肿瘤细胞培养技术-林星石
细胞培养相关技术
培养细胞活力测定
台盼蓝法，trypan blue， 利用染料会渗 入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜 完整，染料无法渗入而不会呈色。用活 细胞占细胞中的百分比表示细胞活力
MTT法
转染 (Transfection)
将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸 在细胞内维持其生物功能
常特指将质粒或以它们为载体构建的重组子导入真 核细胞的过程。
克隆培养（clonal culture），将高度稀释的游离细胞悬 液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经 过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆 （clone）。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个 祖先细胞。
群体培养（左）和克隆培养（右）
培养细胞生长的条件
无污染环境: 生物安全柜，超净工作台
一般说来，含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞 不死，但支持细胞生长一般需加 10％血清。
常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血 清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。
优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、 支原体、病毒污染。
血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟 血清的消毒：过滤除菌
80％一95％ 5％一20％
2.0 g/L 各100单位／毫升
细胞培养基本方法（无菌原则）
无菌工作台用75%酒精擦拭干净，紫外线照射40分钟以 上。
清洗双手及手腕，戴乳胶手套，然后用75%酒精擦拭。 操作时注意无菌台内空间层次。整个操作过程尽量在无
菌台靠里面一点。手及物品不要在暴露的瓶口上方来往， 严格注意无菌操作。
5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。 低速离心10分钟。 去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。
FCGR3A基因多态性对西妥昔单抗介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用杀伤A549细胞的影响
FCGR3A基因多态性对西妥昔单抗介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用杀伤A549细胞的影响李瑾昱;朱艳云;张国庆;孙胜杰;焦顺昌【摘要】目的探讨FCGR3A基因多态性对西妥昔单抗介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒(ADCC)作用杀伤A549细胞的影响.方法选取肺腺癌A549细胞作为靶细胞,NKTm细胞为效应细胞.基因测序法检测NKTm细胞FCGR3A基因多态性,CCK-8法检测西妥昔单抗介导NKTm细胞的ADCC活性.结果 NKTm细胞FCGR3A具有基因多态性,分别为V/V、V/F及F/F表型.西妥昔单抗介导3种表型的NKTm细胞的ADCC活性差异具有统计学意义(P =0.0015),其中FCGR3A-158V/V表型的NKTm细胞的ADCC活性比V/F及F/F表型强(P＜0.01),而V/F 与F/F表型的NKTm细胞ADCC活性差异无统计学意义(P＞0.05).结论西妥昔单抗介导的NKTm细胞ADCC活性与FCGR3A基因多态性有关.【期刊名称】《中国医学科学院学报》【年(卷),期】2015(037)006【总页数】5页(P645-649)【关键词】西妥昔单抗;A549细胞;FCGR3A;抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用【作者】李瑾昱;朱艳云;张国庆;孙胜杰;焦顺昌【作者单位】中国人民解放军总医院肿瘤内一科,北京100853;中国人民解放军总医院肿瘤内一科,北京100853;中国人民解放军总医院肿瘤内一科,北京100853;中国人民解放军总医院肿瘤内一科,北京100853;中国人民解放军总医院肿瘤内一科,北京100853【正文语种】中文【中图分类】R735.5Acta Acad Med Sin，2015,37(6)：645-649西妥昔单抗是一种人源化IgG1抗体类药物，通过与肿瘤细胞膜上的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)结合，阻断自身配体介导的EGFR信号传导通路活化，达到抑制肿瘤的作用。
