大鼠海马神经元原代培养

新生鼠海马、皮层神经元原代培养

新生鼠海马、皮层神经元原代培养实验材料1. 实验动物新生Wistar大鼠，当天出生（<12 h）的乳鼠，SPF级。

2. 试剂Hibernate ANeurobasal AB27 serum-free supplementsPapin （木瓜蛋白酶）DNAase IOptiPrep Density Gradient MediumPoly-L-lysine （多聚赖氨酸）L-glutamine （L-谷氨酰胺）Penicillin （青霉素）Streptomycin （链霉素）D-Hank’s solutiondd H2O3. 溶液配制1. 多聚赖氨酸：取多聚赖氨酸25 mg，用双蒸水溶解并稀释浓度为50μg/ml，用0.2 μm的微孔滤膜过滤，4 °C保存备用。

（可配成25×）2. 解剖液：HA：含0.5mM L-谷氨酰胺的Hibernate A，0.22μm微孔滤膜过滤，4°C保存备用。

3．Papin：用HA配制含Papin 2mg/mL的消化液，37°C孵育20~30min，0.22μm 微孔滤膜过滤，冰上保存至实验。

在使用前3h内配制。

4．DNAase I：取DNAase I粉末用D-Hank’s液配制成50μg/mL，0.22μm微孔滤膜过滤。

可一次配好，-20°C保存，每次取用。

4．终止消化液：HABG：含2% B27的HA。

现用现配，37°C保存备用。

5．Optiprep离心介质：Optiprep medium∶HABG为124∶876，每离心管1~1.5mL。

5．种植液和培养液：Neurobasal-A/B27：含2% B27，0.5mM L-谷氨酰胺的Neurobasal-A。

现用现配，37°C保存备用。

4．实验方法1. 包被培养皿使用前2 d，在无菌条件下取6孔培养板，加多聚赖氨酸1 mL/孔，放置2 h，吸去多余多聚赖氨酸，自然干燥，灭菌水洗板2次，干燥备用。

新生大鼠海马神经元原代培养方法的优化与鉴定

新生大鼠海马神经元原代培养方法的优化与鉴定郭明星;陈浩宇;梁璐;张常娥【摘要】目的建立一种简单、高效、稳定的海马神经元原代培养方法,以获得高纯度、高活力的海马神经元.方法 24h内新生鼠,用含B27的Neurobasal无血清培养基培养,显微镜下观察神经元的生长状态,MTS法测定不同时间神经元细胞的活力,并用Tau-1和MAP-2抗体鉴定海马神经元的纯度.结果(①接种24h后,细胞完全贴壁,可见双突起和多个突起的神经元;72h后,海马神经元胞体饱满,立体感较强,突起之间相互形成突触联系,神经元极性完全建立;5～6d的神经元,突起形成密集的神经纤维网络.②MTS法测定结果显示,在培养1～8d时间内,海马神经元随着培养时间的延长,活力增加,第8d细胞活性到达高峰,继续培养时,活力开始下降.③Tau-1和MAP-2免疫荧光检测神经元,海马神经元纯度达到(85.5±5.4)％.结论本实验方法简单易行,神经元纯度高、细胞活性好,且体外存活时间长,是神经疾病体外研究的良好细胞模型.【期刊名称】《湖北科技学院学报（医学版）》【年(卷),期】2016(030)004【总页数】6页(P284-287,290,封3)【关键词】海马神经元;无血清原代培养;方法;优化与鉴定【作者】郭明星;陈浩宇;梁璐;张常娥【作者单位】广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436;广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436;广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436;广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436【正文语种】中文【中图分类】R329在神经系统研究领域内，体外培养神经元细胞是研究神经元功能以及病理、生理变化的重要手段之一，在现代医学和神经科学中被广泛应用。

原代神经元[1]直接来源于动物脑组织，在形态和生理功能上都能较好的模拟动物的体内细胞，得出的数据结果更加真实可信，与神经细胞系相比，它们能提供准确的生物学信息，并且它具有机体干扰少，影响因素单一，结果容易分析等优点。

原代培养海马神经元经验-(重医舟之行)

原代培养海马神经元经验一、常规的试剂配制：1、培养基：选用高糖型DMEM/F12 (1:1)培养基干粉（含15 mmol Hepes），每升培养液中加入碳酸氢钠1.8 g，调节pH值7.0，0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后，加入谷氨酰胺、无菌的青霉素和链霉素液，使其终浓度分别为0.5 mmol/L 、100 U/ml和100 μg /ml，分装后置于4℃保存，临用前加入2%的B27。

