植物遗传转化方法和技术课件
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《植物转基因技术》课件
转基因技术的未来发展方向和前景
研究方向
未来应加强转基因技术在提高作物抗逆性、 品质改良和功能食品研发等方面的研究，以 满足人类不断增长的需求。同时，应关注新 兴技术的应用，如基因编辑技术，以推动转 基因技术的创新发展。
应用前景
随着转基因技术的不断进步和应用领域的拓 展，未来转基因作物有望在保障粮食安全、 提高农业生产效率和改善生态环境等方面发 挥重要作用。同时，随着人们对转基因技术 认识的深入和法规体系的完善，转基因技术 的应用前景将更加广阔。
鉴定
对筛选出的阳性细胞或植 株进行遗传和表达分析， 以确定目的基因是否成功 导入并稳定遗传。
鉴定方法
包括分子生物学技术、免 疫学技术、生物化学技术 等。
转基因植物的遗传稳定性与安全性
01
02
03
04
遗传稳定性
转基因植物在繁殖过程中，目 的基因能够稳定遗传并表达的
能力。
安全性
转基因植物对人类健康、生态 环境和农业生产的潜在影响。
目的基因的验证
对获取的目的基因进行测序和功能验证，确保其正确性和可用性。
基因克隆与载体构建
基因克隆
采用限制性内切酶和连接酶等技 术，将目的基因克隆到载体上。
载体的选择
根据目的基因的特点和需求，选 择适合的载体，如质粒、病毒载
体等。
载体构建
将目的基因与载体进行重组，形 成重组质粒或重组病毒载体。
转化体的筛选与鉴定
转基因技术的法规和监管问题
法规制定
各国政府需制定完善的法规和监管体系 ，规范转基因技术的研发和应用，确保 其安全可靠。同时，需要加强国际合作 ，共同制定国际统一的转基因技术标准 。
VS
监管执行
8 园艺植物遗传转化PPT课件
8
农杆菌和基因枪转化的特点比较
1，农杆菌转化的特点： 多为单拷贝或寡拷贝转化与整合，减少了
共抑制等基因沉默现象，转基因遗传较稳 定； 不需要特殊设备，实验成本较低。
9
农杆菌和基因枪转化的特点比较
2，基因枪法转化的特点： 不受基因型限制，并且可用各种组织或细胞
作为靶材料。 操作简便。 常常是多拷贝转化和整合，因而易造成转基
21
第二节 转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
1，经过愈伤组织的受体系统 1.3，两种形式的共同特点： 1）外植体材料来源广泛； 2）适用的植物物种范围广； 3）再生植株群体变异大。
22
第二节 转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
2，不经过愈伤组织的受体系统 也称直接分化受体系统，指直接对外植体
3，外植体的类型和生理状态 只有处在细胞分裂的S期（DNA合成
期）的细胞才具有被转化的能力，这个 时期称为“转化的敏感期”。
能够进行活跃分裂的细胞组织，例如， 分生组织，形成层组织，愈伤组织等， 都是合适的转化受体组织。
31
第二节 转化的受体系统
四、影响系统转化效率的因素
4，外植体的预培养 目的是调整受体的状态，促进细胞分裂，提高
二、转化受体系统的类型和特性
1，经过愈伤组织的受体系统 1.2，两种形式的不同点
1）在用农杆菌进行转化时，前一种形式的 带菌培养的时间比较长，需要采用添加抗生素 的培养基在抑制农杆菌增殖的情况下诱导愈伤 组织的形成和增殖愈伤组织。
2）前一种形式的扩繁量较大，来自同一转 化事件的个体数目相对较多，转化体为嵌合体 的情况相对较少。
2，较高的遗传稳定性 通过遗传转化导入外源基因的目的是在保持
农杆菌和基因枪转化的特点比较
1，农杆菌转化的特点： 多为单拷贝或寡拷贝转化与整合，减少了
共抑制等基因沉默现象，转基因遗传较稳 定； 不需要特殊设备，实验成本较低。
9
农杆菌和基因枪转化的特点比较
2，基因枪法转化的特点： 不受基因型限制，并且可用各种组织或细胞
作为靶材料。 操作简便。 常常是多拷贝转化和整合，因而易造成转基
21
第二节 转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
1，经过愈伤组织的受体系统 1.3，两种形式的共同特点： 1）外植体材料来源广泛； 2）适用的植物物种范围广； 3）再生植株群体变异大。
22
第二节 转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
2，不经过愈伤组织的受体系统 也称直接分化受体系统，指直接对外植体
3，外植体的类型和生理状态 只有处在细胞分裂的S期（DNA合成
期）的细胞才具有被转化的能力，这个 时期称为“转化的敏感期”。
能够进行活跃分裂的细胞组织，例如， 分生组织，形成层组织，愈伤组织等， 都是合适的转化受体组织。
31
第二节 转化的受体系统
四、影响系统转化效率的因素
4，外植体的预培养 目的是调整受体的状态，促进细胞分裂，提高
二、转化受体系统的类型和特性
1，经过愈伤组织的受体系统 1.2，两种形式的不同点
1）在用农杆菌进行转化时，前一种形式的 带菌培养的时间比较长，需要采用添加抗生素 的培养基在抑制农杆菌增殖的情况下诱导愈伤 组织的形成和增殖愈伤组织。
2）前一种形式的扩繁量较大，来自同一转 化事件的个体数目相对较多，转化体为嵌合体 的情况相对较少。
2，较高的遗传稳定性 通过遗传转化导入外源基因的目的是在保持
植物细胞的遗传转化ppt(共73张PPT)
生根壮苗
其它方法
植物病毒感染法
花粉管通道法
