection of protein source 蛋白质原料的 选择
• 选含“目的”蛋白多的原料。 • 选来源广、容易得到的原料。 • 用重组DNA技术（recombinant DNA technique）
（二）有机溶剂沉淀蛋白质：
• 凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，
如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀 蛋白质。
• 沉淀原理是：① 脱水作用；② 使水的
介电常数降低，蛋白质溶解度降低。
• 为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，
有机溶剂浓度不能太高(30%-50%)，而且
需要在低温条件下进行。
（三）层析：
反过来可根据某物质的Ve或Ve/V0推测出其分子 量。
1）制作标准曲线 2）待测样品过柱或 与标准物质混合过柱。
测定其Ve和V0值。 查标准曲线。
Ion exchange chromatography 离子交换层析（2）
• 基本原理： 根据物质的电离性质进行交换，然后用 适当的洗脱液进行洗脱。由于各种被分离的物质离 子的净电荷量不同，与载体上与可解离基团的结合 力大小不同，所以被先后洗脱下来。
SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰凝胶电泳（1）
• SDS-PAGE ：利用SDS处理蛋白质后，在变性条件下进 行的聚丙烯酰凝胶电泳。即“变性”电泳。
蛋白质的分离与纯化技术(2007-2008).ppt
除盐的方法：常用的是透析，此外也可用葡萄糖凝胶G-25或
G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
2020/12/22
28
等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力 最小，因而溶解度也最小。
各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节 溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉 淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结 合用。
因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低，蛋白质分子 表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了 蛋白质分子的聚集和沉淀。
有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐析相似， 与蛋白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚集而沉淀。
2020/12/22
31
(3) 细分级分离 (fine fractionation)
2020/12/22
18
如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞 核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等，则可利用 差速离心方法将它们分开
如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞
器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构
解聚，然后用适当的介质提取。
2020/12/22
19
细胞破碎方法总结
2020/12/22
蛋白质的分离与纯化技术(20072纯化的目的 二． 蛋白质分离纯化的依据（蛋白质的特
性） 三． 蛋白质稳定存在的影响因素 四． 蛋白质分离纯化的一般程序 五． 蛋白质的分离纯化方法 六． 浓缩、干燥及保存
2020/12/22
2
一、蛋白质分离纯化的目的
研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理
2020/12/22
4
蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分 子中保留着游离的末端α—氨基和α—羧 基以及侧链上的各种功能团。蛋白质也 是一类两性电解质，能和酸或碱发生作 用。可解离基团主要来自侧链上的功能 团。
G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
2020/12/22
28
等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力 最小，因而溶解度也最小。
各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节 溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉 淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结 合用。
因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低，蛋白质分子 表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了 蛋白质分子的聚集和沉淀。
有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐析相似， 与蛋白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚集而沉淀。
2020/12/22
31
(3) 细分级分离 (fine fractionation)
2020/12/22
18
如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞 核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等，则可利用 差速离心方法将它们分开
如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞
器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构
解聚，然后用适当的介质提取。
2020/12/22
19
细胞破碎方法总结
2020/12/22
蛋白质的分离与纯化技术(20072纯化的目的 二． 蛋白质分离纯化的依据（蛋白质的特
性） 三． 蛋白质稳定存在的影响因素 四． 蛋白质分离纯化的一般程序 五． 蛋白质的分离纯化方法 六． 浓缩、干燥及保存
2020/12/22
2
一、蛋白质分离纯化的目的
研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理
2020/12/22
4
蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分 子中保留着游离的末端α—氨基和α—羧 基以及侧链上的各种功能团。蛋白质也 是一类两性电解质，能和酸或碱发生作 用。可解离基团主要来自侧链上的功能 团。
重组蛋白的分离纯化PPT课件
• Moreover , gel filtration is more generic, can be performed in any buffer condition, and can be used to resolve the oligomerization state of the target protein.
重组蛋白的分离纯化
.
1
基因表达体系
1. 原核体系 2. 真核体系
.