神经细胞代谢旺盛，选用高糖型培养基；谷胱甘肽可保持培养基还原状态，营养成分稳定；B27是公认的刺激神经元生长的营养因子，不过价格挺贵；PH值很关键，Hepes 是优秀的缓冲系统，pH值调好后能保持很长时间；2、多聚赖氨酸溶液的配制：称取1.5 mg L-多聚赖氨酸溶于100 ml PBS，0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，密封后置于4 ℃保存，可长期使用；3、磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：称取8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.85 g Na2HPO4•12H2O和0.2 g KH2PO4充分溶于900 ml dd H2O，调节pH值为7.2，补dd H2O 至1000 ml并分装，高压灭菌（121～126 ℃），4 ℃备用；4、D-Hanks液的配制：称取KCl 0.4 g，KH2PO4 0.06 g，NaCl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，Na2HPO4•12H2O 0.08 g，溶于dd H2O中，调节PH值为7.2，定容至1000 ml，高压蒸汽灭菌（121～126 ℃），4℃备用；5、0.25%胰蛋白酶的配制：称取0.25 g胰蛋白酶粉末，少许D-Hanks溶液调成糊状，用D-Hanks定容至100 ml，混匀，冰箱内放置过夜，滤纸过滤后，0.22 m 微孔滤膜过滤，分装，-20 ℃保存。

二、试验操作过程：1、包被：培养前晚上将培养瓶（板）用多聚赖氨酸包被30 min，吸除，晾干,PBS洗三次,晾干，置于培养箱中备用；2、取脑：选取新生24 h的SD大鼠3只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，断头处死，无菌条件下分层剪开头皮、颅骨，用弯镊拉开脑区视野，小心取出全脑，D-hanks液洗数次；（预先准备至少4把眼科剪刀，分别用于断头、剪头皮和剪颅骨及第3步的剪组织这4个操作）3、分离：以脑中线为起点，小心拨开大脑颞叶皮层，暴露出新月状海马回，小心夹出海马组织，置于冰浴的D-hanks液中，仔细剔除微血管，用充分剪碎组织；4、消化：加入同体积0.125%的胰蛋白酶，瓶口用锡箔纸盖上，37 ℃培养箱内消化24 min左右，期间轻摇数次；过滤：加入3mL胎牛血清(海马种植液)终止消化，静止1~2min,吸出上清液，用种植液洗三次，每次用尖头吸管轻轻吹打细胞数分钟，至液体成米糊状即停止吹打，动作要轻柔，用150目网筛过滤，收集细胞悬液；5、接种：以1000 rpm离心5 min，倾去上清，海马种植液重悬细胞，轻轻吹打，台盼蓝染色快速计数，根据计数结果，调整细胞终浓度为1 00000个/ml，加入含终浓度为10%胎牛血清的种植液后接种于培养瓶（板）中，置于37 ℃、含5% CO2培养箱中培养；6、换液：接种后4~6h将培养液全量换成无血清B27+neurobasal培养液，(第48 h时加入终浓度为10 μmol/L的阿糖胞苷，以抑制非神经元细胞的过度生长，)随后每3 d半量换液。

胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定

胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【摘要】目的:建立胎鼠、新生鼠海马神经元体外培养方法.方法:分别取胎鼠、新生鼠海马,消化后种植,用含有2%B27的neurobasal培养液培养,第3天加入5 μmol·L-1的阿糖胞苷,换液后继续培养,以获得纯度较高的海马神经元.培养第3、7天观察细胞生长及突起情况,用neurofilament抗体以免疫荧光方法鉴定神经元细胞.结果:海马神经元种植24 h后贴壁,7天时神经元突起相互连接成网络.经neurofilament染色,培养细胞阳性率高,新生鼠原代培养海马神经元阳性率达(89±3.4)%,胎鼠海马神经元阳性率达(98±1.5)%.结论: 本方法培养出的胎鼠、新生大鼠海马神经元纯度较高,可作为海马神经元模型用于进一步研究.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2017(037)003【总页数】3页(P354-356)【关键词】海马神经元;细胞培养;胎鼠;新生鼠【作者】熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【作者单位】赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南卫生健康职业教育学院外科教研室,江西赣州 341000;赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南医学院;赣南医学院【正文语种】中文【中图分类】R285.5海马是大脑边缘系统重要部分，神经元分布高度集中，在认知、记忆、情绪、植物神经系统方面起着不可替代的作用[1-3]。

