分解纤维素菌种的筛选
降解纤维素菌株的筛选
２ 和 Ｐ－ １、 Ｐ－ ２ 都 能 在 羧 甲 基 纤 维 素 琼 脂 培 养 基 上 生
长 ， 且长势良好 ； Ｔ－ １、 Ｔ－ ２ 和 Ｐ－ １、 Ｐ－ ２ 也 都 能 使 滤 纸 条 溃 烂 ， 但 在 ＣＭＣ平 板 上 Ｔ－ １、 Ｔ－ ２ 的 菌 落 直 径 要 比 Ｐ－ １、 Ｐ－ ２ 的菌落大 ， 接种 Ｔ－ １、 Ｔ－ ２ 的 滤 纸 条 培 养 基中 的 滤 纸 条 崩 溃 程 度 明 显 高 于 接 种 Ｐ－ １、 Ｐ－ ２ 的 滤 纸 条 培 养 基 ， 而 且 Ｔ－ １、 Ｔ－ ２ 使 滤 纸 条 崩 溃 的 时 间 也 比 Ｐ－ １、 Ｐ－ ２ 短。由此初步判断 Ｔ－ １、 Ｔ－ ２ 对 滤 纸 条 的 降解性能比 Ｐ－ １、Ｐ－ ２强。
Ｐ－ １ 具有较高 的 滤 纸 酶 活 和 。其 中 又 以 Ｔ－ １ 的 滤 纸 酶
活力和羧甲基纤维素酶活力最高 ， 培养 １５６ｈ 时 Ｔ－ １ 的 羧甲基纤维素酶活达到 ６８．６１Ｕ／ｇ， 此后一直维持较稳
Ｎｏ． ８． ２００６
５１
基础理论
６４８．８０Ｕ／ｇ和 ５７３．５７Ｕ／ｇ， 并 且 在 整 个 发 酵 过 程 中 Ｐ－ １、 Ｐ－ ２ 所产 β － 葡萄糖苷酶都能保持在较高、较稳定的水
（２） 滤 纸 条 培 养 基 ： （ＮＨ４）２ＳＯ４ １ｇ， ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，
・ ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ ０．７ｇ， ＮａＣｌ ０．５ｇ， 蒸 馏 水 １０００ｍＬ， 新 华 定量滤纸条 ６ｃｍ× １ｃｍ。 以上培养基均在 １２１℃湿热灭菌 ３０ｍｉｎ后使用。
１．２．３
固态发酵产酶培养基渣 ７ｇ， 麸皮 ３ｇ， （ＮＨ４）２ＳＯ４
的 柠 檬 酸 缓 冲 液 ）０．７５ｍＬ， 加 入 粗 酶 液 ０．２５ｍＬ， ５０℃ 恒 温 水 浴 保 持 １ｈ， 加 入 ＤＮＳ试 剂 ， 于 沸 水 浴 中 放 置
油菜秸秆纤维素降解菌的筛选及复合菌剂的降解特性
油菜秸秆纤维素降解菌的筛选及复合菌剂的降解特性摘要：从土壤、腐烂的木桩和成品肥料中筛选高效降解油菜秸秆纤维素的菌株，并通过正交试验对菌种进行复配组合，筛选出一组高效降解油菜秸秆的复合菌剂，其羧甲基纤维素（CMC）酶活性为12 704.3 U/g，滤纸（FP）酶活性为1 227.7 U/g，秸秆失重率为25.65%，初步鉴定该菌剂组成为地衣芽孢杆菌B4、链霉菌A8、米根霉M3和木霉X1。
采用此复合菌剂以油菜秸秆粉为降解原料进行14 d 的发酵，纤维素降解率为33.10%，半纤维素降解率为23.70%，相比于不加菌剂的对照组，自制菌剂的纤维素、半纤维素降解率分别提高了24.50%和15.60%。
关键词：油菜秸秆；纤维素降解菌；复合菌系；降解特性中国油菜种植面积和产量常年居于世界首位，2009年油菜播种面积为700×104 hm2[1]，如此巨大的油菜种植面积，在菜子收获后必将产生大量的废弃油菜秸秆。
据测定，油菜秸秆中含有丰富的氮、磷、钾及有机质等营养成分，然而，目前油菜秸秆并没有得到合理的利用，大量的秸秆被直接焚烧，这不仅污染了环境，同时造成了资源和能源的极大浪费[2，3]。
因此，如何有效地开发利用油菜秸秆，发挥其潜在资源价值，成为当前亟待解决的问题。
油菜秸秆的主要成分是木质纤维素类物质，木质素含量为16%～21%，纤维素为38%～42%[4]，木质纤维素的高含量是阻碍其资源化利用的关键。
提高富含纤维素的工农业废弃物的利用率，已成为近年来研究的热点[5]，目前对纤维素类物质的有效利用主要采取生物法，利用微生物手段使其达到资源化处理和利用[6]。
而且油菜秸秆细胞壁的结晶度较高，木质素与纤维素之间镶嵌形成稳定结构，导致其应用远远不如其他主要粮食作物秸秆，针对油菜秸秆的微生物处理在国内外鲜有报道[7]。
为此，以降解油菜秸秆纤维素为目的，通过从土壤、腐烂的木桩和成品肥料中筛选油菜秸秆纤维素的高效降解菌株，并对菌种的复配组合以及降解特性进行研究。
产纤维素酶菌种的筛选与优化
产纤维素酶菌种的筛选与优化一、菌种筛选的原理与方法菌种筛选的原理是通过筛选产纤维素酶活性高、产量大的菌种。
常用的菌种筛选方法有以下几种：1.传统菌种筛选：分离环境中的纤维素降解菌株，通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株，再通过多次温育和活性测定，逐步筛选出高活性的菌株。
2.显性菌种筛选：利用纤维素酶结构上保守的区域设计引物，在环境DNA中扩增出纤维素酶基因片段，使用这些基因片段进行克隆构建，然后在宿主中进行表达，通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株。
3.基因工程菌种筛选：利用已知纤维素酶的基因进行基因工程，通过载体导入宿主细胞中，通过外源表达基因，从而获得产纤维素酶菌种。
二、菌种优化的原理与方法菌种优化的原理是通过改变菌株基因组或环境条件，提高纤维素酶产量和活力。
常用的菌种优化方法有以下几种：1.自然进化优化：通过长期培养，逐渐挑选出产酶能力强、极端环境适应能力强的突变菌株。
2.诱变优化：利用物理、化学或基因工程等方法对菌株进行诱变，通过筛选获得产纤维素酶能力强、菌株稳定的变种。
3.基因工程优化：利用已知纤维素酶的基因进行基因编程，通过基因工程技术对菌株基因组进行改造，以提高纤维素酶的产量和活力。
三、未来的研究方向1.菌种筛选方法的改进与创新：应综合运用传统筛选、显性筛选和基因工程筛选等方法，发展新的高效、快速的菌种筛选方法。
2.菌种优化技术的优化与提高产量、活性：要通过生理、代谢工程的方法改造纤维素酶产生菌，提高纤维素酶的产量和活力。
3.开发新型纤维素酶菌株：从不同环境中分离筛选出产酶能力强的菌株，进一步发现和研究产纤维素酶的新菌株。
4.提高纤维素酶产量与废弃物转化率的研究：将纤维素酶应用于废弃物转化过程，提高纤维素酶产量和转化率。
综上所述，产纤维素酶菌种筛选与优化的研究是促进纤维素酶应用的关键。
通过不断改进筛选和优化方法，进一步开发新的菌种，提高纤维素酶的产量和活力，将对纤维素酶的应用产生积极的推动作用。
纤维素降解菌系的筛选及降解稻草条件研究
纤维素降解菌系的筛选及降解稻草条件研究摘要:以已分离的11株纤维素降解菌为材料,采用滤纸崩解法和透明圈法,初步筛选出4株纤维素降解能力较强的菌株｡将这4株单菌进行两两组合,研究混合菌系在9d内的CMC酶活和FPA酶活与单菌发酵之间的异同｡结果表明,混合菌发酵CMC酶活和FPA酶活均优于单一菌株;同时筛选出一组具有高降解能力的混合菌体系;并对该混合菌系降解稻草的最适反应温度､最适初始pH值､产生还原糖的时间进行了研究,结果表明,在30℃､pH值4.5､发酵96 h时混合菌降解稻草的效果最好｡