电穿孔转化法 激光微束穿孔转化法
显微注射法
超声波介导转化法
多聚物介导法
浸渍法
电泳法 碳化硅纤维介导法
真空渗透法 圆球体法 等等
1.3 转基因植物的鉴定
遗传表型特征筛选 依赖于重组子结构特征分析筛选 核酸分子杂交分析 免疫化学分析检测 PCR筛选法
3.1 遗传表型特征筛选 常用的报告基因
种质资源的重要性
• 种质资源是在漫长的历史过程中, 由自然演化和人工创 造而形成的一种重要的自然资源。
• 积累了由于自然和人工引起的极其丰富的遗传变异,即
蕴藏着各种性状的遗传基因。
• 人类用以选育新品种和发展农业生产的物质基础, • 也是进行生物学研究的重要材料, 是极其宝贵的自然
财富。
• 种质保存(germplasm conservation) ： 利用天 然或人工创造的适宜环境，使个体中所含有的 遗传物质保持其遗传完整性，有高的活力，能 通过繁殖将其遗传特性传递下去。
拿大和中国。这四个国家种植了全世界 99% 的转基因作物。
• 目前，我国共批准发放7种转基因作物安全证书，分别是耐储 存番茄、抗虫棉花、改变花色矮牵牛、抗病辣椒、抗病番木 瓜、转植酸酶玉米和抗虫水稻。
• 大规模商业化生产的只有抗虫棉和抗病毒木瓜。 • 进口用作加工原料的转基因作物有大豆、玉米、棉花、油菜和
通过繁殖将其遗传特性传递下去。
分化出苗
生根壮苗
包括品种、类型、近缘种和野生种的植株、种子、无性繁殖器宫、花粉甚至单个细胞，只要具有种质并能繁殖的生物体，都能归入种质资源
之内。
这四个国家种植了全世界 99% 的转基因作物。
转基因技术——动植物转基因方法ppt(共22张PPT)
【DAWN_ZX】
•优点:不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，
不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握
。
转基因
技术
【DAWN_ZX】
动物转基因方法
原核显微注射法 胚胎干细胞介导法
逆转录病毒载体法 精子介导的基因转移
核移植转基因法
体细胞核移植法
线粒体介导法
转基因
技术
【DAWN_ZX】
动物转基因方法
原核显微注射法（最常用）
【启动子】是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因
转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 【终止子】也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。
【DAWN_ZX】
转基因技术的步骤
STEP3：将目的基因导入受体细胞
（1）导入植物细胞一般用农杆菌转化法，也可 用基因枪法或花粉管通道法。 （2）导入动物细胞一般用显微注射法。 （3）导入微生物细胞一般用感受态细胞吸收DNA 分子的方法。
转基因
技术
【DAWN_ZX】
转基因技术的步骤
STEP4：目的基因的检测和表达
1.检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因
。
方法：采用DNA分子杂交技术。 2.检测目的基因是否转录出了mRNA。
方法：采用用标记的目的基因作探针与 mRNA杂交。 3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质。
方法：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行 抗原－抗体杂交。 4. 进行个体生物学水平的鉴定。
•根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有 一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入 到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目 的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因 向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转 基因植株。 •近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中得到了广 泛应用。
木本植物的遗传转化4.7PPT课件
.
10
材料、设备及试剂
❖ 材料： ❖ 叶片 ❖ 设备及试剂： ❖ 超净工作台、离心机、振荡培养箱、试剂
瓶、培养皿、酒精灯等。 ❖ Kan、利福平(rif) 、YEB、乙醇等。
.
11
实验步骤：
（1）工程菌液的制备
（2）外植体消毒
将叶片用解剖刀切成小块，浸泡在次氯酸钠中10min，用无菌水洗3次， 每次1-2min。
（6）脱菌与选择培养 暗培养结束后的叶片，在超净工作台中转入含有头孢唑啉钠的培养基中，进 行除菌。一周后进行选择培养。
.
12
（7）诱导芽生长、生根，形成转化植株
步骤：
（1）工程菌液的制备
农杆菌的活化
.
13
挑单克隆
.
14
测OD600=0.5
.
15
收集细胞
用液体LB培养
基重悬细胞稀
释20-50倍
.
23
实验三 木本植物的 遗传转化
.
1
.
2
农杆菌
❖ 农杆菌是普遍存在于 土壤中的一种革兰氏 阴性细菌，它能在自 然条件下趋化性地感 染大多数双子叶植物 的受伤部位，并诱导 产生冠瘿瘤或发状根。
.