海马神经元体外培养模型已经成为研究神经元发育分化、神经疾病的发生机制的重要技术手段[4-6]。

海马神经元体外培养文献报道方法多样，动物来源主要有胎鼠和新生鼠，根据实验条件，我们摸索出了原代胎鼠、新生大鼠的海马神经元培养方法，并进行了细胞鉴定，获得了高纯度的胎鼠、新生大鼠海马神经元。

1.1 材料1.1.1 实验动物孕17天SD大鼠及出生24 h内的SD大鼠。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、neurobasal培养基、胎牛血清(FBS)和B27培养基添加剂(Gibco公司)、青链霉素、胰酶、多聚L赖氨酸(sigma公司)。

大鼠海马神经细胞体外原代培养与鉴定_孙琪

1 材料与方法
1.1 动物采用新生 24 h 内的 Wistar 乳鼠，SPF 级，由南方医科大学实验动物中心提供。 1.2 主要试剂及其配制 DMEM/F12 培养基、 Neu－ robasal 培养基、B27 均为 Gibco 公司产品；胎牛血清为杭州四季青生物工程公司产品；0.25 %胰蛋白酶、双抗、D-hank’s 液为 Genom 产品；多聚赖氨酸、L谷氨酰胺、 CY3 标记的羊抗小鼠 IgG、 DAPI 均为 Sigma 公司生产；10 %山羊封闭血清、抗体稀释液、小鼠抗 Map-2 均为武汉博士德生物工程有限公司生产；其他试剂均为国产分析纯。
L-谷氨酰胺：Sigma 公司生产。精密称取 L-谷氨酰胺 2.922 g，用 PBS 溶解，定容至 100 mL（200 mmol/L），充分搅匀后 0.22 μm 滤器除菌，按 1 mL 分装于无菌 EP 管中，封口后－20℃保存备用。使用
时每 100 mL 培养液加 1 mL 储备液，即终浓度为 2 mmol/L。
PBS：NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4·12H2O 2.89 g、KH2PO4 0.2 g，混合溶解后定容至 1000 mL，高温高压灭菌后，4 ℃保存备用。
多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine，PLL）：用 PBS 将多聚赖氨酸配制成 1 mg/mL 的储备液，0.22 μm 滤器过滤除菌，按 1 mL 分装，－20 ℃保存备用。使用时用 PBS 稀释 10 倍，即 0.1 mg/mL 浓度。
[4] 张群豪. 血清药理学在中药及复方研究中应用的评价[J]. 中国中西结合杂志，1996，16（3）：131.
[5] 王宁生，杨奎，雷燕. 关于血清药理学的若干思考[J]. 中国中西医结合杂志，1999，19（5）：263.

大鼠海马神经元无血清原代培养技术的建立

ＴｃｎｑｅＩＣＫｏｐｎ：ＮｓＩｙ —ｌｉｅＴｙａｌ、ｅｈｉｕ，ｙｔＪａ）Ｄａｅ、 —Ｌｙｎ、ｒｎｂｅＮｏａｓｐｕ
１１３主要仪器设备细胞培养皿（ｏｉｇＵＡ；Ｗ—Ｃ一．．Ｃｍｎ，Ｓ）ＳＪ２Ｄ型超净工作台（州安泰空气技术有限公司）ｃ２Ｆ苏：０细胞培养箱（ｈ１ａ，Ｓ）倒置相差显微镜（ＬＭＰＳＪｐｎ：ｓｅＬｂＵＡ；ＯＹＵ，ａａ）高速冷冻离心机（Ｌ６一Ⅱ型，安亭科学仪器厂）２０目Ｇ一１Ｇ上海：０不锈钢筛网：Ｈ计（十梅特勒一托利多公司）Ａｉｒｎ究型ｐ瑞：ｘｔ研ｏｏ显微镜（ＥＳ，国）弯头和直头眼科无齿镊、Ｚ￣德Ｓ；弯头虹膜镊、直
胞数的比例为神经元纯度。
２结果
２１原代培养大鼠海马神经元形态观察．
在倒置相差显微镜
下，刚种植的神经元呈圆形，积小，亮，体透单个均匀分布；培养２后开始贴壁；ｈ培养６ｈ后绝大部分细胞已贴壁，镜下光晕明显；２４后细胞全部贴壁，长出短小的突起：２１～２ｈ且第ｄ更换无血清培养基，细胞胞体呈梭形或锥形，带有突起的细胞数明显增多，背景中可见少数扁平状多边形的神经胶质细胞铺垫；３后神经元形状已很典型：体饱满，ｄ胞多呈梭形、形，锥少数呈多边形，胞浆丰富，大，仁隐约可见，起明显增长，景核核突背中仍然可见极少数扁平状多边形的神经胶质细胞铺垫。４ｄ后神经元胞体逐渐增大，突起延伸并逐渐成网，背景中几乎不见扁平状多边形的神经胶质细胞；ｄ后神经元突起密集联结成５网，经元胞体继续增大；ｄ后细胞开始互相迁移靠近，神６突起