肿瘤细胞培养技术-林星石
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肿瘤细胞in vitro的特点
细胞保持永生性：自我复制 形态学：大小不一 逐渐一致 增殖力更强：DNA合成期、分裂期达50% 突变性：不同于正常细胞，失去稳定的控制高分化
变低分化 表面性状：负电荷数量>正常，贴壁性，抗原性可
变异 接触抑制减弱或消失： 悬浮生长特征： 成瘤性：移植到动物体内可成瘤
与常规细胞培养技术相同 一个细胞群体，存在多种亚群，复杂性 建株细胞较正常细胞易于培养
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细胞分裂增殖的调控 （细胞周期）
多种基因的协同作用 调控因子：
基因：Cdc2、 cyclin 蛋白磷酸化 蛋白激酶的调控 胸苷激酶的调控 负调：DNA损伤与DNA修复：抑制抗性
肿瘤细胞
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细胞间的相互影响
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培养液特殊添加剂
常用的促细胞生长因子及使用的终浓度
添加剂
终浓度
添加剂
终浓度
BSA transferrin insulin 氢化可的松
10-5mol/ml 5-10 g/ml
5 pg/ml 10-5mol/ml
EGF FGF NGF
5ng/ml 5ng/ml 5ng/ml
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肿瘤细胞的培养
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技术-培养
原代培养：去除纤维细胞及淋巴细胞， 防止细菌、真菌污染。
传代培养：增殖力低的细胞需要饲养 细胞适当密度, 基本长满后 传代, 前10代不稳定，注意 培养条件，适当调整培基。
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技术- 鉴定与建株
鉴定：组织来源 、形态特征、核型染色体分 析、生长特性、对细胞因子的反应（TNF)、 集落形成、致瘤实验（裸小鼠）
肿瘤组织制备单细胞研磨操作流程_概述及解释说明
肿瘤组织制备单细胞研磨操作流程概述及解释说明1. 引言1.1 概述肿瘤是世界范围内威胁人类健康的重大疾病之一。
近年来，随着单细胞技术的不断进步和发展，越来越多的研究者开始关注肿瘤组织中单个细胞的分析与检测。
通过对肿瘤组织制备单细胞研磨操作流程的深入研究，我们可以更好地理解肿瘤的异质性、复杂性以及发生机制，为治疗策略提供更准确的依据。
1.2 文章结构本文将围绕肿瘤组织制备单细胞研磨操作流程展开详细论述。
首先，在引言部分进行概述并介绍文章结构；接下来第二部分将详细介绍肿瘤组织制备单细胞研磨操作流程的具体步骤和所需材料和设备准备；第三部分简要概述相关的单细胞分离及检测技术；第四部分将涵盖操作中需要注意的事项以及解决常见问题的方案；最后在结论和展望部分总结研究成果，并展望未来的发展方向。
1.3 目的本文的目的是提供一个系统全面的肿瘤组织制备单细胞研磨操作流程的概述和解释说明，帮助读者了解该操作流程的核心内容和步骤。
通过本文，读者将能够掌握肿瘤组织制备单细胞研磨操作流程并了解其在单细胞分析中的应用前景和挑战。
2. 肿瘤组织制备单细胞研磨操作流程:2.1 流程简介:肿瘤组织制备单细胞研磨操作流程是一种常用的方法，用于将肿瘤组织样本转化为可用于单细胞分离和分析的细胞悬液。
该方法利用机械力对肿瘤组织进行均匀破碎，使得细胞能够以单个的形式存在于悬液中。
随后，可以使用不同的技术对这些单个细胞进行进一步的分离和检测。
2.2 材料和设备准备:在执行肿瘤组织制备单细胞研磨操作流程之前，我们需要确保准备以下材料和设备：- 新鲜的肿瘤组织样本- 组织切片工具（例如手术刀或镊子）- RNAase防护剂（可选）- 组织及液体收集器皿- 1x PBS溶液（含钙和镁）- 离心管- Vortex混合器- 显微镜2.3 研磨方法与步骤:下面是肿瘤组织制备单细胞研磨操作流程的步骤：步骤1: 准备工作台和实验室安全设施，确保清洁无菌的操作环境。