3
农杆菌介导法
含有Ti质粒的致癌农杆菌与一些植物的细胞接 触后，Ti质粒的一部分（T-DNA）可以导入 植物细胞，整和到植物基因组DNA随其复制。 根据这一特性可构建一系列Ti质粒载体， 与 含目的片段的DNA片段重组，导入致癌农杆 菌，再采用叶盘法、原生质体培养法、细胞 培养法，通过致癌农杆菌介导进入植物细胞。
.
16
❖ 2、外植体消毒
❖ 将叶片用解剖刀切成小块，浸泡在次氯酸钠 中10min，用无菌水洗3次，每次1-2min
植物基因转化PPT课件
C、双元载体 • 利用两个载体分别提供T-DAN区域（卸甲的）和毒性功能
第20页/共29页
克隆载体
辅助质粒
共存于同一个农杆菌中，再由 农杆菌完成目的基因向植物基 因组的转移
第21页/共29页
四、其它DNA转化植物的方法
（一）原生质体转化 （二）基因枪 （三）整株植物转化 （四）叶绿体转化
第23页/共29页
根癌农杆菌介导的遗传转化
3、载体类型
B、共整合载体（Cointegratevectors）
由两个部分组成：
一个缺失了T-DNA上的肿瘤诱导基因的Ti质粒 一个中间载体（intermediate vector）组成 （一种在普通大肠杆菌的克隆载体中插入了一段合适 的T-DNA片断，而构成的小型质粒 ）。
（二）、致瘤Ti质粒
200 kb
第5页/共29页
根癌农-250kb，以下几个功能区
• 致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素 • 冠瘿碱代谢区 • Ti 质粒转移区(tra)：参与在不同农杆菌中的接合转移 • 毒性区（Vir）：直接参与T-DNA的转移和插入植物染色体 • DNA复制区（Rep）：参与Ti 质粒DNA复制
第6页/共29页
根癌农杆菌介导的遗传转化
（三）、 T-DNA 的转化 1、T－DNA的结构 • 是Ti质粒中转移到植物细胞中的部分，内含冠瘿碱合成和植物
激素合成相关的基因 • A. tumefaciens 利用冠瘿碱作为生长的碳源 • 左和右边界
➢T-DNA的左边界和右边界是T-DNA 从Ti 质粒切开的位点 ➢边界包含25 碱基的重复元件 ➢只有右边界是转移所必须的，但在克隆载体中，均含有两个边界
第11页/共29页
根癌农杆菌介导的遗传转化
第20页/共29页
克隆载体
辅助质粒
共存于同一个农杆菌中，再由 农杆菌完成目的基因向植物基 因组的转移
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四、其它DNA转化植物的方法
（一）原生质体转化 （二）基因枪 （三）整株植物转化 （四）叶绿体转化
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根癌农杆菌介导的遗传转化
3、载体类型
B、共整合载体（Cointegratevectors）
由两个部分组成：
一个缺失了T-DNA上的肿瘤诱导基因的Ti质粒 一个中间载体（intermediate vector）组成 （一种在普通大肠杆菌的克隆载体中插入了一段合适 的T-DNA片断，而构成的小型质粒 ）。
（二）、致瘤Ti质粒
200 kb
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根癌农-250kb，以下几个功能区
• 致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素 • 冠瘿碱代谢区 • Ti 质粒转移区(tra)：参与在不同农杆菌中的接合转移 • 毒性区（Vir）：直接参与T-DNA的转移和插入植物染色体 • DNA复制区（Rep）：参与Ti 质粒DNA复制
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根癌农杆菌介导的遗传转化
（三）、 T-DNA 的转化 1、T－DNA的结构 • 是Ti质粒中转移到植物细胞中的部分，内含冠瘿碱合成和植物
激素合成相关的基因 • A. tumefaciens 利用冠瘿碱作为生长的碳源 • 左和右边界
➢T-DNA的左边界和右边界是T-DNA 从Ti 质粒切开的位点 ➢边界包含25 碱基的重复元件 ➢只有右边界是转移所必须的，但在克隆载体中，均含有两个边界
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根癌农杆菌介导的遗传转化
十章园艺植物遗传转化1ppt课件
为了抑制农杆菌的过度生长而产生污染，选择、 筛选转化的细胞核植株，在遗传转化中常使用两类 抗生素： 1）选择性抗生素：在遗传转化中用于筛选转化体，如 卡那霉素、潮霉素 2）抑菌性抗生素：在受体材料与农杆菌共培养一定时 间后用于抑制农杆菌的生长 ，防止细菌过度生长而 产生污染。这类抗生素要求对植物细胞无毒害作用 或毒害作用较小，不影响植物细胞的正常生长，如 氨苄青霉素、羧苄青霉素、头孢霉素等
第二节 园艺植物遗传转化方法
一、外源裸露DNA的转化
（一）化学诱导转化法
化学诱导DNA直接转化是以原生质体为受体，借助于特定 的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的方法。
目前用于转化细胞的化学物质有聚乙二醇（PEG）、聚鸟 氨酸、聚乙烯醇等，其中最常用的化学物质是PEG。
第二节 园艺植物遗传转化方法
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
（2）原生质体受体系统