大鼠脑海马神经元原代培养方法的建立及其纯度的鉴定

ｋｎｓｏｎｙｓｔｎｅｔａｈｕｎｉｎｕｉｆｔｅｃｌｒｄｎｕｏｓＲｅｕｔ：Ｔｅｎｕｏｓｃｌｒｄｂｈｗｉｄｎｉｄｆｅｚｍｅｏｉｖｓｉｔｔｅｑａｔｔａｄｐｒｙｏｕｔｅｅｒｎ．ｇｙｔｈｕｓｌｓｈｅｒｎｕｔｅｙｔｅｔｏｋｎｓｅ — ｕ
ｇｓｅｔａａｎｅｚｍｅａｄｃｌｕｅｔｅｒｂｓｌａｅｓａｉｉａｉｎａｄｓｆｔＯｉｒａｅｔｅｑｕｎｉｎｄｐｕｉｙｏｅｏ．ｅｔｄｗｉｐｐｉｎｙｎｕｔｒｄｗｉｈｎｕｏａａｒｔｂｌｚｔｏｎａｅｙＳｎｃｅｓｈａｔｔａｒｔｆｎｕｒｎｓｈｙ
ｔｅＮＹｅ，Ｓｉ—ｉｇ，ＺＮｏｇ，ＺＨＡＮＧｎ —ｈｅＥｕＵＱｕｘａＨＡＧＹｎｎ
（．ＡａｅｃＡｆｒＤｓｎｈｎａｇＭｅｉｌｏｌｅＳｅｙｎ１０４ｈｎ；２ｅａｔｅｔｆＨｓｌｙａｄＥｒｌｙ１ｃｄｍｉｆｉＭｉ，Ｓｅｙｎｄｃｌｇ，ｈｎａｇ１０３，Ｃｉａ．Ｄｐｒｎｉｏｏｎｍｂｙｏ）ａｓｏａＣｅｍｏｔｇｏｇ
（．沈阳医学院教务处，辽宁沈阳１０３１１０４；２基础医学院组织与胚胎学教研室）．
［摘要］目的：为建立一种稳定的大鼠胎鼠海马神经元培养方法并能够有效的鉴定其纯度。方法：分离Ｗｉａ大鼠胚胎并ｓｔ取海马组织，比较两种常用酶，胰酶和木瓜酶消化效果对海马神经元产量的影响及两种不同培养方法对海马神经元纯度的

原代神经元培养

神经细胞原代培养从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。

一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。

由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。

器皿：1)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，2)用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。