关键词:纤维素降解菌;筛选;CMC酶活;FPA酶活;还原糖含量;降解条件Screening of Cellulose Degrading Microorganism and the Degrading Condition of Rice StrawAbstract: Four strains with strong degradation ability to cellulose materials were screened out of 11 bacteria using filter paper degradation method and clear halo method. Then a mixed germ with higher degradation ability was obtained as the CMC and FPA enzyme activity of mixed bacteria and pure bacterium was compared. The optimum degrading condition of the mixed germ to rice straw was 30℃, pH 4.5, and fermentation for 96 h.Key words: cellulose degrading microorganism; screening; CMC enzyme activity; FPA enzyme activity; degrading condition纤维素是地球上最廉价､最丰富的可再生资源｡全世界每年纤维素及半纤维素的生成量为850亿t｡利用微生物产生的纤维素酶来分解和转化纤维素是纤维素利用的有效途径｡纤维素的生物降解对开辟新能源和防止其污染环境有重要意义,一直是生物技术领域的研究重点[1,2]｡在长期生产实践中发现该生物过程是微生物单独作用不能完成或只能微弱进行的,必须依靠两种或两种以上的微生物共同作用才能完成,微生物混合培养或混合发酵已越来越受重视[3]｡而且国内对产纤维素酶能力较强的单一菌种研究较多,菌种混合发酵的研究较少[4,5]｡本试验在纤维素降解单一菌株研究的基础上,着力于筛选降解纤维素的混合菌系,旨在为纤维素的高效转化提供依据｡1材料与方法1.1菌种纤维素降解菌分别来自枯树根､烂菜叶､牛粪和牛胃中｡1.2培养基制备PDA培养基:马铃薯200 g,蔗糖20 g,琼脂粉20 g,水1 000 mL,pH值6.5｡滤纸条鉴定培养基:(NH4)2SO4 0.10%, KH2PO4 0.10%, MgSO4·7H2O 0.05%,K2HPO4 0.20%,酵母膏0.01%,滤纸条(规格为1 cm×7 cm)1块,pH值6.5｡纤维素刚果红培养基:(NH4)2SO4 0.20%,MgSO4·7H2O 0.05%,KH2PO4 0.10%,NaCl 0.05%,CMC-Na 2.00%,刚果红0.02%,琼脂2.00%,pH值6.5｡液体发酵培养基:KH2PO4 1.00 g, NaCl 0.10 g, MgSO4·7H2O 0.30 g, NaNO3 2.50 g, FeCl3 0.01 g,CaCl2 0.10 g,秸秆木质纤维素20.00 g,pH值7.20~7.40｡1.3菌种初筛透明圈直径(H)与菌落直径(D)比值的测定:将11株保藏菌种(菌种名称分别为N1､N2､N3､N4､N5､N6､N7､N8､N9､N10､N11)活化后分别接种到PDA培养基上,30℃培养3d｡将每一株菌分别转接到纤维素刚果红培养基上,30℃培养4 d后,加入适量1 mol/L的NaCl溶液,浸泡1 h,根据H与D比值的大小进行初筛｡单菌株滤纸失重率的测定:将透明圈大的菌种接种于滤纸条鉴定培养液中,以不接种处理作对照,28℃摇床培养8 d,分别在2､4､6､8 d时测其失重率｡滤纸失重率的测定:用滤纸过滤发酵液,将残留物80℃烘干称重,用减重法计算出滤纸失重率｡失重率=(培养前底物干重-培养后底物干重)×100%/培养前底物干重｡将单菌株滤纸失重率较大且H/D值大于2.0的菌株作为复筛菌种｡1.4复筛将初筛所得单菌种进行两两组合,对单菌种和不同组合菌种测定羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活｡以体积比为1∶1的接种比例､10%的接种量分别接入固态培养基中｡1.4.1羧甲基纤维素酶活测定①酶液的制备:将发酵液于4 000 r/min,4℃,离心20 min,取上清液,备用｡②纤维素酶活力的测定方法(DNS法):取A､B､C共3支50 mL 比色管,在A､B管中分别加入1.5､0.5 mL的1% CMC-Na溶液(用pH值4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液配制)适当稀释的酶液, C管中加入1.5 mL的pH值为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液和0.5 mL酶液,50℃下保温30 min,然后在3支比色管中分别加入2.5 mL的DNS试剂,沸水浴5 min后放入水中冷却,终止反应,定容至25 mL,摇匀,在波长520 nm处测定吸光值(C管作空白对照),并从葡萄糖标准曲线上查出相应的葡萄糖含量,再折算成酶活力单位｡CMC酶活力定义为:在pH值4.8,50℃条件下,1 mL酶液每分钟水解羧甲基纤维素钠生成1 μg葡萄糖的酶量,称为一个酶活力单位,以U/mL表示｡1.4.2滤纸酶活(FPA)测定取A､B､C共3支具塞比色管,在A､B管中加入pH值4.8醋酸-醋酸钠缓冲液1.5 mL和1 cm×6 cm规格的新华滤纸条(约50 mg),50℃下预热10 min后,加入0.5 mL适当稀释的酶液,C管不加底物作空白对照,50℃下保温60 min,然后在3支比色管中分别加入2.5 mL DNS试剂,沸水浴5 min后立即在水中冷却,终止反应,定容至25 mL,摇匀,在波长520 nm处测定吸光值(C管作空白对照),根据葡萄糖标准曲线计算酶活力｡酶活力定义为:在pH值4.8,50℃条件下, 1 mL酶液每分钟水解滤纸条生成1μg葡萄糖的酶量,称为一个酶活力单位,以U/mL 表示｡1.5菌种降解稻草条件研究还原糖含量测定按照DNS比色法[6]进行｡2结果与分析2.1初筛结果由经过活化的11株菌株在刚果红培养基上的生长情况(表1)可知,菌株N1､N2､N3､N7､N8和N9的滤纸失重率相对较高;从透明圈与菌落圈直径之比来看,菌株N1､N3､N7､N8的H/D都超过2.0｡因此,选取N1､N3､N7､N8号菌株作为复筛对象｡2.2复筛结果发酵过程中菌系CMC酶活的变化情况见表2｡由表2可知,接种后1~2 d内酶活逐渐上升,大部分菌株在3~4 d时酶活出现最高峰值,5~6 d酶活开始下降,7~9 d酶活又缓慢上升｡两种菌株混合培养在一定程度上会提高CMC酶活,组合菌株N7+N8培养4 d时的CMC酶活为195.7U/mL,相当于其菌株单独培养平均酶活的2.36倍｡表3表示的是滤纸酶活在发酵过程中的变化情况,总体的变化趋势是在1~4 d 内先上升,5~7 d上升到峰值,之后再下降｡两种菌混合培养时FPA酶活也有一定程度的提高,组合菌株N7+N8在发酵6d时的FPA酶活为30.5 U/mL,相当于其菌株单独培养平均酶活的1.7倍｡因此,选取组合N7+N8作为最优纤维素降解混合菌系｡2.3组合菌株N7+N8降解稻草的最适温度分别研究了温度在20､30､40､50､60℃时混合菌降解稻草后的CMC酶活､FPA 酶活､产还原糖量(表4)｡由表4可知,CMC酶活､FPA酶活､还原糖含量三者之间存在较明显的正相关性,三者均在温度为30℃时达到最大值｡因此选择30℃作为混合菌降解稻草的最适温度｡2.4组合菌株N7+N8降解稻草的最适pH值分别研究了初始pH值为4.0､4.5､5.0､5.5和6.0时混合菌降解稻草后的CMC酶活､FPA酶活､还原糖量｡由表5可知,初始pH值为4.5时,CMC酶活､FPA酶活､还原糖含量三者均达到最大值｡因此选择4.5为混合菌降解稻草的最适初始pH值｡2.5组合菌株N7+N8降解稻草的最适培养时间在混合菌降解稻草的最优发酵条件下,每隔12 h测定1次其生长状况及产糖情况,研究培养时间对混合菌生长及产还原糖的影响,结果见图1｡由图1可知,混合菌系在培养72 h之前,还原糖产量较低,在培养72~96 h过程中,混合菌系迅速产生还原糖,在96 h时还原糖产生量最高,达1.8 g/L｡