原生质体转化受体系统的优点： a）原生质体无细胞壁，能够直接高效的摄取外源DNA或遗传 物质 b）通过原生质体培养，细胞分裂可形成基因型一致的细胞克 隆，无嵌合性愈伤组织，由其再生的转基因植株无嵌合性 c）原生质体转化受体系统易于在相对均匀和稳定的同等控制 条件下进行准确的转化和嵌合 d）适用于各种转化系统
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
(5)对农杆菌侵染的敏感性
1）农杆菌介导的 遗传转化体系需要受体材料是农杆菌的 天然寄主，否则难以实现遗传转化
2）农杆菌Ti或Ri质粒是植物遗传转化的有效载体系统，但 其宿主范围局限于部分双子叶植物，对大部分单子叶植 物和裸子植物不敏感，不同植物，同一植物的不同组织 细胞对农杆菌的敏感性也有很大差 因而，在选择农杆菌转化系统前必须测试受体系统 对农杆菌的敏感性，只有农杆菌侵染敏感的植物才能作 为受体系统
第二节 园艺植物遗传转化方法
一、外源裸露DNA的转化
（一）化学诱导转化法
化学诱导DNA直接转化是以原生质体为受体，借助于特定 的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的方法。
目前用于转化细胞的化学物质有聚乙二醇（PEG）、聚鸟 氨酸、聚乙烯醇等，其中最常用的化学物质是PEG。
第二节 园艺植物遗传转化方法
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
（2）原生质体受体系统
原生质体转化受体系统的优点： a）原生质体无细胞壁，能够直接高效的摄取外源DNA或遗传 物质 b）通过原生质体培养，细胞分裂可形成基因型一致的细胞克 隆，无嵌合性愈伤组织，由其再生的转基因植株无嵌合性 c）原生质体转化受体系统易于在相对均匀和稳定的同等控制 条件下进行准确的转化和嵌合 d）适用于各种转化系统
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
(5)对农杆菌侵染的敏感性
1）农杆菌介导的 遗传转化体系需要受体材料是农杆菌的 天然寄主，否则难以实现遗传转化
2）农杆菌Ti或Ri质粒是植物遗传转化的有效载体系统，但 其宿主范围局限于部分双子叶植物，对大部分单子叶植 物和裸子植物不敏感，不同植物，同一植物的不同组织 细胞对农杆菌的敏感性也有很大差 因而，在选择农杆菌转化系统前必须测试受体系统 对农杆菌的敏感性，只有农杆菌侵染敏感的植物才能作 为受体系统
植物细胞转基因技术幻灯片PPT
基因枪法最早是由美国康 奈尔大学的Sanford最先提出 的。它通过高速飞行的金属颗 粒将包被其外的目的基因直接 导入到受体细胞内，最后整合 到植物基因组并得以表达从而 实现基因转化的方法。1992 年，世界首例转基因小鼠就是 通过该法获得的。
吸附
装入
DNA 1.2m钨弹头 特制手枪
射击植物
优点： 抑制了受体材料的限制，不必制备原生质体。 实验操作简单易行，适合于大多数细胞或组织，具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。 缺点： 进去的DNA片段整合效率极低，遗传稳定性差，拷贝数多，不易获得再生植株。
固
➢ 定在琼脂或低熔点的琼脂糖上,或用聚赖氨酸处
理
➢ 使原生质体附着在玻璃平板上,也可以通过一固
着的毛细管将原生质体吸着在管口,再进展操作。
优点：
转化率高，特别是在没有适宜的DNA载体系统时 更有价值
对转移物质没有限制，可选择受体细胞的核的接 受位点
受体不用特殊的选择系统
可以控制转移的量和转移物的浓度
DNA直接导入法最大的优点是无需选择宿主, 可以导入生物细胞；缺点是嵌合基因整合进宿主染 色体的频率低。该方法可以分为化学物质诱导法、 电穿孔法、脂质体法、显微注射法、基因枪法、离 子束介导法和花粉管通道法。
➢基因枪法 ➢电击法 ➢花粉管通道法 ➢化学物质诱导法 ➢显微注射法 ➢脂质体法
1.基因枪法
利用此方法获得水稻、烟草、甘蓝、小麦等植物的 转基因植株。
4.化学物质诱导法
➢化学物质诱导法是以原生质体为受体,借助于特
定的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的方法。 常用的转化细胞的化学物质有PEG(聚乙二醇)、 PLO(多聚鸟氨酸)、 PVA(聚乙烯醇)等,其中PEG
吸附
装入
DNA 1.2m钨弹头 特制手枪
射击植物
优点： 抑制了受体材料的限制，不必制备原生质体。 实验操作简单易行，适合于大多数细胞或组织，具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。 缺点： 进去的DNA片段整合效率极低，遗传稳定性差，拷贝数多，不易获得再生植株。
固
➢ 定在琼脂或低熔点的琼脂糖上,或用聚赖氨酸处
理
➢ 使原生质体附着在玻璃平板上,也可以通过一固
着的毛细管将原生质体吸着在管口,再进展操作。
优点：
转化率高，特别是在没有适宜的DNA载体系统时 更有价值
对转移物质没有限制，可选择受体细胞的核的接 受位点
受体不用特殊的选择系统
可以控制转移的量和转移物的浓度
DNA直接导入法最大的优点是无需选择宿主, 可以导入生物细胞；缺点是嵌合基因整合进宿主染 色体的频率低。该方法可以分为化学物质诱导法、 电穿孔法、脂质体法、显微注射法、基因枪法、离 子束介导法和花粉管通道法。
➢基因枪法 ➢电击法 ➢花粉管通道法 ➢化学物质诱导法 ➢显微注射法 ➢脂质体法
1.基因枪法
利用此方法获得水稻、烟草、甘蓝、小麦等植物的 转基因植株。
4.化学物质诱导法
➢化学物质诱导法是以原生质体为受体,借助于特