3)培养瓶、盖玻片4)培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。

凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。

5)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。

6)塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。

辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。

2. 培养基和培养用液的配制1) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。

本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。

2) 平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。

各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。

3) 培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。

神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。

目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。

4) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。

分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。

5) 胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。

先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。

用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。

SD大鼠海马神经元原代培养及形态学观察

ＫｅｙｗｏｒｄｓＨｉｐｐｏｃａｍｐａｌｎｅｕｒｏｎ；Ｐｆｉｍａ￣ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ；ＨＥｓｔａｉｎｉｎｇ
海马锥体神经元是海马区的主要成分，主要功能是参与近期记忆、情绪及内脏功能调节，是老年性痴呆、癫痫等疾病的主要病变部位¨Ｉ２Ｊ。原代培养神经元能建立一个很好的体外神经元活动实验模型，具有影响因素单一、机体干扰因素少和结果易分析等优点。从细胞和分子水平上深入研究海马神经元的物质代谢、生理、药理及形态特征，海马神经元原代培养是一个必不可少的前提条件Ｊ。１材料与方法１．１试剂胰蛋白酶（Ｓｉｇｍａ）、Ｂ２７、胎牛血清（ＰＡＡ）、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｏｃｏ）。小鼠抗大鼠ＭＡＰ一２单克隆抗体
Ｎｉｓｓｌｂｏｄｉｅｄｗｅｒｅｉｎｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｎｅｕｒｏｎｓａｒｅｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ，ａｎｄａｒｅｐｏｓｉｔｉｖｅｉｎＭＡＰ一２，ａｓｗｅｌｌａｓＮＳＥｓｔａｉｎｉｎｇ．
ＦｏｒＨＥｓｔａｉｎｉｎｇ，ｎｕｃｌｅｕｓａｎｄｃｙｔｏｐｌａｓｍａｒｅｂｌｕｅａｎｄｒｅｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＮｉｓｓｌｅｂｏｄｉｅｓａｒｅｉｎｃｙｔｏｐｌａｓｍａｎｄｓｅｌｄｏｍｉｎＮｅｕｒｉｔｅ．
ｂｏｄｉｅｓｗｅｒｅｔｒｉａｎ￣ｅ，ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓａｎｄｅｌｌｉｐｓｅｓｈａｐｅ．ＣｅｌｌｓｗｅｒｅｂｒｏｗｎｉｎＭＡＰ－２ａｎｄＮＳＥｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｔｈｅｐｕｒｉｔｙｄｅｇｒｅｅｏｆｎｅｕｒｏｎｓ

大鼠海马神经细胞原代培养技术的优化_张金波

大鼠海马神经细胞原代培养技术的优化张金波,王淑秋,朱金玲,罗佳滨,张淑红,金岳雷(佳木斯大学基础医学院,黑龙江佳木斯154007)摘要:目的:建立海马神经细胞原代培养技术。

方法:取新生1～3d 的W istar 大鼠,开颅,迅速分离出海马组织在H ank s 中剪碎,加入0.125%胰蛋白酶2mL 消化,胎牛血清终止消化,细胞计数后种植于多聚赖氨酸包被的6孔培养板中。

结果:神经细胞存活率高,纯度达90%以上,神经细胞生长良好。

结论:用此方法能成功获取大鼠海马神经细胞。

关键词:海马神经细胞;原代培养;胰蛋白酶中图分类号:Q 421;R 388　文献标识码:A 文章编号:1008-0104(2009)04-0020-02 海马锥体神经元是海马区的主要成分,主要功能是参与近期记忆、情绪及内脏功能调节,是老年性痴呆、癫痫等疾病的主要病灶之一[1]。

为了能在细胞水平和分子水平深入研究发育中海马神经细胞的生化、代谢、生理、药理及形态,建立海马神经细胞原代分散培养技术,越来越引起基础医学和临床医学的重视。

1　材料与方法1.1　动物与试剂实验动物:新生1～3d 的W istar 大鼠,由佳木斯大学实验动物中心提供。

主要试剂:N euralbasal 培养基、B 27培养基添加剂、青链霉素(Gibco 公司产品),胰蛋白酶、胎牛血清、多聚赖氨酸(Sigm a 公司产品),阿糖胞苷(上海华联制药有限公司)。

1.2　方法1.2.1　培养板的处理在取海马前一天,用35mm 孔径的6孔培养板,每个孔中加入0.1g L 的聚L -赖氨酸2mL ,静止30m in 除去溶液,用三蒸水冲洗3遍,放入二氧化碳培养箱内过夜待用。

1.2.2　培养方法取新生1～3d 的W istar 大鼠,用95%乙醇消毒,开颅,剥离脑膜,迅速分离出海马组织在H ank s 液中剪碎约1mm 3,然后离心500r m in ,5m in ,去掉H ank s 液,加入0.125%胰蛋白酶2mL ,消化约20m in (37℃、5%CO 2条件下),中间轻轻振摇2～3次,尽量去除胰酶,加入10%胎牛血清终止消化,离心500r m in ,5m in ,去上清,加入无血清培养基,用火焰刨光的玻璃吸管轻轻吹打数次,用200目的细胞筛过滤后,取0.1mL 按台盼蓝拒染法进行活细胞计数,制成5×105 mL 密度的细胞悬液,种植于多聚赖氨酸包被的6孔培养板中,每孔加2mL ,24h 后全量换无血清培养基。