2
大肠杆菌 (Escherichia coli)
遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品 化表达载体种类齐全，表达效率高；
基本不分泌，易形成包含体(无正确折叠的 立体结构)，无加糖等修饰
.
3
枯草杆菌 (Bacillus subtilis)
the fraction of the recombinant protein that is extracted while minimizing protein oxidation, unwanted proteolysis and sample contamination with genomic DNA.
+-
---+---------+---
- ++
+
-
.
29
equilibration
anion exchanger bead
+-
++-- +++- --
.
30
sample application and wash
--
-
+- ++-+
++
《蛋白质分离纯化》PPT课件
选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的 配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价连 接。将这种连接有配基的载体装入层析柱中。
当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋 白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱 上，而其它蛋白质那么流出柱外。被特异性结合 在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液 洗脱。
发生改变时，蛋白质会发生沉淀作用 (Precipitation)。
的 纯 化
因为蛋白质分子量大小不同、外表所代 电荷不同、外表的亲水和疏水区域不同，
方 所以可以通过可逆沉淀法将蛋白质别离
法 出来。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
沉淀法具有局部纯化、浓缩特点。
盐析
蛋 白
蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水 化层被破坏和外表电荷被中和，容易发生
五、 蛋白质含量的测定
定氮法：灵敏度较低 双羧脲法：样品量0.2-1.7mg/L Folin-Lowry法：在碱性条件下磷钼酸、磷
钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反响，生成 蓝色化合物，将其与双羧脲法结合起来，蛋白 质形成两种颜色的混合物老绿色，在650nm 具有特定的吸收。灵敏度较高25g250g/ml.
6000转/分 2-3万转/分 3万转/分
2．沉降系数〔S〕概念
沉降系数〔S〕
生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉 降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从 静止状态到达极限速度所需要的时间。其单位用 Svedberg，即S表示，S=1×10-13秒。
沉降系数〔S〕与分子量〔M〕的关系 Svederg方程: M = RTS D(1-)
中移动的速度〔v〕取决于电场强度(E)，所带
的净电荷(q)以及与介质的摩擦系数(f)。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋 白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱 上，而其它蛋白质那么流出柱外。被特异性结合 在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液 洗脱。
发生改变时，蛋白质会发生沉淀作用 (Precipitation)。
的 纯 化
因为蛋白质分子量大小不同、外表所代 电荷不同、外表的亲水和疏水区域不同，
方 所以可以通过可逆沉淀法将蛋白质别离
法 出来。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
沉淀法具有局部纯化、浓缩特点。
盐析
蛋 白
蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水 化层被破坏和外表电荷被中和，容易发生
五、 蛋白质含量的测定
定氮法：灵敏度较低 双羧脲法：样品量0.2-1.7mg/L Folin-Lowry法：在碱性条件下磷钼酸、磷
钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反响，生成 蓝色化合物，将其与双羧脲法结合起来，蛋白 质形成两种颜色的混合物老绿色，在650nm 具有特定的吸收。灵敏度较高25g250g/ml.