定的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的方法。 常用的转化细胞的化学物质有PEG(聚乙二醇)、 PLO(多聚鸟氨酸)、 PVA(聚乙烯醇)等,其中PEG
遗传转化技术PPT课件
植物细胞内并不存在；B 便于检测；C 基因较小，可构成嵌合基因。 （3）真核生物启动子（基因）：用于目的基因、选择报告基因在宿主 细胞的启动表达。一般为花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子。
三 根癌农杆菌转化方法 4 根癌农杆菌转化技术程序流程
工程质粒的提取、纯化
质粒载体构建
（包括目的基因、筛选报告今音、启动子连接到Ti质粒的T-DNA序列内）
2 植物遗传转化与植物组织培养技术的关系 A 植物离体培养是植物遗传转化的最基本的操作平台： a 离体 b 微型 c 可控
B 可以用做遗传转化平台或受体的组织培养技术有： a悬浮细胞培养体系 b 原生质体培养—植株再生体系 c 愈伤组织—植株再生培养体系（包括体细胞胚） d 单倍体—植株再生培养体系 e 外植体（根、茎、叶）—直接再生体系（快繁）
You Know, The More Powerful You Will Be
谢谢你的到来
学习并没有结束，希望大家继续努力
Learning Is Not Over. I Hope You Will Continue To Work Hard
演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
（2）选择基因：主要是该基因的表达产物对给予植物细胞一种选择压 力，至使未转化植物细胞不能生长、发育和分化，淘汰掉。如抗庆大每素 基因 （Gent）；氯霉素转移酶基因（Cat基因）；抗卡那霉素基因（NPT2基因） 等抗抗生素基因。
（3）上述两种基因也统称选择报告基因。单独使用或联合使用。 必须符合两个情况：A 其表达产物或产物的类似功能在未转化的
外源目的基因、真核生物启动子、选择基因、报告基因片段
体外连接到质粒中
质粒转化进入到根癌农杆菌
感染植物外植体
三 根癌农杆菌转化方法 4 根癌农杆菌转化技术程序流程
工程质粒的提取、纯化
质粒载体构建
（包括目的基因、筛选报告今音、启动子连接到Ti质粒的T-DNA序列内）
2 植物遗传转化与植物组织培养技术的关系 A 植物离体培养是植物遗传转化的最基本的操作平台： a 离体 b 微型 c 可控
B 可以用做遗传转化平台或受体的组织培养技术有： a悬浮细胞培养体系 b 原生质体培养—植株再生体系 c 愈伤组织—植株再生培养体系（包括体细胞胚） d 单倍体—植株再生培养体系 e 外植体（根、茎、叶）—直接再生体系（快繁）
You Know, The More Powerful You Will Be
谢谢你的到来
学习并没有结束，希望大家继续努力
Learning Is Not Over. I Hope You Will Continue To Work Hard
演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
（2）选择基因：主要是该基因的表达产物对给予植物细胞一种选择压 力，至使未转化植物细胞不能生长、发育和分化，淘汰掉。如抗庆大每素 基因 （Gent）；氯霉素转移酶基因（Cat基因）；抗卡那霉素基因（NPT2基因） 等抗抗生素基因。
（3）上述两种基因也统称选择报告基因。单独使用或联合使用。 必须符合两个情况：A 其表达产物或产物的类似功能在未转化的
外源目的基因、真核生物启动子、选择基因、报告基因片段
体外连接到质粒中
质粒转化进入到根癌农杆菌
感染植物外植体
植物遗传转化方法和技术PPT课件
第35页/共56页
每外植体芽数 Shoots per explant
7 6 5 4 3 2 1 0
品种 variety
1.0mg/L 1.2mg/L 1.5mg/L 1.7mg/L 2.0mg/L
科 丰 6
科 丰 14
冀 豆 12
吉 林 35
铁 丰 29
无 腥 一 号 冀 黄 13
第36页/共56页
到目前为止，利用基因枪法已经在烟草、豆类和多数禾本科农作物、 果树花卉和林木等植物上获得转基因植株。
第41页/共56页
2、操作步骤：
（1）制备DNA微弹； （2）准备靶外植体材料； （3）DNA微弹轰击； （4）培养轰击后的外植体．
immature embryos
第42页/共56页
high osmotic media prepare calli
2.直接分化再生系统
外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而 是直接分化出不定芽形成再生植株。 优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定； 缺点：材料局限，转化率低。
第24页/共56页
3.原生质体再生系统
原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早 的再生受体系统之一。 优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因 型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多 种转化系统； 缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。
• 现将这三大类系统的载体、转化原理、转化方法和 受体细胞等归纳如图4-1。