医院重点学科建设：血液学与造血干细胞移植
血液学临床研究与
03
应用
各类血液疾病诊疗技术
贫血的诊疗技术
包括缺铁性贫血、巨幼细胞性贫血、 再生障碍性贫血等各类贫血的诊断和 治疗技术。
白血病的诊疗技术
涵盖急性白血病、慢性白血病等不同 类型的白血病的诊断、分型、预后评 估和治疗技术。
淋巴瘤的诊疗技术
涉及霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤 等各类淋巴瘤的诊断、分期、治疗及 并发症处理技术。
与临床医学学科的协同合作
与内科学、外科学、儿科学等临床医学学科紧密合作，共同开展血 液疾病的临床诊断和治疗研究。
与药学学科的联合研发
与药学学科合作，共同研发新型药物和治疗手段，提高血液疾病的 治疗效果。
国内外合作与交流渠道拓展
01
02
03
国际合作与交流
积极与国际知名血液学研 究机构和专家建立合作关 系，开展国际合作项目， 共享研究资源和成果。
。
02
新型免疫抑制药物的研发与应用
探索新型免疫抑制药物，提高移植成功率和患者生存率。
03
个体化预处理方案制定
根据患者具体病情和移植类型，制定个体化的预处理方案，提高治疗效
果。
移植后并发症防治策略
01
感染并发症的预防 与治疗
加强消毒隔离措施，应用广谱抗 生素和抗病毒药物，降低感染发 生率。
02
移植物抗宿主病的 监测与治疗
优秀人才引进
积极引进国内外优秀的血液学专家和跨学科人才，提升学科整体 实力和研究水平。
团队建设与激励机制
加强学科团队建设，建立激励机制，鼓励团队成员积极创新、合 作和进取。
Hale Waihona Puke 政策支持与资源整06
合利用
政府相关政策解读及支持情况介绍
细胞培养及抗肿瘤药物筛选
细胞培养及抗肿瘤药物筛选博哥(中山大学化学与化学工程学院，广州510275)一引言随着分子生物学和细胞生物学的崛起，为了在活细胞中研究生命现象，细胞培养方法得到了广泛的发展和应用。
细胞培养的突出优点，是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长、发育和分化等的影响。
因为人工培养条件易于改变，并能得到严格的控制，有利于单因子分析。
另外，细胞培养还便于我们对细胞生长、发育过程的观察，可以用显微镜直接观察亦可应用显微缩时电影技术记录其进程。
因而，细胞培养是探索和解释细胞生命活动规律的一种简而易行的技术。
然而，细胞培养方法也有其局限性，由于培养的细胞生活在脱离了机体的复杂的环境条件下，其生态环境和细胞之间的相互关系都改变了，因此，其细胞生物学性质必然也会发生某些改变。
所以在人工培养条件下观察到的结果难于正确反映细胞或组织在机体内部的状况。
这一点是我们在应用此技术进行研究时应该注意的。
本实验采用的培养基由合成培养基、小牛血清配和双抗制而成。
实验对Hela细胞进行了复苏、传代培养、观察不同状态下的Hela细胞，并用MTT法测定8种药物的抗癌作用。
二、实验原理1．培养基的配制组织培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。
合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。
其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。
它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。
小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必须的生长因子、激素、粘附因子等，这是合成培养基所无法替代的。
此外它还能中和有毒物质的毒性。
故一般体外培养细胞时要加入一定量的小牛血清(10％-20％)。
在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。
通常是青霉素和链霉素联合使用(双抗)。
培养液内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。
2．细胞的冻存与复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。
肿瘤干细胞的悬浮培养方法[发明专利]
![肿瘤干细胞的悬浮培养方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/92a4555549d7c1c708a1284ac850ad02de8007a5.png)