3讨论本研究筛选出了一组具有较高纤维素降解活力的混合菌系,该混合菌系的CMC 酶活和滤纸酶活均高于单一菌株;同时研究了该混合菌系降解稻草的最适反应温度､最适初始pH值及培养时间对还原糖量的影响｡本研究虽对上述试验条件进行了探讨,但以下问题有待进一步研究:①所得混合菌系纤维素降解酶活力距离生产要求还有很大的差距,应采用诱变等方法对该菌系进行处理,以提高现有菌系的产酶活力;②在利用单因素法研究温度､pH值､培养时间对产酶的影响的基础上,需进一步研究多因素对发酵产酶的影响,以使理论研究更加贴近实际生产｡参考文献:[1] MANDELS M, STERNBERG D. Recent advances in cellulose technology[J]. J Ferment Technol,1976,54(4):267-286.[2] HARUTA S,CUI Z,HUANG Z,et al. Construction of a stable microbial community with high cellulose-degra-dation ability[J]. Applied Microbiology Biotechnology,2002,59(4-5):529-534.[3] 冯树,周樱桥,张忠泽. 微生物混合培养及其应用[J] .微生物学通报,2001,28(3):92-95.[4] 史玉英,沈其荣,娄无忌,等. 纤维素分解菌的分离和筛选[J]. 南京农业大学学报,1996,19(3):59-62.[5] 洪洞,黄秀莉. 纤维素酶的应用[J].生物学通报,1997,32(12):18-19.[6] 王玉万,徐文玉. 木质纤维素固体基质发酵物中半纤维素､纤维素和木质素的定量分析程序[J].微生物学通报,1987,14(2):81-84.。
木质纤维素生物降解机理及其降解菌筛选方法研究进展
部分能被反刍动物低效率利用外 ， 大多数就地烧毁， 造成环境污染和资源浪费。 因此长期以来， 国内外 一直在寻找降解植物秸秆木质纤维素的最佳途径 ， 研究一般都集中于下面几个方面： 将秸秆进行理化 处理， 蒸气爆破、 热水处理、 稀酸处理、 碱处理、 低温 氨爆处理、 湿 氧 法、 有 机 溶 剂 处 理、 超临界水处理 等
The Research Progress on the Mechanisms of Lignocellulose Biological Degrading and the Screening Method on the Degrading Bacteria
WANG Shiqiang1 ， GU Chunmei1 ， ZHAO Haihong2
［4 ］
维素末端。内切型纤维素酶可为外切酶提供大量的 反应末端， 同时它也能水解小分子的纤维素寡糖 ； 外 切酶作用于纤维素分子的末端， 依次从纤维素分子 ， 中切下纤维二糖 它可以作用于纤维素分子内的结 晶区、 无定形区和羧甲基纤维素； 纤维二糖酶作用是 将纤维二糖水解为葡萄糖。而细菌纤维素酶往往以 纤维素酶小体的形式附着在细菌细胞壁的表面 ， 为 了有利于纤维素的降解， 具有纤维降解能力的细菌 往往通过纤维素酶小体上的纤维素结合域 （ CBD ） ［11 ］ 附着到纤维素的表面 。 好氧细菌和真菌产生的纤维素酶组分较为单 一， 而厌氧细菌和真菌则可产生一个独特的多酶复 ［12 ］ 合体结构， 被称为多纤维素酶体 。 所谓的多酶体 是指纤维素酶和一些多聚糖酶通过一个没有活性的 而这骨架蛋白通常被称为 骨架蛋白 绑 定 在 一 起， CbpA、 CipA 或 CipC［13］。在骨架蛋白中包含有许多 的黏结蛋白区和纤维素绑定区。由于多纤维素酶体 使得其在纤维素降解过程中具有很多 的特殊结构， 优点： ①它们与纤维素紧密地结合， 将减少由于动态 的环境条件造成的分解中间产物的损失 。在好氧系 统中主动地搅拌和通气是必须的， 分泌的酶和这个 中间产 物 的 损 失 证 明 对 提 高 整 个 工 艺 的 效 率 不 ［14 ］ 增加了 成 对 酶 的 活 利 。②由于具有支架蛋白， 从而复 性。③在同一个复合体内的酶具有相似性， 合纤维素酶系统的各个不同水解酶之间具有更大的 ［15 ］ 酶之间的协同作用增强了 。 协同作用， 1． 2 半纤维素降解酶 半纤维素酶是木聚糖酶、 甘露聚糖酶、 阿拉伯聚 糖酶、 阿拉伯半乳糖酶和木葡聚糖酶等多组酶的总 称。纤维素酶和半纤维素酶通常同时出现在某些微 生物的发酵产物中， 而且它们在应用、 分子结构及作 用机理等方面都有相似性和相关性 。木聚糖是半纤 维素内主要的碳水化合物， 它的完全水解也是需要 1， 4多种水解酶的协同作用来完成。 胞内β 木聚 1 ， 4糖酶和木聚糖 β 木糖酶是半纤维素水中的主要 的两种酶。前者通过劈开木聚糖而产生低聚糖， 后 者作用于木聚糖低聚物而产生木糖 。在木聚糖水解 过程中， 还需要一些附属酶如阿魏酸酯酶 、 香豆酸酯 酶等的协同作用。纤维素酶和半纤维素酶具有很好 在木聚糖酶和纤维素酶中均存在 的协同 性 ， CBD， 而且两者的功能和氨基酸组成上相似 。 1． 3 木质素降解酶 由于微生物对木质素的降解依靠的是其分泌的 酶系， 不同的菌种可能具有不同的降解酶系统 ， 一个 菌株的木质素降解能力是由它的生理特性和总体代
纤维素菌分离和鉴定的方法
纤维素菌分离和鉴定的方法一、概述纤维素由于其特殊的生化性质，一直是微生物学和食品工业研究的关注焦点。
特别是纤维素的分解，除了传统的化学方法，生物法也是目前广泛采用的技术之一。
对纤维素酶活性和产酶微生物的分离和鉴定，是纤维素生物技术研究的重要内容。
纤维素分解酶是产生于微生物体内的一类酶，广泛存在于真菌和细菌中，可划分为纤维素酶和半纤维素酶两大类，规律的利用这些微生物菌种，开发新型的纤维素分解酶。
纤维素的微生物分解菌种较多，其中许多菌种能分泌出多种细胞外酶，如单糖的转化酶、纤维素酶、半纤维素酶、葡萄糖氧化酶、木糖酶、果糖酶和葡聚糖酶等。
多种新型有机物的产生依赖于工业生产中微生物的应用技术，目前各国纤维素降解的菌株和发酵产物分离和鉴定方法越来越多。
纤维素菌的分离可采用筛选、稀释和富集等方法。
实际应用中，常用的分离方法有：（一）厌氧富集法：根据纤维素菌能够在厌氧条件下进行生长和代谢的特点，采用富集培养方法，利用耐氧性微生物限制氧气的供应，引起产生厌氧性纤维素分解菌类，然后推广领域固定化、发酵和应用。
可根据繁殖时间将厌氧富集法分为短时间富集法和长时间富集法。
（二）筛选法：在纤维素富含的自然环境或人工培养环境中进行筛选。
先用一些微生物菌株做为预培养菌种，加入富含纤维素的培养基，通过短期采取接种、稀释、摇动等处理方式，寻找纤维素分解酶活力最高的培养物，然后进行分离纯化、性质鉴定。
（三）稀释法：将样品依一定比例进行稀释，将稀释后的液体均匀地均匀的加入纤维素培养基中，用深层培养的方式进行发酵，进行分离鉴定纯化。
稀释法适用于富含纤维素且菌株较多的培养基的菌群筛选。
（一）形态学特征鉴定法：根据菌株的形态学特征进行鉴定。
此方法是最基本也是最重要的鉴定方法之一。
菌株的形态学特征包括形状、结构、颜色和大小等，进一步对分离的菌株进行正确定义。
常用的形态学特征包括：形态特征、结构特征、色素特征和大肠杆菌。
（二）生理生化特征鉴定法：通过菌株的生长特性在不同培养基中的表现，或菌体在不同生长条件下表现的生化过程，如碳源利用情况，氮源利用情况，温度和pH值的影响等，进行鉴定。
纤维素降解菌的筛选-毕业论文