第5页/共56页
第6页/共56页
一、根癌农杆菌介导法
• 根癌农杆菌介导法的分子机制 • 农杆菌介导法需要具备的条件 • 农杆菌介导法的基本流程
第7页/共56页
（一）根癌农杆菌介导法的分子机制
每外植体芽数 Shoots per explant
7 6 5 4 3 2 1 0
品种 variety
1.0mg/L 1.2mg/L 1.5mg/L 1.7mg/L 2.0mg/L
科 丰 6
科 丰 14
冀 豆 12
吉 林 35
铁 丰 29
无 腥 一 号 冀 黄 13
第36页/共56页
到目前为止，利用基因枪法已经在烟草、豆类和多数禾本科农作物、 果树花卉和林木等植物上获得转基因植株。
第41页/共56页
2、操作步骤：
（1）制备DNA微弹； （2）准备靶外植体材料； （3）DNA微弹轰击； （4）培养轰击后的外植体．
immature embryos
第42页/共56页
high osmotic media prepare calli
2.直接分化再生系统
外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而 是直接分化出不定芽形成再生植株。 优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定； 缺点：材料局限，转化率低。
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3.原生质体再生系统
原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早 的再生受体系统之一。 优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因 型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多 种转化系统； 缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。
• 现将这三大类系统的载体、转化原理、转化方法和 受体细胞等归纳如图4-1。
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一、根癌农杆菌介导法
• 根癌农杆菌介导法的分子机制 • 农杆菌介导法需要具备的条件 • 农杆菌介导法的基本流程
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（一）根癌农杆菌介导法的分子机制
植物遗传转化(PPT-70)
8 植PL物AN遗T传G转E化NE体T系IC的TR建A立NSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体 8.1.3 胚性愈伤组织
愈伤组织的转化方法也适用于胚性愈伤组织。胚性愈伤组织的转 化已在玉米、甘蔗、芹菜等植物上获得成功。
芹 菜 胚 性 愈 伤 组 织 用 根 癌 农 杆 菌 C58C1 (pBZ6111) 感 染 后 ， 在 MS+2,4-D 1mg/L十KT0.1mg/L培养基上继代培养。在筛选到的氯霉素 抗性愈伤组织中检测到胭脂碱合成酶活性，表明外源基因已整合到 芹菜细胞基因组中并得到表达。抗性愈伤组织可在无激素的基本培 养基上增殖，但分化出的再生植株畸形(郑世学等，1996)。
பைடு நூலகம்
8 植PL物AN遗T传G转E化NE体T系IC的TR建A立NSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体 8.1.2 悬浮细胞
以悬浮细胞作受体的转化方法包括农杆菌介导法、基因枪法、 PEG介导法、电激法和显微注射法等。
小麦幼胚悬浮细胞用JQ-700基因枪法转化，得到了GUS基因瞬间表 达的各项最适参数。他们还建立了‘冀谷11号’谷子幼穗的悬浮培 养细胞系及植株再生体系。将胚性悬浮细胞系接种到MS培养基， 20d继代1次，直至出现绿芽点；然后转入无激素的MS0或1/2 MS0 培养基分化植株。以基因枪轰击转化悬浮细胞后，放置48h，检测 GUS短暂表达频率TTF％为20％-40%；在添加200mg/L卡那霉素 的MS培养基上，有5％-10％的愈伤组织具有抗性，且能稳定传代 (董云洲等，1998)。
8 植PL物AN遗T传G转E化NE体T系IC的TR建A立NSFORMATION
8.2 植物基因转化的方法 8.2.1 农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated transformation）
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现将这三大类系统的载体、转化原理、转化方法和受 体细胞等归纳如图4-1。
一、根癌农杆菌介导法
根癌农杆菌介导法的分子机制 农杆菌介导法需要具备的条件 农杆菌介导法的基本流程
（一）根癌农杆菌介导法的分子机制
1、植物冠瘿瘤——植物的一种癌症
（1）冠瘿瘤的起因： 由根癌农杆菌对植物的侵染而引起。
5、农杆菌介导的转化质粒的构建
目的基因
报告基因，ห้องสมุดไป่ตู้择标记基因
Ampr P
G1
T
LB
P
G2
T NOS
RB
启动子的选择
35S, cauliflower mosaic virus 35S promoter
CaMV 35S is a strong promoter that is active in essentially all dicot plant tissues.
