重组蛋白分离与纯化技术 ppt!!!
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超滤技术
膜滤法，也有错流过滤（Cross Filtration）之称。基 本原理是在常温下以一定压力和流量，利用不对称微孔结构 和半透膜介质，依靠膜两侧的压力差作为推动力，以错流方 式进行过滤，使溶剂及小分子物质通过，大分子物质阻留
中空纤维 膜包 超滤管
注意：截留水平温度，流速，无菌措施
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亲和层析示意图
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电泳
蛋白质电泳分离原理：分子大小不同的蛋白 质所带电种类不同，净电荷密度不同，迁移 率不同，因此，在电泳时可以分开。
SDS-PAGE电泳 PAGE电泳 等电聚焦凝胶电泳 双向电泳 毛细管电泳
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原理：凝胶过滤层析是根据蛋白质分子大小 不同而达到分离效果的；
应用： 1、分子量测定 2、去除低分子量的杂质 3、分离目的蛋白 4、更换蛋白质的缓冲液
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凝胶过滤层析过程示意图
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亲和层析
原理：利用蛋白质与结合在介质上的配基间 的特异亲和力，纯化蛋白质。 特点：选择性强，纯化效率高。 配基种类，如：肽、抗体、底物、核酸、凝 集素、燃料等。
周质蛋白质浓缩
收集菌体，重溶细胞沉淀于 30mM Tris-HCl pH8.0 20%的蔗糖中。加入EDTA, pH8.0（终浓度 为1mM）。加入磁力搅拌棒，室温下缓慢搅拌10分 钟。
离心收集细胞，去除上清液。 加入预冷的5mM MgSO4 中彻底重溶沉淀，在冰上
缓慢搅拌悬液10分钟。此时周质蛋白被释放入缓 冲液中。 收集上清以备活性分析
总结：蛋白质分离纯化技术策略
针对我们的研究目的不同，合理选择蛋白质分离纯 化技术、方法。
一种方法往往不能够很好地获得目的蛋白质，常常 结合两种分离方法，更能够获得较理想的目的蛋白。
分离蛋白质关键技术：主要是要有一个较好的检测 手段，(灵敏、快速、简便和宜操作)
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蛋白质分离纯化的目的
研究蛋白质的生物功能，需要纯品保持它的天然构 相。 研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理化学性 质，需要纯化的蛋白质样品。 制药工业中，需要把某种特殊功能的蛋白质提纯到 规定的要求，特别是要把干扰或拮抗性质的成分除 去。 蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度(purity)或比 活(specific activity)，以增加单位蛋白质重量中所要 蛋白质的含量或生物活性
层析因固相介质不同又分为离子交换层析、 疏水层析、分子筛层析和亲和层析等各种层 析。
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纯化流程
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离子交换层析
原理：等电点。同等电聚焦电泳一样，离子交换层析利用不 同蛋白质表面电荷性质的不同达到分离、纯化蛋白质的目的。 当pI < pH时，蛋白质带净负电荷；而当 pI > pH时，蛋白 质带净正电荷。 离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维 素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE纤维素） 在pH值中性的溶液中，暴露的精氨酸、组氨酸、赖氨酸残基 带正电荷，天冬氨酸和谷氨酸残基带负电荷 最佳溶液pH值一般与蛋白质的等电点相差一个单位。此时蛋 白质带有的电荷既利于蛋白质与离子交换柱结合，又利于洗 脱，不至于用离子强度太大的洗脱液洗脱。
各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析 Leabharlann Baidu需的盐浓度也不一样，调节混合蛋白质溶液中的 中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
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影响盐析的因素
1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般 可在室温中进行。
2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最 低。
3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂 着其他蛋白质一起沉淀出来，即共沉淀现象。因此在盐析前 蛋白质样品要加适量缓冲液稀释，使蛋白质含量在适当的范 围，如2.5-3.0%。
除盐的方法：常用的是透析，此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
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注意： 处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。、 超声破碎细菌一般不宜超过10分钟，溶液变澄清即可停止破碎
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蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐 浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此
称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不 同程度下降并先后析出，这种现象称盐析。
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指溶质 从半透 膜的一 侧透过 膜至另 一侧的 过程