---文档均为word文档，下载后可直接编辑使用亦可打印---摘要）集[C].中国微生物学会农业微生物学专业委员会、中国土壤学会土壤生物和生物化学专业委员会、中国植物营养与肥料学会微生物与菌肥专业委员会、农业部微生物肥料和食用菌菌种质量监督检验测试中心：中国土壤学会土壤生物和生物化学专业委员会，2010：5.[16]张恒，张应杰，陆昌龙.生活垃圾可发酵物降解菌的筛选[J].安徽农业科学，2005(10)：117-118+200.[17]张爽.低温纤维素降解菌的筛选及其玉米秸秆降解效果研究[D].东北农业大学，2018.[18]张凯帅.纤维素降解菌筛选及基于宏基因组克隆表达纤维素酶基因[D].内蒙古农业大学，2018.[19]刘震飞.秸秆木质纤维素降解菌的筛选及发酵工艺优化的研究[D].兰州交通大学，2018.[20]郑国香，赵欣，李健.一组耐低温纤维素降解菌系培养条件优化及产酶分析[J].东北农业大学学报，2017，48(04)：61-68.[21]李春艳，于琦，冯露，成毅，成小松，王雪，张平根.低温纤维素降解菌分离鉴定及产酶条件优化[J].东北农业大学学报，2015，46(10)：74-81.[22]勾长龙，王雨琼，王巍，赵晗旭，娄玉杰，高云航.两株长白山地区低温纤维素降解真菌的筛选鉴定及其产酶条件优化[J].中山大学学报(自然科学版)，2015，54(05)：115-121+129.[23]侯会利.牛粪固体物堆肥制作卧床垫料的效果及其低温纤维素降解菌的筛选[D].内蒙古农业大学，2015.[24]罗立津，万立，陈宏，温翠莲，徐福乐，贾纬，聂毅磊，袁红莉.耐低温木质纤维素降解菌群的富集培养及其种群结构分析[J].农业生物技术学报，2015，23(06)：727-737.[25]李鹤，张恒芳，秦治家，高云航，娄玉杰，刘淑霞.低温秸秆降解菌的研究进展[J].中国农学通报，2014，30(33)：116-119.[26]黄颖婕,周尚峰,刘震夷,岳勇志,李祖任,邬腊梅,王立峰.牛粪堆肥纤维素高效降解菌的筛选和应用[J].湖南农业科学,2018(02):50-53.[27]毛婷,魏亚琴,杨红建,牛永艳,陈娟,王治业.牦牛粪便中纤维素降解菌的筛选及产酶优化[J].中国农业大学学报,2019,24(11):106-116.[28]李林超,张超,董庆,郭成,周波,高峥.堆肥过程中纤维素降解菌的分离与鉴定[J].生物技术通报,2019,35(09):165-171.[29]方华舟,王培清.牛粪堆肥各阶段主要纤维素降解菌分离与作用规律分析[J].中国土壤与肥料,2012(06):88-92.[30]乔健敏,岳林芳,成立新,郑重,李子健,凤英,李蕴华,王志铭,宝华,于朝晖.肉牛粪污中纤维素降解菌的分离筛选[J].畜牧与饲料科学,2019,40(11):79-83.。
(整理)产纤维素酶菌种的筛选与优化.
目录实验一产纤维素酶菌种的分离与初筛实验二产纤维素酶菌种的复筛与保藏实验三酶活测定与传代保藏实验四产纤维素酶菌种的紫外诱变育种实验五产纤维素酶菌种的产酶条件优化实验六产纤维素酶菌种的产酶条件优化的结果分析实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定一、实验目的1．了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2．掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。
二、实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。
这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。
在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要：1.内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、CMC酶、EG。
这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素；2.外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase,简称CBH）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子；3.Β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.21，简称BG）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。
随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。
只有三种酶的协同作用，才能较好的分解纤维素。
就单菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高，产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。
本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长，利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。
堆肥用木质纤维素降解菌筛选技术规程
堆肥用木质纤维素降解菌筛选技术规程堆肥用木质纤维素降解菌筛选技术规程一、概述本技术规程适用于堆肥中的木质纤维素降解菌的筛选，旨在提高堆肥过程中木质纤维素的降解效率，加快堆肥的成熟度。
二、原材料1. 堆肥原料：任何含有木质纤维素的堆肥原料，如柿子皮、玉米秸秆、豆腐渣、鸡粪等。
2. 周转土壤：适当数量的质量稳定的土壤，用于混合筛选后的菌株以促进其生长繁殖。
三、筛选工艺1. 采集样品：从堆肥中采集样品，将其放入无菌的容器中保存备用。
2. 建立简单培养基：选择含有纤维素的培养基，如CMC-Na、微晶纤维素等，加入必要的营养物质，如氮源、无机盐等。
对于难以发酵的样品，可以采用先采用酸或碱法降解后，再加入培养基。
3. 接种菌株：将采集到的样品转移到培养基中，进行菌株接种。
4. 筛选菌株：在温度为25-35摄氏度，pH在6.5-7.5的条件下，进行连续传代或称呼吸发酵，筛选出挥发脂肪酸和酶活性高且能很好地降解纤维素的菌株。
5. 培养单一菌株：将所得到的优良菌株进行单一化处理，并进行在基于液体培养基中大量生产。
四、生产应用1. 生产培养液：利用大质量生产的单一菌株，生产木质纤维素降解菌培养液。
2. 将所获得的菌株加入堆肥中：根据堆肥原料的特点，适当调整降解菌添加量，加入筛选得到的木质纤维素降解菌到堆肥中，加速堆肥的成熟过程，提高堆肥品质。
3. 将获得的菌株应用于生物质降解和生物质转化工程：将所获得的菌株应用于生物质能源开发，例如生物乙醇和生物柴油的生产，从而实现木质纤维素的高效利用。
五、质量控制要求1. 筛选得到的优良菌株应符合菌种鉴定标准，如生物特性、代谢途径、遗传特性等。
2. 优良菌株的筛选应该有重复性和可重复性，同时筛选得到的菌株应该色泽正常，存活率高。
3. 如果需要将筛选得到的菌株应用于生物质能源开发，应对所得到的菌株进行基因治疗，减少或消除对人体或环境的潜在危害，以保证其应用安全性和环保性。
六、安全措施1. 实验室操作过程中，应注意微生物的无害化处理和卫生管理，进行废弃物和培养基的规范处理。
一株高活性纤维素降解细菌的筛选鉴定及酶学特性