（2）Ti质粒的功能区域
– T-DNA区 – Vir 区 – Con 区 – Ori 区
200 kb
① T-DNA区（transferred-DNA regions）：
左边界 核心区 右边界
T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上 切割下来转移到植物细胞的一段DNA，故称之为 转移DNA。
该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。
② Vir区操纵子基因的结构与功能
Vir区是一段长度为35KB操纵子；
包含六个基因：VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、 VirG。
该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒 T-DNA
性，故称之为毒性区。
Vir LB
RB
T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，
该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制 起始区。
3、T-DNA转移的机制
受伤植物产生酚类物质，诱导Vir基因的表达
编码 核酸内切酶 依次在RB、LB序列中产生缺口
单链T-DNA被释放 定向转移到寄主植物细胞内
植物细胞酶体系
合成双链T-DNA链分子
VirE2蛋白的核定位作用
T-DNA链整合植物基因组
合起来约占Ti质粒DNA的三分之一。
③ Con区（regions encoding conjugations） 该区段上存在着与细菌接合转移的有关基因（tra）
，调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基 因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。 ④ Ori区（origin of replication）
4.胚状体再生系统
是指具有胚胎性质的个体。 优点：个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力强，
嵌合体少，易于培养、再生。 缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。
基因载体的选择与构建
目的基因与载体的拼接
重组子导入受体分子
重组子的检测
外源基因的表达和产物的分离
第一节 植物遗传转化方法
本节主要内容 根癌农杆菌介导法
基因枪介导法 其它转化方法
常用的植物转基因方法：
到目前为止, 已确立了11种植物转基因方法。根据其 转化原理，可分为三大类，即利用载体的转化系统， 不用任何载体，采用物理、化学方法直接将外源基因 导入受体细胞的直接转化系统以及利用植物生殖细胞 等种质媒介的种质转化系统。
4、植物遗传转化的载体系统
一元载体（顺势载体） 双元载体（反式载体）
野生型Ti质粒不能直接作为植物基因工程载体：
① Ti质粒分子量过大，一般在160～240kb； ② 分布各种限制酶的多个切点； ③ T-DNA区内含有许多编码基因，干扰宿主植物中内源
激素的平衡，转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植 株的再生； ④ Ti质粒不能在大肠杆菌中复制, 即使得到重组质粒，也 只能在农杆菌中进行扩增； ⑤ Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的 基因。
植物遗传转化方法和技术
植物基因工程是近20年来随着DNA重组技术、 植物遗传转化技术及植物组织培养技术而发展起 来的现代生物技术。
通过植物基因工程获得转基因植物，在农业生 产发展及植物分子生物学研究中有十分重要的意 义。目前，已获得很多有重大经济价值的转基因 植物。
基因工程的基本步骤
目的基因的获取
（2）冠瘿瘤的侵染过程： 细菌通过伤口进入植物，在基因水平
上转化植物。细菌DNA中的编码基因在植 物细胞中表达，刺激植物细胞不受控制的 分裂，形成瘤。
2、Ti质粒
根瘤农杆菌染色体外的遗传物质，为共价 闭合环状的DNA分子。
（1）Ti质粒的功能
① 为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力； ② 参与寄主细胞合成激素的能力； ③ 诱发植物产生冠瘿瘤； ④ 赋予寄主分解冠瘿碱的能力； ⑤ 决定寄主范围。
A. 植物基因转化受体系统的条件
（1）高效稳定的再生能力 （2）较高的遗传稳定性 （3）具有稳定的外植体来源 （4）对选择性抗生素敏感 （5）对农杆菌侵染有敏感性 （6）具有经济价值或理论研究意义。
B. 植物基因转化受体系统的类型
1.愈伤组织再生系统
外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化（含 目的基因质粒的农杆菌侵染），分化培养获得再生植株。 优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因，
（二）农杆菌介导法需要具备的条件
高效的植物基因转化受体系统 受体植物细胞对农杆菌要有很高的亲和力。 具有有效的选择系统。 稳定的转化技术和基因表达。
1、高效的植物基因转化的受体系统
• 成功的基因转化首先依赖于良好的植物受体系统 的建立。
• 受体系统：用于转化的外植体通过组织培养途径 或其它非组织培养途径（如发苗产生子叶、胚轴 等），能高效、稳定地再生无性系，并能接受外 源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系 统。
转化效率高。 缺点：遗传稳定性差、嵌合体
因此需要连续的再生系统
2.直接分化再生系统
外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而 是直接分化出不定芽形成再生植株。 优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定； 缺点：材料局限，转化率低。
3.原生质体再生系统
原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早 的再生受体系统之一。 优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因 型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多 种转化系统； 缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。
一、根癌农杆菌介导法
根癌农杆菌介导法的分子机制 农杆菌介导法需要具备的条件 农杆菌介导法的基本流程
（一）根癌农杆菌介导法的分子机制
1、植物冠瘿瘤——植物的一种癌症
（1）冠瘿瘤的起因： 由根癌农杆菌对植物的侵染而引起。
5、农杆菌介导的转化质粒的构建
目的基因
报告基因，ห้องสมุดไป่ตู้择标记基因
Ampr P
G1
T
LB
P
G2
T NOS
RB
启动子的选择
35S, cauliflower mosaic virus 35S promoter
CaMV 35S is a strong promoter that is active in essentially all dicot plant tissues.