6000转/分 2-3万转/分 3万转/分
2．沉降系数〔S〕概念
沉降系数〔S〕
生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉 降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从 静止状态到达极限速度所需要的时间。其单位用 Svedberg，即S表示，S=1×10-13秒。
沉降系数〔S〕与分子量〔M〕的关系 Svederg方程: M = RTS D(1-)
中移动的速度〔v〕取决于电场强度(E)，所带
的净电荷(q)以及与介质的摩擦系数(f)。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
重组蛋白质药物纯化工艺验证PPT
怎么进行工艺验证？
7. 确定测试项目
一般是以加强的方式，测试更密集 应至少涵盖将来例行检测项目 可接受的标准必须是：
– 清晰明了 – 可操作性强 – 条理清楚 – 相关性强
怎么进行工艺验证？
8. 确定取样计划
• 取样地点（生产现场、层流保护） • 取样方式（吸取、倒出） • 取样工具（注射器、移液枪、洁净要求） • 承装容器（EP管、离心管、洁净要求） • 样品数目（多少毫升或什么规格多少支） • 样品标签（样品编号、取样时间、取样人等） • 样品储存（温度、有效期）
色谱介质的填充效果会影响其性能。应确认色谱介质填充效果的批次 间一致性。常用测折合塔板高度和峰对称因子来确认填充效果。
层析工艺验证
• 特性：
色谱工艺通常采用前验证和同步验证相结合的方式。 缩小比例模式是前验证经常采用的一种很经济有效的方法。例如，工
艺特性、清除研究、介质寿命研究、清洁研究一般采用缩小比例模式 。根据《Process Validation in Manufacturing of Biopharmaceuticals》，缩小比例范围可从1:100到1:100,000。小规 模研究的产品保留时间、缓冲液质量、缓冲液pH或离子强度、层析介 质、温度应与大规模生产保持一致。
第一百四十八条 确认或验证应当按照预先确定和批准的方案实施， 并有记录。确认或验证工作完成后，应当写出报告，并经审核、批准 。确认或验证的结果和结论（包括评价和建议）应当有记录并存档。
第一百四十九条 应当根据验证的结果确认工艺规程和操作规程。
为什么要进行工艺验证？
• 隐性但巨大的商业效益：
• 生产、检验中的所有偏差都应记录并彻底调查。查出偏差发生的根本 原因并采取补救措施后，才能继续或重新开始验证。工艺原因导致的 验证失败，应在整改完成后重新验证。偶然发生的偏差，如设备故障 或人员误操作，可以继续进行验证。
蛋白质纯化技术PPT幻灯片课件
超速离心法 (ultracentrifugation)：~60万 g ， 6万~8万 r/min。可用来测定蛋白质分子 量。
16
• 超速离心
17
1.2分子形状
• 形状
▫ 蛋白质在离心通过溶液时，或通过膜、凝 胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中时，都会受 到分子形状的影响。
• 方法
▫ 梯度离心 ▫ 电泳
1
蛋白质的分离纯化与鉴定
Isolation, Purification and Identification of Protein
2
分子生物学圣经—分子克隆实验指南
3
为什么要纯化蛋白质？
蛋白质是生命功能的执行者
• 理论意义：深入研究某种蛋白质的功能 以及作用机制，如信号通路中的蛋白 质…
• 应用价值---蛋白质工程 医药、工业、科研… 作为药物靶点…
25
2. 分离方法
在实验操作上，分为： •沉淀法 •离心法 •电泳法 •超滤法 •相分配法 •层析法
26
27
•Note
*不可能有一套统一的方法适用于分离纯 化所有的蛋白质，
*但每一种蛋白质可能都有一套适合的分 离纯化程序，
*而且所用的主要技术手段都基本相同。
28
二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤
23
1.6吸附性质
• 原理 蛋白质可吸附在不同材料的表面，如金属、 陶瓷、塑料等。
• 方法
▫ 疏水层析
24
1.7变性和复性
• 原理
▫ 变性：蛋白质在一定的理化条件下会失去原有 的空间结构、生物学功能及部分理化特性。
▫ 复性：当变性条件去除后恢复原有的空间结构 及生物学功能。
• 方法
▫ 如，利用尿素的变性和复性方法，从包涵体中 纯化原核表达蛋白
16
• 超速离心
17
1.2分子形状
• 形状
▫ 蛋白质在离心通过溶液时，或通过膜、凝 胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中时，都会受 到分子形状的影响。
• 方法
▫ 梯度离心 ▫ 电泳
1
蛋白质的分离纯化与鉴定
Isolation, Purification and Identification of Protein
2
分子生物学圣经—分子克隆实验指南