一株高活性纤维素降解细菌的筛选鉴定及酶学特性陈晶晶;陶少强;夏强;王雅楠;秦冰;朱林【摘要】利用小麦/玉米秸秆还田土壤样品,通过富集培养和刚果红平板染色法筛选分离出纤维素降解细菌XWS-12;对分离的菌株进行16S rRNA基因序列系统发育分析,初步鉴定为伯克氏菌属(Burkholderia),定名为Burkholderia sp.XWS-12.以玉米秸秆和麸皮为碳源,研究了氮源、发酵时间、初始发酵温度、培养基初始pH 等条件对该伯克氏菌产纤维素酶的影响.结果显示,该菌株产纤维素酶最适氮源为硝酸钠,培养时间为60 h,培养温度为37℃,培养基初始pH为4,该菌株的CMC酶活力最高,可达25 U/ml.其粗酶液的最适反应温度为50℃,最适反应pH为5,在pH4～8的范围内酶活力较稳定.粗酶液的热稳定较差,当温度超过50℃时,该酶活力显著下降;当温度为50℃时,保温1h,该酶活力损失53％.【期刊名称】《土壤》【年(卷),期】2014(046)002【总页数】6页(P302-307)【关键词】纤维素分解菌;筛选;鉴定;酶学特性;纤维素酶活力【作者】陈晶晶;陶少强;夏强;王雅楠;秦冰;朱林【作者单位】安徽农业大学资源与环境学院,合肥230036;安徽农业大学资源与环境学院,合肥230036;安徽农业大学资源与环境学院,合肥230036;安徽农业大学资源与环境学院,合肥230036;安徽农业大学资源与环境学院,合肥230036;安徽农业大学资源与环境学院,合肥230036【正文语种】中文【中图分类】S154.39纤维素是陆地上光合作用的初级产物，它占植物干重的 35% ～ 50%，是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物。
同时，纤维素是自然界中数量最大的可再生资源，占陆地生态系统生物量的 80%，每年通过全球生物合成可再生性纤维素达1000 亿 t以上[1]。
我国农作物秸秆资源丰富，每年产量可达 6亿多 t，其中大部分未被充分利用，造成了资源的浪费和严重的环境污染[2]。
产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定
本科开放项目题目：产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定学生姓名：指导教师：学院：专业班级：2016年3月产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定摘要纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。
据估计，纤维素生成量每年高达1000亿吨。
我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。
纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。
但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限。
目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。
随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。
采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。
因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。
关键词：纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株目录第1章绪论 (1)1.1 实验原理 (1)1.2 实验仪器及试剂 (2)1.2.1 实验材料 (2)1.2.2 实验仪器 (2)1.2.3 培养基 (2)第2章实验步骤 (3)2.1 采样培养 (3)2.2 初筛 (4)2.3 复筛 (4)2.4 酶活的测定 (4)2.4.1原理 (4)2.4.2溶液配制 (4)2.4.3实验步骤 (5)第3章实验结果 (7)3.1 标准曲线的绘制 (7)3.2 菌株复筛结果 (8)3.3 测定纤维素酶活力结果 (9)结束语 (10)参考文献 (11)第1章绪论1.1 实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。
纤维素酶产生菌的筛选
纤维素酶产生菌的筛选实验原理纤维素酶是指能水解纤维素β-1，4葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维素二糖和葡萄糖的一组酶的总称，它不是单一酶，而是起协同作用的多组分酶系，纤维素酶主要是由：C1酶（外切β-1，4葡聚糖酶）、Cx（内切β-1，4葡聚糖酶）和BG（β-1，4葡萄糖苷酶）组成[11]。
不同微生物合成纤维素酶在组成上有显著的差异，对纤维素的酶能力也大不相同。
对纤维素能进行有效降解的生物包括细菌、丝状真菌、放线菌、软体动物等. 森林土有相当多枯枝落叶和腐烂的木头等，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长. 实验步骤1.样品的采集在学校森林富含有机质的土壤中用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好.2.富集培养在培养基中加入纤维素作为唯一的碳源，那些能分解利用的菌株因能得到充分的养分而迅速增殖，而其他微生物由于不能分解利用这些物质，生长受到抑制。
培养基的制备：磷酸二氯钠0.1%,硫酸镁0.05%，硫酸铵1.5%，纤维素粉4%，PH值5.8~5.9，按比例制配培养基。
在250mL锥形瓶中装入30mL培养基，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层包装纸（或报纸），用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20m in。
富集培养的操作：称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL培养基的摇瓶中。
将摇瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养1～2d，至培养基变混浊。
3.菌种的分离制备菌悬液：富集培养后，吸取上述培养基0.1mL稀释至10-4，10-5，10-6 。
维素-刚果红培养基的制备：硫酸铵2g，硫酸镁0.5g,磷酸氢鉀，氯化钠0.5g纤维素粉2g,刚果红0.4g琼脂22g水100ml。
在500mL三角瓶中装入200mL培养基，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
倒平板操作：将灭菌后的固体培养基熔化，按无菌操作的要求，在无菌的培养皿中倒入15～20mL培养基，凝固后待用。
高效纤维素降解菌的筛选鉴定及特性研究
高效纤维素降解菌的筛选鉴定及特性研究1. 本文概述随着生物技术的迅速发展，微生物在环保、能源等领域的应用备受关注。
高效纤维素降解菌作为其中之一，在解决全球气候变化、生物质能源开发等方面具有重要意义。
本文将围绕高效纤维素降解菌的筛选鉴定及特性研究展开论述。
高效纤维素降解菌的筛选鉴定是研究其特性的前提。
这一过程包括从自然界中采集样品，如土壤、腐木等，然后在选择性培养基上进行富集培养，初步筛选出能够降解纤维素的细菌。
通过形态学、生理学和分子生物学方法进行鉴定和纯化。
高效纤维素降解菌的特性研究包括生理学特性、代谢特性和营养需求等方面。
生理学特性方面，高效纤维素降解菌为好氧菌，最适生长温度范围为2535，最适pH值为0。
代谢特性方面，高效纤维素降解菌主要通过分泌纤维素酶进行纤维素的降解，这些酶在细胞内合成，然后分泌至细胞外，作用于纤维素分子不同位置，将纤维素降解为可溶性糖。