(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.10.16C N 103352027 A (21)申请号 201310163367.0(22)申请日 2013.05.07C12N 5/095(2010.01)C12N 5/02(2006.01)(71)申请人中国人民解放军第二军医大学地址200433 上海市杨浦区翔殷路800号(72)发明人刘善荣 肖潇 胡晶晶(74)专利代理机构上海元一成知识产权代理事务所(普通合伙) 31268代理人赵青(54)发明名称肿瘤干细胞的悬浮培养方法(57)摘要本发明属于现代生物技术之细胞培养技术领域。
本发明的目的是提供一种肿瘤干细胞的悬浮培养方法，可通用于不同组织来源的肿瘤细胞的培养，而且该培养方法获得的肿瘤干细胞具有自我更新能力、且富集。
本发明提供的一种肿瘤干细胞的悬浮培养方法，是将所需要培养的肿瘤细胞消化离心收集后，用PBS 重悬离心，加入本发明制备的悬浮培养基中，吹打成单细胞悬液，再接种于铺制好的超低吸附培养皿中；进行细胞培养。
本发明的方法体外培养各类肿瘤细胞的成球率高，表达多能性因子，OCT4、NANOG 比例都有所增高，为肿瘤干细胞的研究提供了丰富而全面的实验材料，在基础研究及临床应用上都具有广泛的前景。
(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书6页 附图3页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书6页 附图3页(10)申请公布号CN 103352027 A*CN103352027A*1/1页1.一种肿瘤干细胞的悬浮培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：A、超低吸附培养皿的铺制（a）超低吸附胶的制备：聚甲基丙烯酸2-羟乙脂，用95%的酒精混匀，终浓度为12mg/ ml；（b）用移液器将超低吸附胶覆盖于培养皿底部，吸干残余胶，终密度为0.8mg/cm2，吹风至完全干燥，紫外照射1小时备用；（c）避光干燥通风保存1-2个月；B、悬浮培养基的制备（a）在超净工作台内向基础培养基DMEM/F12中加入胰岛素样生长因子IGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、表皮生长因子EGF，吹打混匀；所述的IGF浓度为10-30ng/ml，bFGF 浓度为1.0-3ng/ml，EGF浓度为20-30ng/ml，浓度均相对于基础培养基DMEM/F12而言；（b）4℃避光保存1-2个月；C、细胞培养将所需要培养的肿瘤细胞消化离心收集后，用PBS重悬离心5-10分钟，2-3次，加入步骤B制备的悬浮培养基，吹打成单细胞悬液，接种于步骤A铺制好的超低吸附培养皿中；培养从开始起每三天收集全部培养基，离心换一次新鲜的各类培养基，培养时间是7天，7天后用accutase消化酶，轻轻吹打消化成单细胞进行1:2传代，重复前述操作进行传代培养过程；培养环境：温度为35-38℃、CO2浓度为5-8%、湿度为饱和湿度。
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培养技术 - 取材
手术标本 活检标本 胸腹水穿刺 细针头穿刺 内窥镜活检
关键：新鲜、无菌、及时、准确
技术- 分离纯化
分离：剪碎、酶消化、Ficoll、Percoll等 密度沉降分离
纯化：反复贴壁去除成纤维细胞 自然淘汰去除正常细胞 利用特异抗原标志筛选法( panning) 分亚型 流式细胞仪分选 克隆建株 高转移株的建立：反复接种
激情素
-
助黏附
维生素A
抑制生长及分化
____________________________________
调整培基中的成分可调控细胞的生长与分化
影响培养肿瘤细胞生长的因素
PH 营养：如血清效价低 细胞生长因子的自分泌及旁分泌 癌基因抑癌基因的变化 排泄废物的影响 细胞外基质的作用 细胞相互间的作用 污染
单克隆抗体的制备方法
抗原：纯度、分子量。 1. 细胞1~2107 2. 可溶性蛋白质抗原10 ~100 μg
动物：BALB/C鼠，周龄：6~8周，雌性 佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、脂质体
免疫方法
1.常规免疫：腹腔或颈部多点皮下 0 天：基础免疫—抗原+完全佐剂 15天：基础免疫—抗原+不完全佐剂 30天：基础免疫—抗原+不完全佐剂 45天：追加免疫—同量抗原 48天：进行细胞融合
肿瘤细胞DNA合成途径：
叶酸衍生物
氨基酸、小分子化合物合成DNA
HGPRT -TK