3
为什么要纯化蛋白质？
蛋白质是生命功能的执行者
• 理论意义：深入研究某种蛋白质的功能 以及作用机制，如信号通路中的蛋白 质…
• 应用价值---蛋白质工程 医药、工业、科研… 作为药物靶点…
25
2. 分离方法
在实验操作上，分为： •沉淀法 •离心法 •电泳法 •超滤法 •相分配法 •层析法
26
27
•Note
*不可能有一套统一的方法适用于分离纯 化所有的蛋白质，
*但每一种蛋白质可能都有一套适合的分 离纯化程序，
*而且所用的主要技术手段都基本相同。
28
二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤
23
1.6吸附性质
• 原理 蛋白质可吸附在不同材料的表面，如金属、 陶瓷、塑料等。
• 方法
▫ 疏水层析
24
1.7变性和复性
• 原理
▫ 变性：蛋白质在一定的理化条件下会失去原有 的空间结构、生物学功能及部分理化特性。
▫ 复性：当变性条件去除后恢复原有的空间结构 及生物学功能。
• 方法
▫ 如，利用尿素的变性和复性方法，从包涵体中 纯化原核表达蛋白
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各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析 所需的盐浓度也不一样，调节混合蛋白质溶液中的 中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素
1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般 可在室温中进行。
2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最 低。
周质蛋白质浓缩
收集菌体，重溶细胞沉淀于 30mM Tris-HCl pH8.0 20%的蔗糖中。加入EDTA, pH8.0（终浓度 为1mM）。加入磁力搅拌棒，室温下缓慢搅拌10分 钟。
离心收集细胞，去除上清液。 加入预冷的5mM MgSO4 中彻底重溶沉淀，在冰上
缓慢搅拌悬液10分钟。此时周质蛋白被释放入缓 冲液中。 收集上清以备活性分析
注意： 处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。、 超声破碎细菌一般不宜超过10分钟，溶液变澄清即可停止破碎
蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐 浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此
称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不 同程度下降并先后析出，这种现象称盐析。
蛋白质技术专题
重组蛋白分离与纯化技术
Mcstone
重组蛋白的富集
原核表达（pET载体）
诱导时间 诱导体积（溶氧量） 温度 IPTG用量 转速
酵母表达
温度 时间
分泌蛋白质浓缩
指溶质 从半透 膜的一 侧透过淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可 使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐 析高，但易导致蛋白质变性，应在低温下进行。
蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常 数。
蛋白质分离纯化的目的
研究蛋白质的生物功能，需要纯品保持它的天然构 相。 研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理化学性 质，需要纯化的蛋白质样品。 制药工业中，需要把某种特殊功能的蛋白质提纯到 规定的要求，特别是要把干扰或拮抗性质的成分除 去。 蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度(purity)或比 活(specific activity)，以增加单位蛋白质重量中所要 蛋白质的含量或生物活性
原理：凝胶过滤层析是根据蛋白质分子大小 不同而达到分离效果的；
应用： 1、分子量测定 2、去除低分子量的杂质 3、分离目的蛋白 4、更换蛋白质的缓冲液
凝胶过滤层析过程示意图
亲和层析
原理：利用蛋白质与结合在介质上的配基间 的特异亲和力，纯化蛋白质。 特点：选择性强，纯化效率高。 配基种类，如：肽、抗体、底物、核酸、凝 集素、燃料等。
有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐 析相似，与蛋白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚 集而沉淀。
注意： 对酶活性的影响，蛋白重溶性
其他浓缩方法
TCA沉淀法 冷冻干燥法 PEG（6000-12000）浓缩法