营养需求方面，高效纤维素降解菌生长需要碳源、氮源、磷源、钾源等，其中碳源主要为纤维素，氮源主要为有机氮，磷源和钾源则通过无机盐形式补充。
环境影响也是高效纤维素降解菌特性研究的一个重要方面。
在降解纤维素过程中，高效纤维素降解菌会产生二氧化碳气体，其释放量与纤维素的降解量呈正相关。
同时，高效纤维素降解菌在生长过程中可能会对培养基产生一定程度的污染，但可通过无菌操作等措施加以控制。
高效纤维素降解菌的筛选鉴定及特性研究具有重要的实践意义。
通过深入了解高效纤维素降解菌的生理学、代谢特性和营养需求等方面的特性，以及其对环境的影响，将为今后更好地开发利用纤维素资源、解决全球气候变化等问题提供理论支持和实践指导。
目前对于高效纤维素降解菌的研究仍存在一些不足之处，如不同种类的高效纤维素降解菌之间的协同作用机制尚不明确，以及如何提高纤维素降解菌的降解效率及降低生产成本等方面仍需进一步探讨。
未来，可以从这些方面展开深入研究，以推动高效纤维素降解菌的应用和发展。
筛选纤维素分解菌方法
筛选纤维素分解菌方法纤维素分解菌是一类具有良好纤维素降解能力的微生物，能够有效分解植物细胞壁中的纤维素，并将其转化为可利用的产物，如糖类和有机酸。
筛选纤维素分解菌的方法主要包括传统培养方法和分子生物学方法。
传统培养方法是最常用的筛选纤维素分解菌的方法之一。
首先，可以选择一些富含纤维素的底泥、土壤或植物残渣等样品作为菌种源，并在适当的培养基中培养。
然后，通过进行连续传代培养，筛选出具有较高纤维素酶活性的菌株。
常用的培养基成分包括纤维素、氮源、无机盐等。
培养过程中，可以通过测定菌株的纤维素酶活性来评估其降解能力。
常用的纤维素酶活性检测方法包括纤维素降解圈法和滴定法等。
分子生物学方法是近年来发展起来的一种筛选纤维素分解菌的方法。
这种方法利用纤维素酶基因的特异性序列，设计引物，并通过PCR扩增的方法进行筛选。
一般选择纤维素酶结构基因（如celA和celB等）作为目标基因，进行PCR扩增。
通过比较不同菌株的基因片段序列，可以筛选出具有较高纤维素降解能力的菌株。
此外，还可以利用转基因技术将纤维素酶基因导入到目标微生物中，提高其纤维素降解能力。
除了传统培养方法和分子生物学方法，还可以利用高通量筛选技术来筛选纤维素分解菌。
高通量筛选技术包括微流体技术、光学筛选技术和生物芯片技术等。
通过这些技术，可以快速并高效地筛选出具有较高纤维素降解能力的菌株，并进一步研究其降解机制。
总的来说，筛选纤维素分解菌的方法多种多样，其中传统培养方法和分子生物学方法是最常用的。
未来随着技术的进一步发展，相信会有更多更高效的筛选方法出现，有助于挖掘和利用更多具有纤维素降解能力的微生物，促进纤维素资源的利用和环境减排。
1株纤维素降解细菌的筛选及产酶条件研究
维普资讯
安徽农业科学，ｏｍａ ｎｕ Ａ ｎ． ｃ．Ｏ７３ （ ）３３ ，６４ Ｊｕ ｌ０Ａ ｈ ｉ ｇ Ｓｉ ０ ，５ １ ：６１３４ ｆ ２ ２
责任编辑
孙红 忠
责任校对
李洪
１ 纤维素 降解 细菌 的筛选及产 酶条 件研 究 株
卢月 陈凯 ， 海江 １ 北 程 学 学 ， 邯 晒 ｏ ． 省 更 学河 邢 ） 霞 ， 李 ２（河 工 大 农 院河 郸 ６１ 河 牙 中 ，北 台 ． 北 ０； 北 ２
报道 如下 。
１ 材料与方 法
１ １ 材料 ．
１１１ 试验样 品 ： 枯枝落 叶的土壤 。 ．． 富含
１１２ 培养基。初筛培养基 ： ．． 依姆歇涅茨基纤维素分解菌
培养 基［ ； 培养基 ［ ； 素分 解菌 鉴别 培养 基【 ； １ 分离 ］ ０ 纤维 ０ 液体
发 酵培养基 【 。
１２ 方 法 ．
２３ 不 同 ｐ 值对产 酶 的影 响 ． Ｈ
改 变培 养 液 ｐ ， ４ 取 Ｈ在 ８ ｈ
培养液进行酶活力测定， 结果见图 １ 。图 １ 显示 ， 该菌产酶的 最适 ｐ Ｈ值为 ８ 。
１ ． 菌种分离 和初筛 。将 样 品稀释 成 １～ ～１Ｉ各 级浓 ．１ ２ Ｏ Ｏ９ 度 的稀释 液 ， 装 有初 筛培 养基 的试 管 编号 ， 菌 移液 管 将 用无 吸取 １Ｔ稀 释液对号接 种在装有初 筛培养基 的试管 中 ， ℃ ｄ Ｉ ３ ７ 培养 １ ｄ 右 ， 滤纸条 上 出现 溃烂 斑 ； 择 滤纸 溃烂 程度 ０ 左 至 选 高的 试管 ， 溃烂 处挑 取菌 落 于分离 培 养基平 板 ， 次划 线 从 多 分离 ， 至得 到 纯化 的单 菌落 ； 到 的纯 种单 菌 落点 种 分离 将得 于纤维素 刚果红鉴 别 培养 基 ，７ ３ ℃培 养 ４ ， １ ｏ ＬＨ Ｉ ８ 用 ｌ Ｃ ｈ ｍ／ 固定分解 圈 ， 测量透 明圈直径 大小 ， 进行初筛 。 １２２ 菌种 的复筛 。复筛 采用液体 发酵培养 基 ， １ ｒｒｎ ．． 在 ５ ／ｉ ０ ａ 摇床上振荡 培养 ， ３ 于 ７℃培养 ４ 后 ， 定 发酵 液 的酶活 ， ８ ｈ 测 筛选 出纤 维素酶高产 菌株 。 １２３ 酶活 的测定 。参 考文献 ［］ Ｃ Ｅｓ 的测定 方法 ， ．． ５中 Ｍ ａ ｅ 并 计算酶 活。 １２４ 产酶 条件 的研究 。研 究不 同 Ｄ 、 度 、 ．． Ｈ温 碳源 、 氮源 对 Ｂ 菌株产酶 的影响 。 ３
土壤中纤维素降解菌的筛选鉴定及其糖化水平
土壤中纤维素降解菌的筛选鉴定及其糖化水平张海艳;路青青;杨伟平【摘要】为丰富降解纤维素微生物资源,更好地利用纤维素资源提供理论依据,采用刚果红染色法筛选与16S rRNA分子鉴定结合,对河南省栾川县龙峪湾森林公园腐殖土样中具有降解纤维素能力的菌株进行筛选与鉴定,并采用DNS法测定目标菌株的糖化水平.结果表明:分离获得具有降解纤维能力的菌株3株(LY-1、LY-5和LY-6),其中,菌株LY-6降解纤维素的能力最强,其在CMC培养基上的菌落直径为0.45 cm,透明圈直径为1.40 cm,革兰氏染色呈阳性;16S rRNA分子鉴定为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis LY-6);该菌株的糖化水平最高,产糖量为0.045 mg/mL.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2019(047)006【总页数】4页(P51-54)【关键词】纤维素降解菌;筛选;鉴定;糖化水平【作者】张海艳;路青青;杨伟平【作者单位】洛阳师范学院生命科学学院,河南洛阳471934;洛阳师范学院生命科学学院,河南洛阳471934;洛阳师范学院生命科学学院,河南洛阳471934【正文语种】中文【中图分类】S154.3纤维素资源是地球上最丰富和廉价的可再生资源，包括农作物秸秆、园林废弃物、甘蔗渣及工业纤维废渣等[1]。
全世界通过光合作用产生的纤维素估计为1.55×109 t/a，其中约89%尚未被利用[2]。
我国的纤维素资源丰富，数量巨大，但由于纤维素难以降解，所以目前对其开发和利用非常有限，主要用于燃料、畜牧饲料与积肥，导致纤维素资源利用率很低，且造成环境污染[1-4]。
产纤维素酶的微生物可将天然纤维素分解为葡萄糖等可利用的物质，对解决污染、能源危机等问题，保障人类社会可持续发展具有重大意义[5-6]。
因此，筛选产高活性纤维素酶的菌株，是开发利用纤维素资源的前提和关键。
产纤维素酶微生物广泛存在于土壤、极地海洋、温泉、植物组织、动物体内及真菌等生物样品和环境中，其中，土壤中纤维素分解菌最多[7-8]。
纤维素降解菌的筛选及相互作用分析
Ａｂ ｔａ ｔ Ｔ ｒｅ ｓｅ ｉｓｏ ｕ ｇ ｉ ｉｈ ｃｌ ａｅ ａｔｖｔ ｒ ｅｅ ｔｄ ｆ ｍ ｏｌｌｎ ｉｈ ｉ ｅ ｓｉｋ ｎ ｅｏｉｔ ｎａ ｄｍｕ ｏ ｔｅＯ ｔ ｔ ｔｅ ｓｒ ｃ ｈ ｅ ｐ ｃｅ ｆｆｎ ｉｗｔ ｈｇ ｅｌ ｓ ｃｉｉ ｗｅｅｓｌｃｅ ｏ ｓｉ ｏ ｇｒｃ ｎ ｔ ｔｃ ｓａ ｄ ｄ ｆｌ ｉ ｄｆ ｍ Ｕｌ ｈ ｈ ｕｌ ｙ ｒ ｈ ａｏ ｎ ｒ ｈ ｅｏ ｆ