大鼠海马神经元的培养及细胞培养注意事项

1.成年大鼠海马神经元的培养●步骤1.获得海马细胞◆大鼠乙醚麻醉，断头处理；◆迅速解剖海马组织，置于含有2ml 4℃的HibernateA/B27的35mm的培养皿中；◆随后将其移入含有同上培养基的培养皿，去除脑膜及多余的脑白质（？）；◆将海马移入组织切碎机冷处理台面上事先用HibernateA/B27润湿的滤纸上，沿海马长轴将组织切成0.5mm的薄片，随后将其移入含有5ml4℃的HibernateA/B27的离心管中；◆30℃震荡8min。

◆大吸管将其移入含有木瓜蛋白酶（预热至30℃）的离心管，置于170rpm的旋转平台（保持组织片悬浮状态），30℃水域温育30min；◆将海马组织切片移入15ml含有2mlHibernateA/B27的离心管中，30℃温育5min，吸管吹打10次（30s），静置2min，将上清移入另一离心管，重复上述步骤2次；2.梯度分离◆将细胞悬液加入Nycoprep gradient（4ml）的上方，室温，1900rpm，离心15min；去除最上方的碎片；吸管收集含有细胞的部分；用5mlHibernateA 稀释；第三层富含神经元；将第四层用2 ml B27:NeurobasalA重悬，1100rpm离心1min；3.盖玻片处理：50ug/mL多聚-D-赖氨酸（无菌水溶解）包被过夜，吸去多余的多聚赖氨酸，无菌水漂洗一次，自然干燥1h；4.◆细胞接种：以目标密度稀释于B27:NeurobasalA，以每盖玻片60到120 Ul接种，置于5% CO2:9% O2中孵育1h；◆将盖玻片移入24孔培养板中,每孔以0.4ml 37℃ B27/NeurobasalA漂洗一次，去除未贴壁细胞及细胞碎片；改用0.4ml的生长培养基；◆培养后4天，每3-4天更换一半培养基；新的培养基中的FGF2含量是远培养基的2倍；1.培养器皿的准备：1）溶液瓶——装配各种溶液——输液瓶；2）螺口瓶——血清或培养基；3）培养瓶——细胞培养——一般采用带螺口的，清洗时注意防止盖子中垫片的丢失；4）培养皿——细胞组织的分离、培养、染色——包括直径为30mm、60mm、120mm5）血球细胞计数板——细胞计数6）移液管——连接上手动（吸耳球）或电动负压吸取装置——在移液管尾部塞入少量脱脂棉；7）离心管——分离、漂洗、收集细胞——一般选用螺口带盖的；Eppendorf——塑料尖底带盖的离心管8）磁力搅拌器：用于神经细胞的分离机溶液的配置；最好配合使用可调温度的加热装置；可用高压蒸汽消毒。

大鼠脑海马神经元原代培养方法的建立及其纯度的鉴定

大鼠脑海马神经元原代培养方法的建立及其纯度的鉴定任玥;苏秋香;张勇;张庭深【摘要】目的:为建立一种稳定的大鼠胎鼠海马神经元培养方法并能够有效的鉴定其纯度.方法:分离Wista大鼠胚胎并取海马组织,比较两种常用酶,胰酶和木瓜酶消化效果对海马神经元产量的影响及两种不同培养方法对海马神经元纯度的影响.结果:培养的神经元胞体清晰晕光明显,应用两种不同的酶消化对神经元的产量影响无明显统计学意义,而应用无血清方法培养神经元在纯度上要优于应用阿糖胞苷去除神经胶质细胞的培养方法.结论:采用木瓜酶消化并用无血清培养的方法培养大鼠胎鼠海马神经元,稳定可靠,提高了原代神经元培养的产量和纯度.【期刊名称】《沈阳医学院学报》【年(卷),期】2010(012)004【总页数】3页(P203-205)【关键词】海马神经元;原代培养方法;木瓜酶;阿糖胞苷【作者】任玥;苏秋香;张勇;张庭深【作者单位】沈阳医学院教务处,辽宁,沈阳,110034;基础医学院组织与胚胎学教研室;基础医学院组织与胚胎学教研室;基础医学院组织与胚胎学教研室【正文语种】中文【中图分类】Q954.671977 年，Banker and Cowan［1－3］首次在体外成功的分离并培养了大鼠胚胎海马神经元。