总结：蛋白质分离纯化技术策略
针对我们的研究目的不同，合理选择蛋白质分离纯 化技术、方法。
一种方法往往不能够很好地获得目的蛋白质，常常 结合两种分离方法，更能够获得较理想的目的蛋白。
分离蛋白质关键技术：主要是要有一个较好的检测 手段，(灵敏、快速、简便和宜操作)
阴离子纯化条件优化
疏水层析
原理
利用样品与介质疏水性大小进行分离，样品不必脱 盐。
洗脱： 盐浓度高，疏水弱的蛋白先流出 盐浓度低，疏水强的蛋白后流出
凝胶过滤层析
亲和层析示意图
电泳
蛋白质电泳分离原理：分子大小不同的蛋白 质所带电种类不同，净电荷密度不同，迁移 率不同，因此，在电泳时可以分开。
SDS-PAGE电泳 PAGE电泳 等电聚焦凝胶电泳 双向电泳 毛细管电泳
层析因固相介质不同又分为离子交换层析、 疏水层析、分子筛层析和亲和层析等各种层 析。
纯化流程
离子交换层析
原理：等电点。同等电聚焦电泳一样，离子交换层析利用不 同蛋白质表面电荷性质的不同达到分离、纯化蛋白质的目的。 当pI < pH时，蛋白质带净负电荷；而当 pI > pH时，蛋白 质带净正电荷。 离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维 素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE纤维素） 在pH值中性的溶液中，暴露的精氨酸、组氨酸、赖氨酸残基 带正电荷，天冬氨酸和谷氨酸残基带负电荷 最佳溶液pH值一般与蛋白质的等电点相差一个单位。此时蛋 白质带有的电荷既利于蛋白质与离子交换柱结合，又利于洗 脱，不至于用离子强度太大的洗脱液洗脱。
胞内蛋白质浓缩
超声波处理法
用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破 裂，从而释放胞内蛋白。
1. 离心收集菌体，用灭菌水冲洗1-2次，混悬在少两倍体积的缓 冲液中。
2. 将超声探头没入混悬液内，探头位于缓冲液1/3处（整个过程 中探头要保持于混悬液表面），样品放在冰内，以保持低 温。
蛋白质分离纯化的依据
1.酸碱性质（带电性质） 2.分子的大小和形状 3.溶解度 4.吸附性质 5.对配体分子的特异生物学亲和力
层析原理
层析也称之色谱，基本原理是分析样品作为 流动相流过固相时，由于样品中的各个成分 与固相相互作用不同使得样品中的各个成分 通过固相的速率产生了差别，从而达到分离 样品中各个成分的目的。
超滤技术
膜滤法，也有错流过滤（Cross Filtration）之称。基 本原理是在常温下以一定压力和流量，利用不对称微孔结构 和半透膜介质，依靠膜两侧的压力差作为推动力，以错流方 式进行过滤，使溶剂及小分子物质通过，大分子物质阻留
中空纤维 膜包 超滤管
注意：截留水平温度，流速，无菌措施
3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂 着其他蛋白质一起沉淀出来，即共沉淀现象。因此在盐析前 蛋白质样品要加适量缓冲液稀释，使蛋白质含量在适当的范 围，如2.5-3.0%。
除盐的方法：常用的是透析，此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
影响盐析的因素
1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般 可在室温中进行。
2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最 低。
周质蛋白质浓缩
收集菌体，重溶细胞沉淀于 30mM Tris-HCl pH8.0 20%的蔗糖中。加入EDTA, pH8.0（终浓度 为1mM）。加入磁力搅拌棒，室温下缓慢搅拌10分 钟。
离心收集细胞，去除上清液。 加入预冷的5mM MgSO4 中彻底重溶沉淀，在冰上
缓慢搅拌悬液10分钟。此时周质蛋白被释放入缓 冲液中。 收集上清以备活性分析
注意： 处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。、 超声破碎细菌一般不宜超过10分钟，溶液变澄清即可停止破碎
蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐 浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此
称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不 同程度下降并先后析出，这种现象称盐析。
蛋白质技术专题
重组蛋白分离与纯化技术
Mcstone
重组蛋白的富集
原核表达（pET载体）
诱导时间 诱导体积（溶氧量） 温度 IPTG用量 转速
酵母表达
温度 时间
分泌蛋白质浓缩