圈直径与菌 落直径 比值 大的菌株进行 初筛 。 １ ． 菌 株 的 复筛 。将 初 筛 的 菌 株接 种 于 液 体 发 酵 培 养 ．２ ２
基 ，８℃ ．０ ｎｎ振荡 培养 ９ ， ０ ｎｎ离心 １ ｉ， ２ ２０ｒ ｆ ／ｉ ６ｈ ３ ０ｒ ｆ ０ ／ｉ ０ｍ ｎ 收
集 上清液测 Ｃ Ｃｓ酶 活 ， 出纤 维素酶 高产菌株 。 Ｍａ ｅ 选
Ｃ ｃ ｃ ａｅｄｇａａｉ ｆｃｅｃ ． ｎ ｙｎ ｅ ａ ｌ ｉ ｒ ｓ ｅｒｄｔ ｎｅ ｉ ｙ ｏ ｉ ｎ
Ｋｅ ｒ ｓ Ｃ ｌ ｌｓ ｅｒｄ ｔ ｎ；Ｍｉｅ ｕｔｒ ｙ ｗｏ ｄ ｅｌ ｏｅｄ ｇａ ａｉ ｕ ｏ ｘ ｃ ｌ ｅ；Ｄ ｇａ ａｉｎ ｅｆｃｅ ｃ ｄ ｕ ｅ ｒｄ ｔ ｆ ｉｎｙ ｏ ｉ
１ 材料 与方法
合发 酵培养 ， 各处 理组 合 酶 活性 测定 结果 如 表 １ 示 ， 活 所 酶
低温降解纤维素的细菌的筛选及鉴定
Ｂ１ 、Ｂ ０、Ｂ １ ２ ９ ２ ２ 、Ｂ ２表示 。
１ ， 方法 ２
Ｂ ７ ２ 种 虽 然生 长 缓慢 但 还 可 以 在低 温 下 生 １ 、Ｂ ０菌
长 ，Ｂ１ ２ ３ １ 、Ｂ ２ 、Ｂ 、Ｂ 、Ｂ １ １ 、Ｂ１ 、Ｂ１ 、Ｂ ８。 ４ ５ １菌
收 稿 日期 ：２ ０ — ３ ５ ０ ７ ０ —１
将 分离 出 能 产 生 纤 维 素 酶 的 ｌ 细菌 菌 株 ， ３株 点 种到 纤维 素分 解 菌鉴 别培 养 基 ，培 养 ２ｄ后测 量
各 菌 株透 明圈 的直 径 大 小 。结 果显 示 Ｂ 、Ｂ 、 ４ ５
Ｂ 、Ｂ 、Ｂ 、Ｂｌ ６ ７ ８ ０、Ｂ ７菌 种在 初 筛培 养 基 中无透 ｌ
降解作 用的两株细 菌菌株 Ｂ ９和 Ｂ １ ２ ，并对其进行鉴 定 ，Ｂ ９菌株 为噬胞 菌属 （ 又名 纤维粘 菌属 ，Ｃ ｔ ｈｇ ） ｙ ｐ ａｅ 细菌， ｏ Ｂ １菌株为纤维单胞 菌属（ ｅｌｌ ｏ ａ ） ２ Ｃ ｌ ｏ ｎｓ 细菌 。 ｕｍ 关键词 ：低温 ；纤维素；细菌；筛选
ｌ ｗ ｅｍ ｐ ａｔ ｅ ｏ ｔ ｅｒ ｕｒ
菌株
Ｂａ ｔ ｒａ ｃ ｅ ｉ
图 １ 不同菌株酶 活力
Ｆ ｇ １ Ｅｎ ｙ ｃ ｉ ｉ ｆｄ ｆｅ ｅ ｔｂ ｃｅ ｉ ｉ． ｚ ｍｅ ａ ｔ ｔ ｏ ｉ ｒ ｎ ａ ｔ ｒａ ｖ ｙ
生 长 。 而 Ｂ 、 Ｂ 、 Ｂ 、 Ｂ 、 Ｂ 、 Ｂ１ Ｂ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ０、 １ 、
１ 材料 与方法
１１ 菌种来 源 ．
在低 温 环 境 中 提 取 低 温 细 菌 ２ ２株 ，分 别 用
专题二 课题3 分解纤维素的微生物的分离
（二）纤维素分解菌的筛选 。 1、筛选方法： 筛选方法： 2、筛选纤维素分解菌的原理 刚果红是一种染料，它可以与像 刚果红是一种染料， ， 这样的多糖物质形成 ，但并 不和水解后的 和 发生这 种反应。 种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加 入刚果红时， 入刚果红时，培养基中会出现以 为 中心的 。这样，我们就可以通过 这样， 圈来筛选 。
链接高考
2009年40.【生物 选修1 2009年40.【生物——选修1生物技术实践】（15分） 选修 生物技术实践】 15分 在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外， （1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外， 温度 还要考虑______ ______和渗透压等条件。 ______、______和渗透压等条件 还要考虑______、酸碱度 和渗透压等条件。由于该细菌 易培养 具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、______、 具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、______、 生活周期短 ______等优点 因此常作为遗传学研究的实验材料。 等优点， ______等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。 在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染， （2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染， 灭菌 需对培养基和培养皿进行________ 消毒、灭菌）； ________（ ）；操 需对培养基和培养皿进行________（消毒、灭菌）；操 消毒 作者的双手需要进行清洗和______ ______； 作者的双手需要进行清洗和______；静止空气中的细菌 可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性， 可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还 损伤DNA DNA的结构 损伤DNA的结构 __________。 能__________。
实验设计
1.实验流程 1.实验流程
分解纤维素的微生物的分离
第7课时 分解纤维素的微生物的分离学习目标 1.掌握纤维素酶的种类和作用及纤维素分解菌的筛选方法。
2.理解并掌握纤维素分解菌的筛选过程及刚果红染色法的原理。
3.掌握纤维素酶的测定方法。
一、纤维素分解菌的筛选1．纤维素与纤维素酶 (1)纤维素①基本组成单位：-----------。
②分布：主要分布在植物--------------等器官中。
特别提醒 纤维素的分布、主要性质和作用分布 棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素主要性质 常温下比较稳定，不溶于水及一般有机溶剂；纤维素不具有还原性，但在一定条件下能进行水解反应，产生葡萄糖，故其水解产物具有还原性 作用植物细胞细胞壁的主要成分；一种重要的膳食纤维，具有刺激胃肠蠕动、促进消化液分泌的功能；此外纤维素可用于造纸、纺织、制造炸药等(2)纤维素酶①组成：是一种复合酶，至少包括三种组分，即C 1酶、C X 酶、葡萄糖苷酶。
②作用：纤维素―――――――→C 1酶和C X 酶纤维二糖―――――――→葡萄糖苷酶葡萄糖特别提醒 除自然环境中存在的分解纤维素的微生物外，在草食性动物牛、马、羊等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，其可产生纤维素酶分解纤维素，而人体没有分解纤维素的能力。
2．纤维素分解菌的筛选 (1)方法：--------------。
①方法一：先培养------------，再加入-------------进行颜色反应。
②方法二：在------------时就加入刚果红。
特别提醒 方法一需要用NaCl 溶液洗去培养基表面浮色后，再进行观察，方法二不需要。
(2)原理纤维素＋刚果红→红色复合物↓纤维素酶纤维二糖和葡萄糖，不能和刚果红形成红色复合物 ↓以--------------心的透明圈1．如何设计实验证明纤维素酶能分解纤维素？提示 设计对照实验。
取两支试管，分别加入等量的滤纸条和缓冲液，在一支试管中加入纤维素酶，另一支试管中加入等量蒸馏水，振荡反应一段时间后，可观察到加入纤维素酶的试管中滤纸条被水解，而加入蒸馏水的试管中滤纸条没有变化。
