流式细胞仪在肿瘤免疫细胞治疗的应用

图示：使用 A,B,C 组方案后 0,14,21 天测定 CIK，NK，T 细胞的 表型结果。
1
2、评价免疫治疗后患者的免疫状态
第二节 树突状细胞（DC）免疫治疗
树突状细胞 (DC) 是唯一能刺激初始 T 细胞活化的专职抗原递呈细胞，具有很强的抗原递呈功能，因此日益受到免疫治 疗的科研和临床工作者的重视。DC 来源比较广，包括骨髓、外周血、脐带血等，但该种细胞在机体内含量极低。近年来， 体外培养 DC 获得成功，为其功能及分化状态的深入研究和在肿瘤生物治疗领域中的应用创造了条件。 目前国内外比较公认鉴定 DC 主要采用 CD1a 和 CD83 分子。CD1a 是鉴定人外周血与骨髓中 DC 的最好标记，所以 采用 CD1a 阳性细胞数的多少来反映 DC 的数量 ;CD83 分子是 DC 的成熟标记，在 DC 培养早期不表达 CD83 分子，当成 熟时才表达 CD83 分子，目前研究中也主要用 CD83 分子的表达量来比较不同来源或不同细胞因子、不同培养方法获得 的 DC 的成熟度。另外，成熟 DC 表面表达丰富的有助于抗原提呈的分子，如高度表达 MHC 工、I 类分子，共刺激分子 B7.I(CD80),B7.2(CD86)，细胞间粘附分子 CD40,IC AM-1(CD54) 等。 文章： 1. The cryopreservation of high concentrated PBMC for dendritic cell (DC)-based cancer immunotherapy 本文研究比较了来源于新 鲜 PBMC 和冷冻保存的高浓度 PBMC 的未成熟和成熟的 DC 的表型和功能。使用 FC500 检测 CD14，CD80，CD83，CD86，HLA-ABC，HLA-DR。
最初是指在正常人体外周血中只占 1 ～ 5% 的 CD3+CD56+ 的 T 淋巴细胞。目前国内外制备的用于过继免疫治疗的 CIK 细胞，实际上是体外扩增出的以 CD3+CD56+、CD3+CD8+ 为主的异质性细胞群。该细胞群是在多种细胞因子如 IL-2、 IFN-γ 及某些单克隆抗体的刺激下，由从外周血、骨髓或脐血中分离出来的单个核细胞在体外培养扩增而成，具有广泛的 非 MHC 限制的极强的溶瘤活性。
C-PBMC
Fmono
Cmono
FmDC
CmDC
3
第三节 树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞免疫治疗(DC- CIK)
DC-CIK 免疫细胞治疗，是在体外分离培养外周血细胞，诱导其分化为树突状细胞（DC），再用经抗原刺激的树突状 细胞诱导 CIK 细胞产生特异性肿瘤杀伤作用的治疗技术，即 CIK 与 DC 细胞进行共同培养而成的杀伤性细胞群体（DC-CIK）。 其杀伤机制表现为直接杀伤作用和免疫效应细胞参与的间接杀伤作用 ，这对于细胞免疫功能低下的患者，尤其是白血病患 者更为适合，并且能起到清除患者体内微小残留病灶的作用。 文章： 1. DC-CIK 细胞临床制备规范化研究 张志伟，宋鑫 中国肿瘤 2011 年第 20 卷第 2 期 本文结合国内外知名实验室的制备经验，对 DC-CIK 细胞制备的技术规范进行探讨，以保证其临床应用的质量和安全。 文章指出用流式细胞仪检测 CIK 细胞免疫表 HLA-DR、CD3、CD4、CD8、CD45 和 CD56等的表达，其 CD3+CD56+ 的细 胞应 达到 20% 以上。DC 细 胞免 疫 表型 HLA-ABC、HLA-DR、CD3、CD4、CD8、CD11c、CD40、CD45、CD56、CD83、 CD80和 CD86等的表达。
流式细胞仪在肿瘤免疫细胞治疗的应用
肿瘤免疫治疗可以广义地分为非特异性和肿瘤抗原特异性两大类。非特异性的手段包括免疫检验 点阻断和非特异地激活免疫细胞；而肿瘤抗原特异性的方法主要是各种各样的肿瘤疫苗和过继免疫细胞 疗法。 过继性免疫效应细胞治疗（adoptive cell transfer therapy，ACT），是指从肿瘤患者中分离免疫活性细胞， 在体外进行扩增和功能鉴定，然后向患者转输，从而直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞。 为规范细胞治疗技术的临床应用，保证医疗质量和医疗安全，卫生部先后制定了《人体细胞治疗 研究和制剂质量控制技术指导原则》，《自体免疫细胞 (T 细胞、NK 细胞 ) 治疗技术管理规范》( 试行 )。 细胞制品的质量控制其中包括细胞总数、活性，细胞的纯度和均一性及生物学效应。 细胞表型是细胞基本生物学性质之一。在细胞生物学的研究中，细胞表型反应出细胞群均质程度、 细胞生物学功能、细胞分化程度、细胞衰老程度，是细胞产品的最为重要的质量标准。流式细胞术是 检测细胞表型的通用技术。 第一节 细胞因子介导的杀伤细胞（cytokine induced killer，CIK）疗法
=0.48 P=0.48
P=0.51 =0.51 P =0.89
P =0.49 P =0.41
CD14
CD80
CD83
CD86
HLA-ABC
HLA-DR
Cell surface marker
B
1.E+08
P=0.12 =0.12
2
Cell numberr
8.EΒιβλιοθήκη Baidu07
4.E+07
0.E+00
F-PBMC
Fmono Cmono FiDC CiDC FmDC CmDC
了
% of surface marker
A
120 100 80 60 40 20 0
P=0.89 =0.89 P=0.20 P=0.16 =0.16 P=0.44 =0.44 P P=0.34 =0.34 P P=0.44 =0.44 P=0.56 =0.56
1、流式细胞术对 CIK 培养条件的优化的应用
文章： Optimized Protocols for Generation of Cord Blood-derived Cytokine-inducedKiller/NaturalKillerCells 本文分别了解不同细胞因子组合扩增的脐血 CIK、NK 细 胞对人 K562 细胞株的杀伤活性的差异性。使用三组细胞因子 诱导脐血 CIK 和 NK 细胞的扩增，A 组：SCF,IL-2,IL-7,IL-15； B 组：SCF, FLT3 ligand,IL-2,IL-7,IL-15；C 组：IL-2,IL-7,IL-15， 通过 BeckmanCourter FC500流式细胞 仪对培养后细 胞表型 CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD3+CD56+，CD3-CD56+ 的分析， 认为 B 组方案能够同步有效的诱导脐带血 CIK 和 NK 细胞的 扩增。