次黄鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 胸腺嘧啶核苷激酶
核苷酸前体
单克隆抗体的制备
HAT特点：“A”— 叶酸拮抗物 骨髓瘤-骨髓瘤：DNA合成途径阻断；缺HGPRT，
不能利用“H”—死亡。 脾细胞-脾细胞：有HGPRT，缺增殖能力—死亡。 骨髓瘤-脾细胞：HGPRT+无限增殖能力— 存活。
常用的促细胞生长因子及使用的终浓度
添加剂
终浓度
添加剂
终浓度
BSA transferrin insulin 氢化可的松
10-5mol/ml 5-10 g/ml
5 pg/ml 10-5mol/ml
EGF FGF NGF
5ng/ml 5ng/ml 5ng/ml
肿瘤细胞的培养
与常规细胞培养技术相同 一个细胞群体，存在多种亚群，复杂性 建株细胞较正常细胞易于培养
RPMI1640：最常用，+10~20%FCS，上皮 性 或悬浮性（+0.03%谷氨酰胺）
DMEM：常用 F12： 适用于上皮性癌，如肝癌， L-15： 注意：+2g/L NaHco3 或
+20mmol/L HEPESpH7.2 RPMI1640+F12或L-15（1:1）：适用肉瘤
培养液特殊添加剂
免疫方法
备注： 1. 细胞、细菌、病毒等颗粒性抗原有较
强抗原性，可不加佐剂，直接腹腔注射。 2. 可溶性蛋白质抗原需加佐剂。 本研究室经验：
免疫方法
2. 脾内免疫： 2.1 0 天：基础免疫
15 天：脾内免疫 18 天：细胞融合 2.2 0 天：脾内免疫
4 天：细胞融合
免疫方法
脾内免疫 优点：时间短，使用抗原量少。
1975年Kohler 和 Milstein 首先利用细胞融 合技术制备了永久分泌单克隆抗体的杂交瘤 细胞株。
单克隆抗体的制备
特点：肿瘤细胞易体外培养和长期生长； B淋巴细胞 分泌特异性抗体； 二者杂交融合杂交瘤，继承二者性质。 HAT培基：H—次黄嘌呤、 A—氨基蝶呤 T—胸腺嘧啶核苷
单克隆抗体的制备
单克隆抗体的制备
单克隆抗体的制备
基本原理：Bunet抗体选择学说，每个B细 胞只能够产生一种针对它的特异性抗原决定 簇的抗体。从一个祖先B细胞分裂繁殖形成 的纯细胞系，称为克隆。
单克隆抗体的制备
单克隆抗体定义：来自克隆系的细胞基因完 全相同，产生的抗体完全相同。这种从一株 克隆系产生的抗体 — 单克隆抗体（McAb)。
肿瘤细胞培养技术
解放军总医院免疫Βιβλιοθήκη 林星石研究员Histroy
肿瘤类型：间充质 上皮 神经外胚层 造血源性（1955-1958-1963-1965）
In vitro: 原代 传代 建系（1967-1970） 配基成分：纯血清 含血清 无血清 生物学特性：细胞 亚细胞 酶和分子
肿瘤细胞in vitro的特点
技术-培养
原代培养：去除纤维细胞及淋巴细胞， 防止细菌、真菌污染。
传代培养：增殖力低的细胞需要饲养 细胞适当密度, 基本长满后 传代, 前10代不稳定，注意 培养条件，适当调整培基。
技术- 鉴定与建株
鉴定：组织来源 、形态特征、核型染色体分 析、生长特性、对细胞因子的反应（TNF)、 集落形成、致瘤实验（裸小鼠）
体内：裸鼠或免疫功能抑制鼠，成瘤率、抑瘤 生长率、转移率、生存时间及死亡率
作用机理的研究：基因、蛋白、酶、标志、受体
肿瘤细胞培养的应用
肿瘤细胞的遗传特性：各种癌基因及抑 癌基因的分析、染色体定位（FISH法）
肿瘤细胞的生物学行为：细胞周期 （FACS)、信号传递
肿瘤细胞的标志与激素、受体变化（免 疫细胞化学、放射自显影、酶免疫、荧 光免疫、放射免疫、免疫印迹）
细胞保持永生性：自我复制 形态学：大小不一 逐渐一致 增殖力更强：DNA合成期、分裂期达50% 突变性：不同于正常细胞，失去稳定的控制高分化
变低分化 表面性状：负电荷数量>正常，贴壁性，抗原性可
变异 接触抑制减弱或消失： 悬浮生长特征： 成瘤性：移植到动物体内可成瘤
肿瘤细胞in vitro 培基
建株：生长半年以上，病理诊断、光镜及电 镜观察、生长特征、染色体分析、肿瘤标志、 致瘤及转移情况
注意：不是每一肿瘤组织都能建株
应用- 肿瘤治疗的研究
治疗药物敏感性的鉴定与筛选 肿瘤的多药耐药性的鉴定 各种新药治疗的实验研究
体外：肿瘤的生长（3HTdr掺入） 肿瘤的杀伤率（MTT、51Cr释放）
细胞间的相互影响
不同亚群代表不同分化程度的细胞群 表型、形态、受体、对因子的反应等 均不同
不同亚群释放不同的正负调节因子 (阴阳调控)
细胞因子与激素对肿瘤细胞的调控
一个重要而复杂的因素
因素
高分化
低分化
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胰岛素
生长
-
凝血孝素
生长
-
前列腺素
促进（>400) 抑制