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分解纤维素菌种的筛选
张 功 峥 嵘
(内蒙古师范大学生物系)
摘 要:本文通过平皿分离、摇瓶培养
、固态发酵等步骤,从8种微生物中筛选出分解纤维素能力和蛋白质合成能力强的菌种——毛壳菌。
关键词:分解纤维素;菌种;筛选
我国每年的农作物秸杆如麦秸、稻草、玉米秸、高梁秸、豆秸等约8亿吨之多〔1〕。
这些秸杆饲料中粗纤维的主要成份是木质素、纤维素、半纤维素和果胶物质,它们都属于家禽、家畜难以直接消化或消化率低的粗纤维物质〔2〕。
本研究的目的是筛选出不仅能分解纤维素,且可提高蛋白含量的菌种,利用简单、经济、可操作性强的微生物发酵技术,将纤维素物质转化成糖和蛋白质,提高秸杆的营养价值,开辟秸杆利用的新途径。
1 材料和方法111 材料
11112 供试秸杆:新鲜、无霉变晒干后的玉米秸杆
和小麦秸杆。
11112 供试菌种:部分由中科院微生物所菌种保藏
中心购得,另一部分由本实验室提供,包括:绿色木霉〔T richoderm a viride Pers .ex F r .〕、白地霉〔Geo trichum candidum L ink 〕、藤仓赤霉〔Gibberel 2la fu jiku ro i
(Ss w .)W o llenw 〕、球毛壳菌
〔Chaetom ium globo sum kunze ex Fx .〕
、紫孢侧耳〔P leu ro tu s sap idu s (Schu l 2.)Sacc 〕
、纤维单胞菌〔Cellu lom ono s 〕、黑曲霉〔A sp ergillu s n iger 〕、匍匐青霉〔Pen icillium decum ben s 〕。
11113 培养基:a 1平皿中培养基以羧甲基纤维素
钠(C M C —N a )代替查氏培养基中碳源蔗糖,其余配方不变;b 1摇瓶培养基:(N H 4)2SO 4215g ,KH 2PO 4015g ;K 2H PO 4014g ,M gSO 40105g ,玉米秸杆粉3g ,
麸皮2g ,水150m l ,pH 自然;C 1固态培养基:50g 干料中90%的粉碎的秸杆粉,10%麸皮,(N H 4)2SO 45g ,KH 2PO 41g ,K 2H PO 40.8g ,M gSO 40.1g ,水150m l 。
其中供试秸杆有两种,即玉米和小麦
秸杆。
2 方法211 平皿筛选
将平皿培养基倒入24个已灭菌的平皿,待凝固后,分别接入供试菌,每种菌接3个平皿,置于恒温培养箱30℃培养3～5天后,用刚果红染色,再用N aC l 稀溶液冲洗平板,能产生纤维素酶的菌落周围
会变成清晰的白色半透明圈。
分别观察平皿菌落周围水解C M C —N a 半透明圈直径的大小,结果见表1。
212 摇瓶培养
将供试菌种从平皿培养基上挑取,分别接入8个摇瓶培养基内,在32℃,摇床振幅8c m ,转速190r m in ,连续发酵培养72小时。
表1
半透明圈直径比较
单位:c m
绿色木霉藤仓赤霉白地霉球毛壳菌紫孢侧耳纤维单胞菌黑曲霉青霉
直径
211
114
115
210
214
112
113
214
213 固态浅层培养
接种量按固体培养料干重的10%,将每种供试菌摇瓶培养液接入2种已灭菌的固体培养料中,分别混匀后在浅盘中堆成4c m 厚,在31℃相对湿度90%条件下发酵5天。
214 发酵前后固体培养料的组分测定
6
7内蒙古科技与经济 2000年文献版
IGBT交—直—交变频器的分析
刘友谊
(内蒙古电力学校)
摘 要:介绍一种开关电容振荡器和新型功率器件1GB T构成的交—直—交变频器。
其特点是电压的频率和幅值变化范围宽,输出电压和电流为正弦波,电路结构简单易于控制。
关键词:绝缘型晶体管;变频器;振荡器
继SCR(Silicon Con tro lled R ectifier)后不断涌现出新型电力电子器件,且形成一个新型的电力电子器件大家族,其特点为集成化、高频化、全控化、电路弱电化、控制技术数字化及多功能化。
当今各种脉冲调制电路、零电流、零电压谐振开关电路以及高频斩波电路,已成为现代电力电子技术的重要组成部分。
这种新型电路主要作用是使零频率的直流量逆变成各种频率的交流量。
我们已知的电压型和电流型PWM(P lu se W idth M odu lati on脉宽调制)变频器,主要用于异步电动机调速系统,它具有调速特性好,效率较高等优点。
但对PWM电压型逆变压器来说,其输出电压为一系列脉冲波,含有许多高次谐波,而PWM电流型变频器的输出电流为阶梯方波,含有许多低次谐小波。
这些谐波成分会使电机的损耗和噪声增加,并会产生谐波转矩波动使电机发热。
为了减小输出电压、电流的谐波成分,PWM变频器靠增加脉冲波中的脉冲数来达到上述目的。
但这样会使变频器主电路中的开关元件工作频率增高,产生较大尖锋电压,因此必须附加电路来扼制,这便增加了电路的复杂性。
针对PWM变频器存在谐波问题,下面将提出一种由新型的IGB T(In su lated Gate B i po lar T ran2 sisto r绝缘栅门极晶闸管)交—直—交变频器。
IG2 B T是一种场效应与双极型晶体管的复合器件。
它具有场效应管的速度快、损耗低、安全工作区宽、电压控制等优点,又具有双极型晶体管导通压降小、电流大等优点,是一种大功率器件,它综合了GTR、M O S和FET器件各自的优点,而应用范围广。
1 主电路
如图(1)所示为新型变频器的主电路。
主电路主要由功率器件IGB T构成,二级管用来限制加在IGB T栅—射极间的反向电压。
分别测定2种固体培养料发酵前后粗纤维和粗蛋白含量,发酵前玉米秸杆固体培养料粗纤维含量为27186%,粗蛋白含量为7108%;小麦秸杆固体培养料粗纤维含量为26150%,粗蛋白含量为7186%。
经过5天,8种不同微生物发酵后,2种固体培养料粗纤维和粗蛋白含量变化见表2和表3。
3 结果分析
据上述试验结果,不难看出,藤仓赤霉、白地霉、纤维单胞菌和黑曲霉对秸杆物质的降解率并不高,纤维素酶分泌量不大。
虽然白地霉蛋白合成较强,但不能单独作为秸杆饲料发酵菌。
绿色木霉和青霉虽然有较强的分解纤维物质能力,但菌丝布满培养料后不久便产生大量分生孢子,影响动物饲料的适口性。
紫孢侧耳虽然降解纤维素物质能力最强,但发酵所需时间较长,增加生产成本。
而球毛壳菌没有上述菌种的弊端,不失为秸杆饲料发酵的优选菌种之一。
表2 固态浅层发酵玉米秸杆料的粗纤维和粗蛋白含量(%)绿色木霉藤仓赤霉白地霉球毛壳菌紫孢侧耳纤维单孢菌黑曲霉青霉粗蛋白101591817182114141981101711918粗纤维22182419241722171919251324142313粗纤维降解率1811101611151814281591312131615 表3 固态浅层发酵小麦秸杆料的粗纤维和粗蛋白含量(%)绿色木霉藤仓赤霉白地霉球毛壳菌紫孢侧耳纤维单孢菌黑曲霉青霉粗蛋白8151011181118151519719816918粗纤维22112412231921162014241323192311粗纤维降解率1615817918181523118149151216
〔参考文献〕
〔1〕徐坚平、孔维等1微生物学报,1995,22(4)〔2〕陈华癸、樊庆笙1微生物学1农业出版社,1972, 249
〔3〕石晶瑜、张功1分解纤维素菌H T3的筛选及酶活力测定1内蒙古师大学报,1998,27(1),66～68收稿日期:2000年6月11日
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2000年文献版 内蒙古科技与经济。