此后随着研究的深入，胎鼠海马神经元的体外分离培养技术被不断的改进和提高。

但在原代培养中神经元的纯度和产量方面还存在一些急待解决的问题。

本研究采用了木瓜酶和胰酶消化的方法来比较神经元产量上的差异，并采用血清培养基加入阿糖胞苷和无血清培养基的培养方法比较其对胎鼠海马神经元纯度的影响。

旨在探讨一种高效、稳定的胎鼠神经元的原代培养方法，为中枢神经系统的研究提供理想的细胞模型。

1 材料方法1.1 实验动物孕18 d的SPF级Wista大鼠，由沈阳医学院实验动物中心提供。

1.2 主要化学试剂 DMEM/F12(Invitrogen)，Neurobasalmedium、B27 supplement(Gibco)，多聚赖氨酸 (Sigma)，阿糖胞苷 (Ara-C，Invitrogen)，L-谷氨酰胺 (L-Gin，Sigma)、庆大霉素(Gibco)，胎牛血清 FBS(Gibco)，马血清HOS(Gibco)，其他试剂均为国产分析纯。

电针血清对β淀粉样蛋白损伤原代培养大鼠海马神经元的保护作用

抗ＡＤ的神经毒性，减少神经元的凋亡。
关键词：电针血清；神经元；凋亡；ｐ淀粉样蛋白；阿尔茨海默病；大鼠
Ｄ０Ｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００５ — ５３０４．２０１３．１０．０１４
Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｅｃｔｓｏｆｅｌｅｃｔｒｏ — ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ（ＥＡ）ｓｅｒｕｍｏｎｐ — ａｍｙｌｏｉｄ
ｐｒｏｔｅｉｎ【Ａｐ）ｉｎｄｕｃｅｄｐｉｒｍａｒｙｒａｔｈｉｐｐｃａｍｐｌａｎｅｕｒｏｎｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅｒａｔｍｏｄｅｌｓｏｆＡｌｚｈｅｉｍｅｒ ’ ｓｄｉｓｅａｓｅｗｅｒｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｌａｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆＡＢ１－４０．ＡｆｔｅｒｔｒｅａｔｅｄｔｈｅｍｉｔｗｈＥＡ，ｔｈｅｓｅｒｕｍｗａｓ
ｆＴｏＣＭ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０１２０３．Ｃｈｉｎａ２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＮｅｕｒｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｇｈａｉＮｏ．９Ｐｅｏｐｌｅ＇ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０００１１，Ｃｈｉｎａ）

成年大鼠海马神经元培养衰老细胞的鉴定

成年大鼠海马神经元培养衰老细胞的鉴定摘要：目的：鉴定不同年龄大鼠培养海马神经元的衰老细胞鉴定。

方法：取6月龄和18月龄雄性SD大鼠海马进行原代海马神经元培养，分别在培养6d、10d和14d利用衰老相关的β半乳糖苷酶（Senescence associated β-galactosidase，SA-β-GAL）进行细胞化学染色。

结果：18月龄培养10d和14d的海马神经元SA-β-GAL染色较6月龄培养6d的海马神经元明显增多( p ＜0.001)。

结论：老年大鼠海马神经元体外培养进入衰老状态的时间较青年大鼠早。

关键词：海马神经元；衰老；衰老相关的β半乳糖苷酶衰老相关的β半乳糖苷酶（Senescence associated β-galactosidase，SA-β-GAL）是目前被广泛采用的一种生物学标记物，它在衰老细胞中表达升高，因此成为鉴定细胞衰老的一个标志［1，2］。

值得提出的是，有些衰老的生物学标记并不具有普遍性，SA-β-GAL作为一个衰老的生物学标记在体外检测复制衰老的细胞已经得到了广泛的认可［3］，但其是否能够用于检测衰老神经元，目前尚未得到证实，因此在应用上应加以验证。

目前对衰老细胞的研究，衰老细胞从形态学上表现为细胞变大，变扁平［4］，然而在除此以外还有端粒变短，细胞周期停滞等特征，而鉴于神经元属于静止细胞，因此在衰老细胞鉴定生物学标记的选择时具有特异性，本研究拟对培养不同天数的海马神经元进行SA-β-GAL染色，从而鉴定衰老的海马神经元，同时验证SA-β-GAL在海马神经元应用的可靠性。

1 材料与方法1.1 海马神经元原代培养分别取6月龄及18月龄雄性SD大鼠各2~3只，进行海马神经元原代培养。

取海马组织：全身75%酒精消毒，断头取脑，将整个脑组织置于冷的HBSS(无Ca2+Mg2+)平衡液中，利用弯头玻璃棒将两侧海马完整取出。

HBSS液洗4次，去除混杂的血管和血液。

胰酶消化：用剪刀将海马组织剪成1mm3的小块，用HBSS洗4次，0.25%的胰酶37℃消化15min。

原代细胞分离培养鉴定4(SD 大鼠骨骼肌卫星细胞、海马神经元细胞)