（2）Ti质粒的功能区域
– T-DNA区 – Vir 区 – Con 区 – Ori 区
200 kb
① T-DNA区（transferred-DNA regions）：
左边界 核心区 右边界
T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上 切割下来转移到植物细胞的一段DNA，故称之为 转移DNA。
该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。
② Vir区操纵子基因的结构与功能
Vir区是一段长度为35KB操纵子；
包含六个基因：VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、 VirG。
该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒 T-DNA
性，故称之为毒性区。
Vir LB
RB
T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，
该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制 起始区。
3、T-DNA转移的机制
受伤植物产生酚类物质，诱导Vir基因的表达
编码 核酸内切酶 依次在RB、LB序列中产生缺口
单链T-DNA被释放 定向转移到寄主植物细胞内
植物细胞酶体系
合成双链T-DNA链分子
VirE2蛋白的核定位作用
T-DNA链整合植物基因组
合起来约占Ti质粒DNA的三分之一。
③ Con区（regions encoding conjugations） 该区段上存在着与细菌接合转移的有关基因（tra）
，调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基 因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。 ④ Ori区（origin of replication）
4.胚状体再生系统
是指具有胚胎性质的个体。 优点：个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力强，
嵌合体少，易于培养、再生。 缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。
基因载体的选择与构建
目的基因与载体的拼接
重组子导入受体分子
重组子的检测
外源基因的表达和产物的分离
第一节 植物遗传转化方法
本节主要内容 根癌农杆菌介导法
基因枪介导法 其它转化方法
常用的植物转基因方法：
到目前为止, 已确立了11种植物转基因方法。根据其 转化原理，可分为三大类，即利用载体的转化系统， 不用任何载体，采用物理、化学方法直接将外源基因 导入受体细胞的直接转化系统以及利用植物生殖细胞 等种质媒介的种质转化系统。
4、植物遗传转化的载体系统
一元载体（顺势载体） 双元载体（反式载体）
野生型Ti质粒不能直接作为植物基因工程载体：
① Ti质粒分子量过大，一般在160～240kb； ② 分布各种限制酶的多个切点； ③ T-DNA区内含有许多编码基因，干扰宿主植物中内源
激素的平衡，转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植 株的再生； ④ Ti质粒不能在大肠杆菌中复制, 即使得到重组质粒，也 只能在农杆菌中进行扩增； ⑤ Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的 基因。
植物遗传转化方法和技术
植物基因工程是近20年来随着DNA重组技术、 植物遗传转化技术及植物组织培养技术而发展起 来的现代生物技术。
通过植物基因工程获得转基因植物，在农业生 产发展及植物分子生物学研究中有十分重要的意 义。目前，已获得很多有重大经济价值的转基因 植物。
基因工程的基本步骤
目的基因的获取
（2）冠瘿瘤的侵染过程： 细菌通过伤口进入植物，在基因水平
上转化植物。细菌DNA中的编码基因在植 物细胞中表达，刺激植物细胞不受控制的 分裂，形成瘤。
2、Ti质粒
根瘤农杆菌染色体外的遗传物质，为共价 闭合环状的DNA分子。
（1）Ti质粒的功能
① 为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力； ② 参与寄主细胞合成激素的能力； ③ 诱发植物产生冠瘿瘤； ④ 赋予寄主分解冠瘿碱的能力； ⑤ 决定寄主范围。
A. 植物基因转化受体系统的条件
（1）高效稳定的再生能力 （2）较高的遗传稳定性 （3）具有稳定的外植体来源 （4）对选择性抗生素敏感 （5）对农杆菌侵染有敏感性 （6）具有经济价值或理论研究意义。
B. 植物基因转化受体系统的类型
1.愈伤组织再生系统
外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化（含 目的基因质粒的农杆菌侵染），分化培养获得再生植株。 优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因，
（二）农杆菌介导法需要具备的条件
高效的植物基因转化受体系统 受体植物细胞对农杆菌要有很高的亲和力。 具有有效的选择系统。 稳定的转化技术和基因表达。
1、高效的植物基因转化的受体系统
• 成功的基因转化首先依赖于良好的植物受体系统 的建立。
• 受体系统：用于转化的外植体通过组织培养途径 或其它非组织培养途径（如发苗产生子叶、胚轴 等），能高效、稳定地再生无性系，并能接受外 源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系 统。
转化效率高。 缺点：遗传稳定性差、嵌合体
因此需要连续的再生系统
2.直接分化再生系统
外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而 是直接分化出不定芽形成再生植株。 优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定； 缺点：材料局限，转化率低。
3.原生质体再生系统
原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早 的再生受体系统之一。 优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因 型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多 种转化系统； 缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。