指溶质 从半透 膜的一 侧透过淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可 使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐 析高，但易导致蛋白质变性，应在低温下进行。
蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常 数。
蛋白质分离纯化的目的
研究蛋白质的生物功能，需要纯品保持它的天然构 相。 研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理化学性 质，需要纯化的蛋白质样品。 制药工业中，需要把某种特殊功能的蛋白质提纯到 规定的要求，特别是要把干扰或拮抗性质的成分除 去。 蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度(purity)或比 活(specific activity)，以增加单位蛋白质重量中所要 蛋白质的含量或生物活性
原理：凝胶过滤层析是根据蛋白质分子大小 不同而达到分离效果的；
应用： 1、分子量测定 2、去除低分子量的杂质 3、分离目的蛋白 4、更换蛋白质的缓冲液
凝胶过滤层析过程示意图
亲和层析
原理：利用蛋白质与结合在介质上的配基间 的特异亲和力，纯化蛋白质。 特点：选择性强，纯化效率高。 配基种类，如：肽、抗体、底物、核酸、凝 集素、燃料等。
有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐 析相似，与蛋白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚 集而沉淀。
注意： 对酶活性的影响，蛋白重溶性
其他浓缩方法
TCA沉淀法 冷冻干燥法 PEG（6000-12000）浓缩法
总结：蛋白质分离纯化技术策略
针对我们的研究目的不同，合理选择蛋白质分离纯 化技术、方法。
一种方法往往不能够很好地获得目的蛋白质，常常 结合两种分离方法，更能够获得较理想的目的蛋白。
分离蛋白质关键技术：主要是要有一个较好的检测 手段，(灵敏、快速、简便和宜操作)
阴离子纯化条件优化
疏水层析
原理
利用样品与介质疏水性大小进行分离，样品不必脱 盐。
洗脱： 盐浓度高，疏水弱的蛋白先流出 盐浓度低，疏水强的蛋白后流出
凝胶过滤层析
亲和层析示意图
电泳
蛋白质电泳分离原理：分子大小不同的蛋白 质所带电种类不同，净电荷密度不同，迁移 率不同，因此，在电泳时可以分开。
SDS-PAGE电泳 PAGE电泳 等电聚焦凝胶电泳 双向电泳 毛细管电泳
层析因固相介质不同又分为离子交换层析、 疏水层析、分子筛层析和亲和层析等各种层 析。
纯化流程
离子交换层析
原理：等电点。同等电聚焦电泳一样，离子交换层析利用不 同蛋白质表面电荷性质的不同达到分离、纯化蛋白质的目的。 当pI < pH时，蛋白质带净负电荷；而当 pI > pH时，蛋白 质带净正电荷。 离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维 素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE纤维素） 在pH值中性的溶液中，暴露的精氨酸、组氨酸、赖氨酸残基 带正电荷，天冬氨酸和谷氨酸残基带负电荷 最佳溶液pH值一般与蛋白质的等电点相差一个单位。此时蛋 白质带有的电荷既利于蛋白质与离子交换柱结合，又利于洗 脱，不至于用离子强度太大的洗脱液洗脱。
胞内蛋白质浓缩
超声波处理法
用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破 裂，从而释放胞内蛋白。
1. 离心收集菌体，用灭菌水冲洗1-2次，混悬在少两倍体积的缓 冲液中。
2. 将超声探头没入混悬液内，探头位于缓冲液1/3处（整个过程 中探头要保持于混悬液表面），样品放在冰内，以保持低 温。
蛋白质分离纯化的依据
1.酸碱性质（带电性质） 2.分子的大小和形状 3.溶解度 4.吸附性质 5.对配体分子的特异生物学亲和力
层析原理
层析也称之色谱，基本原理是分析样品作为 流动相流过固相时，由于样品中的各个成分 与固相相互作用不同使得样品中的各个成分 通过固相的速率产生了差别，从而达到分离 样品中各个成分的目的。
超滤技术
膜滤法，也有错流过滤（Cross Filtration）之称。基 本原理是在常温下以一定压力和流量，利用不对称微孔结构 和半透膜介质，依靠膜两侧的压力差作为推动力，以错流方 式进行过滤，使溶剂及小分子物质通过，大分子物质阻留
中空纤维 膜包 超滤管
注意：截留水平温度，流速，无菌措施
3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂 着其他蛋白质一起沉淀出来，即共沉淀现象。因此在盐析前 蛋白质样品要加适量缓冲液稀释，使蛋白质含量在适当的范 围，如2.5-3.0%。
除盐的方法：常用的是透析，此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。