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透析
有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可 使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐 析高，但易导致蛋白质变性，应在低温下进行。
蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常 数。
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胞内蛋白质浓缩
超声波处理法
用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破 裂，从而释放胞内蛋白。
1. 离心收集菌体，用灭菌水冲洗1-2次，混悬在少两倍体积的缓 冲液中。
2. 将超声探头没入混悬液内，探头位于缓冲液1/3处（整个过程 中探头要保持于混悬液表面），样品放在冰内，以保持低 温。
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蛋白质分离纯化的依据
1.酸碱性质（带电性质） 2.分子的大小和形状 3.溶解度 4.吸附性质 5.对配体分子的特异生物学亲和力
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层析原理
层析也称之色谱，基本原理是分析样品作为 流动相流过固相时，由于样品中的各个成分 与固相相互作用不同使得样品中的各个成分 通过固相的速率产生了差别，从而达到分离 样品中各个成分的目的。
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阴离子纯化条件优化
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疏水层析
原理
利用样品与介质疏水性大小进行分离，样品不必脱 盐。
洗脱： 盐浓度高，疏水弱的蛋白先流出 盐浓度低，疏水强的蛋白后流出
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凝胶过滤层析
有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐 析相似，与蛋白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚 集而沉淀。
注意： 对酶活性的影响，蛋白重溶性
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其他浓缩方法
TCA沉淀法 冷冻干燥法 PEG（6000-12000）浓缩法
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蛋白质技术专题
重组蛋白分离与纯化技术
Mcstone
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重组蛋白的富集
原核表达（pET载体）
诱导时间 诱导体积（溶氧量） 温度 IPTG用量 转速
酵母表达
温度 时间
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分泌蛋白质浓缩
膜滤法，也有错流过滤（Cross Filtration）之称。基 本原理是在常温下以一定压力和流量，利用不对称微孔结构 和半透膜介质，依靠膜两侧的压力差作为推动力，以错流方 式进行过滤，使溶剂及小分子物质通过，大分子物质阻留
中空纤维 膜包 超滤管
注意：截留水平温度，流速，无菌措施
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亲和层析示意图
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电泳
蛋白质电泳分离原理：分子大小不同的蛋白 质所带电种类不同，净电荷密度不同，迁移 率不同，因此，在电泳时可以分开。
SDS-PAGE电泳 PAGE电泳 等电聚焦凝胶电泳 双向电泳 毛细管电泳
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原理：凝胶过滤层析是根据蛋白质分子大小 不同而达到分离效果的；
应用： 1、分子量测定 2、去除低分子量的杂质 3、分离目的蛋白 4、更换蛋白质的缓冲液
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凝胶过滤层析过程示意图
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亲和层析
原理：利用蛋白质与结合在介质上的配基间 的特异亲和力，纯化蛋白质。 特点：选择性强，纯化效率高。 配基种类，如：肽、抗体、底物、核酸、凝 集素、燃料等。
周质蛋白质浓缩
收集菌体，重溶细胞沉淀于 30mM Tris-HCl pH8.0 20%的蔗糖中。加入EDTA, pH8.0（终浓度 为1mM）。加入磁力搅拌棒，室温下缓慢搅拌10分 钟。
离心收集细胞，去除上清液。 加入预冷的5mM MgSO4 中彻底重溶沉淀，在冰上
缓慢搅拌悬液10分钟。此时周质蛋白被释放入缓 冲液中。 收集上清以备活性分析
总结：蛋白质分离纯化技术策略
针对我们的研究目的不同，合理选择蛋白质分离纯 化技术、方法。
一种方法往往不能够很好地获得目的蛋白质，常常 结合两种分离方法，更能够获得较理想的目的蛋白。
分离蛋白质关键技术：主要是要有一个较好的检测 手段，(灵敏、快速、简便和宜操作)
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蛋白质分离纯化的目的
研究蛋白质的生物功能，需要纯品保持它的天然构 相。 研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理化学性 质，需要纯化的蛋白质样品。 制药工业中，需要把某种特殊功能的蛋白质提纯到 规定的要求，特别是要把干扰或拮抗性质的成分除 去。 蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度(purity)或比 活(specific activity)，以增加单位蛋白质重量中所要 蛋白质的含量或生物活性
层析因固相介质不同又分为离子交换层析、 疏水层析、分子筛层析和亲和层析等各种层 析。
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纯化流程
