单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用

陕西师范大学

硕士学位论文

单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用

姓名：罗明志

申请学位级别：硕士

专业：动物学

指导教师：齐浩

20050501

单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用

罗明志

摘要单细胞凝胶电泳（ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｓｉｓ，ＳＣＧＥ），又称彗星实验（ｃｏｍｅｔａｓｓａｙ），是一种在单细胞水平进行ＤＮＡ损伤的检测方法，具有简便、灵敏、快捷、样品用量小等优点，广泛用于遗传毒性检测、环境毒性检测、分子流行病学和ＤＮＡ损伤与修复等研究领域。

我们在本实验室建立了单细胞凝胶电泳技术，并对部分操作流程进行了改良，包括（１）制胶方法改良；（２）增加水洗；（３）进行梯度酒精脱水。在上述改良过程中，我们用“灌胶”法在载玻片上制胶，替代了传统的使用磨砂载玻片上“三明治”制胶，解决了彗星实验中常见的脱胶现象，脱水后有利于获得平整胶面：在裂解后增加了水洗步骤，以消除裂解液中的高盐和去垢剂对后续实验操作的影响；采用直流稳压电源进行单细胞电泳，保证了实验结果的可重复性；对染色的条件进行了筛选，确定了使用ＥＢ作为细胞ＤＮＡ的荧光染料；以ＣＡＳＰ（免费）作为彗星图像的分析软件，建立了图像分析的方法。这些实验步骤的改良以及实验流程的优化或标准化．简化了操作程序，节省了时间，并使结果分析更加简便。

为了验证上述改良后的实验系统是否可靠，我们用紫外线作为损伤因子处理细胞，诱导细胞ＤＮＡ损伤，然后用彗星实验检测这一损伤。从这～阳性模型的结果分析来看，发现细胞损伤呈现出很好的时间依赖性，表明该实验系统的可靠性。我们同时筛选并评价了彗星实验中有关的ＤＮＡ损伤分析指标，发现ＴａｉｌＬｅｎｇｔｈ，ＣｏｍｅｔＬｅｎｇｔｈ，ＴａｉｌＭｏｍｅｎｔ和ＯｌｉｖｅＴａｉｌＭｏｍｅｎｔ作为ＤＮＡ损伤的评价指标比较可靠。

我们建立了肝细胞的组织块原代培养系统。在建立肝细胞组织块原代培养实验流程中，我们对实验的各个步骤，例如组织块贴壁需要的时间、细胞生长所需的培养基种类、培养基添加剂以及动物组织供体年龄等进行了筛选，建立了小鼠肝细胞组织块的原代培养系统。

我们用单细胞凝胶电泳方法对磁场和抗癌药物对人自血病细胞Ｋ５６２以及小鼠原代肝细胞的ＤＮＡ损伤进行了检测。结果发现，Ｋ５６２细胞在９ｍＴ稳恒磁场中处理１２ｈ即可引起细胞的ＤＮＡ损伤，这一损伤随处理时间的延长而增加，具有时间依赖效应；同样条件下对原代肝细胞的处理以及更长时间的处理（３６ｈ、４８ｈ、７２ｈ）均未发现细胞的ＤＮＡ损伤。在使用较低浓度紫杉醇（５０ｎｇ／ｍＬ）处理Ｋ５６２细胞１２ｈ后，即可导致细胞ＤＮＡ损伤，并表现出时间依赖效应，而仅在高浓度长时阳Ｊ的紫杉醇（８００ｎｇ／ｍＬ，２４ｈ）处理下才会引起肝细胞的ＤＮＡ损伤。８００９９／ｍＬ环磷酰胺处理Ｋ５６２细胞１２ｈ即可引起细胞的ＤＮＡ损伤，而在１２００９９／ｍＬ时方才引起肝细胞的ＤＮＡ损伤。

关键词：单细胞凝胶电泳；ＤＮＡ损伤：ＵＶ；细胞培养；磁场；抗癌药物

Ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ－－

ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｏｍｅｔａｓｓａｙ

ＬｕｏＭｉｎｇｚｈｉ

ＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅｃｏｍｅｔａｓｓａｙ，ａｌｓｏｃａｌｌｅｄｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＣＧＥ），ｉｓａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｑｕｉｃｋａｎｄｃｈｅａｐｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｍｅｔｈｏｄｔｏｄｅｔｅｃｔａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｅＤＮＡｄａｍａｇｅｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌｓ．ＩｔｗａｓｆｉｒｓｔｄｅｓｃｒｉｂｅｄｂｙＯｓｔｔｉｒｔｇａｎｄＪｏｈａｎ。ｓｏｎｉｎ１９８４ａｎｄＷａｓｌａｔｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄｂｙＳｉｎｇｈ，Ｔｈｅｃｏｍｅｔａｓｓａｙｈａｓｂｅｅｎｕｓｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｉｅｌｄｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇａｇｉｎｇ，ｃｌｉｎｉｃａｌｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ，ｇｅｎｅｔｉｃｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｉｎｔｈｅｐａｓｔｆｅｗｙｅａｒｓ．

Ｗｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｔｈｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｏｆａｌｋａｌｉｎｅｃｏｍｅｔａｓｓａｙｉｎｏｕｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｗｅｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄｔｈｅｐｒｏｔｏｃｏｌｏｆａｌｋａｌｉｎｅｃｏｍｅｔａｓｓａｙｓｔｅｐｂｙｓｔｅｐ，ａｎｄｍｏｄｉｆｉｅｄｓｏｍｅｓｔｅｐｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｇｅｌｓｌｉｄｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｗａｔｅｒｗａｓｈｉｎｇａｎｄｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ

Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｔｈｅａｄｈｅｓｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｉｎｌａｙｅｒｓｏｆｌｏｗｍｅｌｔｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ

ａｇａｒｏｓｅａｎｄａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓｌｉｄｅ，ａｃｌｅａｎｓｌｉｄｅｎｅｅｄｔｏｂｅｄｉｐｐｅｄｉｎｎｏｍａｌｍｅｌｔｉｎｇ

ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｇａｒｏｓｅｆｏｒｌｒａｉｎａｎｄｔｈｅｎｄｒｉｅｄａｔ３７℃ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ．Ｔｈｕｓａｎｅｗｍｅｔｈｏｄ

ｏＰ‘ｐｏｕｒｉｎｇ＇’ｇｅｌｈａｓｂｅｅｎｕｓｅｄｔｏｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ“ｓａｎｄｗｉｃｈ＂’ｍｅｔｈｏｄＩｎｔｈｉｓ

ｗａｙ，ｇｅｌ’ｓｔａｋｉｎｇｏｆｆｆｒｏｍｔｈｅｓｌｉｄｅｓｗａｓａｖｏｉｄｅｄ．Ｔｏａｖｏｉｄｔｈｅｔｈｅｓａｌｔａｎｄｄｅｔｅｒｇｅｎｔｏｆｔｈｅｌｙｓｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎｗｈｉｃｈｉｎｔｅｒｆｅｒｅｔｈｅｅｌｅｃｔｒｉｃｆｉｅｌｄ，ｔｈｅｓｌｉｄｅｓｈａｖｅｔｏｂｅｗａｓｈｅｄｂｙ

ｔｒｉｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒｔｈｒｅｅｔｉｍｅｓ．Ａｆｔｅｒｔｈｅｓｌｉｄｅｓｄｅｈｙｄｒａｔｅｄｂｙｇｒａｄｓａｌｃｏｈｏｌ，ｍｏｓｔｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅｇｅｌｗａｓｌｏｃａｔｅｄａｔａｓｉｍｉｌａｒｐｌａｎｅ；ＥＢ（Ｅｔｈｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）ｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄａｓｔｈｅｂｅｓｔ

ｄｙｅｆｏｒＤＮＡｓｔａｉｎｉｎｇｔｏａｖｏｉｄｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｂｌｅａｃｈｉｎｇ．ＷｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｔｈｅＣＡＳＰ

ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｆｒｅｅ）ｆｏｒｔｈｅｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｍａｇｅａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｕｓ，ａｎｏｐｔｉｍｉｚｅｄａｎｄｓｔａｎｄａｒｄ

ｍｅｔｈｏｄｈａｓｂｅｅｎｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ｔｈｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｐｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄａｎｄｔｈｅｔｉｍｅｓａｖｅｄ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｖｅｒｉｆｙｔｈｅｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｍｅｔｈｏｄ，ａｓｗｅｌｌａｓｔｈｅｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙａｎｄｔｈｅｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅＣＡＳＰｓｏｆｔｗａｒｅ，ｗｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｐｏｓｉｔｉｖｅｍｏｄｅｌ：ｔｈｅＤＮＡｄａｍａｇｅｏｆＫ５６２ｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＵＶｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｃｏｍｅｔａｓｓａｙ．Ａｇｏｏｄｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｆｆｅｃｔｗａｓｆｏｕｎｄ，ｓｈｏｗｅｄｔｈｅｍｅｔｈｏｄｈａｓａｇｏｏｄｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔａｌｓｏｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｆｏｕｒｐａｒａｍｅｔｅｒｓ．Ｔａｉｉｌｅｎｇｔｈ，ＣｏｍｅｔＬｅｎｇｄｌ，１硪ｆＭｏｍｅｎｔａｎｄＯｌｉｖｅ１１ａｉｌＭｏｍｅｎｔ．ｈａｖｅａｇｏｏｄｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｆｆｅｃｔ・ｗｈｉｃｈｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＣＡＳＰｓｏｆｔｗａｒｅａｎｄｔｈｅｆｏｕｒｐａｒａｍｅｔｅｒｓｈａｖｅａｇｏｏｄｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ．

Ｔｈｒｏｕｇｈｄｉｓｃｕｓｓｉｎｇｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｐｒｏｔｏｃｏｌｓｓｔｅｐｂｙｓｔｅｐ，ｉｎｖｏｌｖｉｎｇｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｔｈｅｔｉｓｓｕｅａｄｈｅｒｅｉｎｇｔｏｔｈｅｍａｔｒｉｘ，ｔｈｅｋｉｎｄｓｏｆｔｈｅｍｅｄｉｕｍａｎｄｔｈｅａｇｅｏｆａｎｉｍａｌｓ，ｗｃａｌｓｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｔｈｅｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．

ＴｈｅｎｗｅｔｅｓｔｅｄＤＮＡｄａｍａｇｅｏｆＫ５６２ａｎｄｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｍａｇｎｅｔｉｃｆｉｅｌｄ

ＩＩ