骨骼肌
由骨胳肌细胞构成的一种肌组
b
织，是横纹肌的一种。大多数
骨胳肌都附着于骨上，是体内
数量最多的组织，在人体中占
体重的40%。
a
骨骼肌卫星细胞
肌卫星细胞指的是骨骼肌中除骨骼肌纤维（肌细胞）外的一种扁平、有突起的细胞。是位于肌肉纤维膜和基底膜之间的一种单核细胞，是动物出生后的骨骼肌的生长和再生的主要细胞来源。
IF：细胞核内 MAP2阳性表达（红色荧光）
MAP2在中枢神经系统神经元细胞体和树突特异性表达，而在AS（星形胶质细胞）及少突胶质细胞中不表达，是目前公认的神经元特异性标志物。
13
14
早期卫星细胞（分化据-SMA（Red）均在胞浆中表14达，有强有弱。
8、SD大鼠海马神经元细胞的分离
目的与意义
神经元细胞原代培养是体外研究神经系统疾病的重要手段之一，也是对神经系统损伤进行细胞分子水平研究的基础。因此，建立良好的神经元细胞体外培养模型，对研究神经系统疾病，特别是在神经元发育、损伤和修复中的作用尤为重要。海马是大脑边缘系统的重要组成部分，参与个体学习、记忆及情绪反应等多种生理功能，与新生儿缺血性脑损伤及多种神经、精神疾病的发生密切相关。
快收缩肌的3-4倍）；
3、采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶二步消化法，卫星细胞位于肌束的浆膜和基底膜之间这种特殊位置使其能抵抗一般
消化酶的作用，Ⅰ型胶原酶只能消化肌束之间的连接，起到分离肌束的作用，而不能分离肌束上的卫星细胞，只有胰蛋白酶才有此能力；
4、消化时间不宜过长，应控制在30min内，可以提高细胞存活率与贴壁率。采用胰蛋白酶分步消化法，多次消化，及时收集消化下来的细胞，既可以保证肌组织的充分消化，又可以避免蛋白酶对已消化下来的细胞的进一步损伤，以提高卫星细胞的活性；

阿糖胞苷对大鼠海马神经元原代培养的影响

阿糖胞苷对大鼠海马神经元原代培养的影响张余;刘英富;陈旭义;涂悦;梁冰;徐忠伟;赵永青【摘要】目的:探讨在大鼠海马神经元原代培养过程中,阿糖胞苷对培养神经元的影响.方法:将新生24h大鼠,分离出海马组织,进行原代海马神经元培养,再将细胞分为阿糖胞苷组和对照组,阿糖胞苷组加入1 μmol/L阿糖胞苷,通过检测神经元特异性标志物微管相关蛋白-2(Map-2)计算培养神经元的数量,通过台盼蓝染色法观察细胞的存活率.结果:培养第7天,阿糖胞苷组神经元数量为(11±3)个,对照组为(10±4)个,两组无明显差异;阿糖胞苷组神经元细胞在培养第14天时存活率为74％,培养第21天时存活率为49％,而对照组神经元14天时存活率为96％,21天存活率为88％,两组神经元存活率差异明显.结论:原代培养海马神经元时,阿糖胞苷对神经元产量及形态影响不明显,但是由于阿糖胞苷的毒性作用,明显缩短神经元的存活时间,影响长期培养神经元的存活率.【期刊名称】《中国应用生理学杂志》【年(卷),期】2016(032)003【总页数】4页(P218-220,224)【关键词】海马神经元;原代培养;阿糖胞苷;大鼠【作者】张余;刘英富;陈旭义;涂悦;梁冰;徐忠伟;赵永青【作者单位】天津中医药大学,天津300193;武警后勤学院附属医院细胞生物学与医学遗传学教研室,天津300162;武警后勤学院附属医院脑系科,天津300162;武警后勤学院附属医院脑系科,天津300162;武警后勤学院附属医院脑系科,天津300162;武警后勤学院附属医院中心实验室,天津300162;武警后勤学院附属医院神经内科,天津300162【正文语种】中文【中图分类】R363【DOI】10.13459/ki.cjap.2016.03.007海马神经元培养主要用于以细胞为基础的各种脑区形态学和生理学研究［1］。

在神经元原代培养的过程中会发生一系列形态的变化，包括轴突发芽和生长，突起的分支，建立突触。