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离子交换层析
原理：等电点。同等电聚焦电泳一样，离子交换层析利用不 同蛋白质表面电荷性质的不同达到分离、纯化蛋白质的目的。 当pI < pH时，蛋白质带净负电荷；而当 pI > pH时，蛋白 质带净正电荷。 离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维 素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE纤维素） 在pH值中性的溶液中，暴露的精氨酸、组氨酸、赖氨酸残基 带正电荷，天冬氨酸和谷氨酸残基带负电荷 最佳溶液pH值一般与蛋白质的等电点相差一个单位。此时蛋 白质带有的电荷既利于蛋白质与离子交换柱结合，又利于洗 脱，不至于用离子强度太大的洗脱液洗脱。
各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析 Leabharlann Baidu需的盐浓度也不一样，调节混合蛋白质溶液中的 中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
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影响盐析的因素
1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般 可在室温中进行。
2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最 低。
3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂 着其他蛋白质一起沉淀出来，即共沉淀现象。因此在盐析前 蛋白质样品要加适量缓冲液稀释，使蛋白质含量在适当的范 围，如2.5-3.0%。
除盐的方法：常用的是透析，此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
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注意： 处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。、 超声破碎细菌一般不宜超过10分钟，溶液变澄清即可停止破碎
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蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐 浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此
称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不 同程度下降并先后析出，这种现象称盐析。
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指溶质 从半透 膜的一 侧透过 膜至另 一侧的 过程
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透析
有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可 使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐 析高，但易导致蛋白质变性，应在低温下进行。
蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常 数。
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胞内蛋白质浓缩
超声波处理法
用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破 裂，从而释放胞内蛋白。
1. 离心收集菌体，用灭菌水冲洗1-2次，混悬在少两倍体积的缓 冲液中。
2. 将超声探头没入混悬液内，探头位于缓冲液1/3处（整个过程 中探头要保持于混悬液表面），样品放在冰内，以保持低 温。
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蛋白质分离纯化的依据
1.酸碱性质（带电性质） 2.分子的大小和形状 3.溶解度 4.吸附性质 5.对配体分子的特异生物学亲和力
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层析原理
层析也称之色谱，基本原理是分析样品作为 流动相流过固相时，由于样品中的各个成分 与固相相互作用不同使得样品中的各个成分 通过固相的速率产生了差别，从而达到分离 样品中各个成分的目的。
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阴离子纯化条件优化
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疏水层析
原理
利用样品与介质疏水性大小进行分离，样品不必脱 盐。
洗脱： 盐浓度高，疏水弱的蛋白先流出 盐浓度低，疏水强的蛋白后流出
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凝胶过滤层析
有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐 析相似，与蛋白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚 集而沉淀。
注意： 对酶活性的影响，蛋白重溶性
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其他浓缩方法
TCA沉淀法 冷冻干燥法 PEG（6000-12000）浓缩法
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蛋白质技术专题
重组蛋白分离与纯化技术
Mcstone
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重组蛋白的富集
原核表达（pET载体）
诱导时间 诱导体积（溶氧量） 温度 IPTG用量 转速
酵母表达
温度 时间
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分泌蛋白质浓缩