肿瘤细胞培养技术-林星石

细胞间的相互影响
不同亚群代表不同分化程度的细胞群 表型、形态、受体、对因子的反应等 均不同
不同亚群释放不同的正负调节因子 (阴阳调控)
细胞因子与激素对肿瘤细胞的调控
一个重要而复杂的因素
因素
高分化
低分化
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胰岛素
生长
-
凝血孝素
生长
-
前列腺素
促进（>400) 抑制
单克隆抗体的制备方法
抗原：纯度、分子量。 1. 细胞1~2107 2. 可溶性蛋白质抗原10 ~100 μg
动物：BALB/C鼠，周龄：6~8周，雌性 佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、脂质体
免疫方法
1.常规免疫：腹腔或颈部多点皮下 0 天：基础免疫—抗原+完全佐剂 15天：基础免疫—抗原+不完全佐剂 30天：基础免疫—抗原+不完全佐剂 45天：追加免疫—同量抗原 48天：进行细胞融合
建株：生长半年以上，病理诊断、光镜及电 镜观察、生长特征、染色体分析、肿瘤标志、 致瘤及转移情况
注意：不是每一肿瘤组织都能建株
应用- 肿瘤治疗的研究
治疗药物敏感性的鉴定与筛选 肿瘤的多药耐药性的鉴定 各种新药治疗的实验研究
体外：肿瘤的生长（3HTdr掺入） 肿瘤的杀伤率（MTT、51Cr释放）
免疫方法
备注： 1. 细胞、细菌、病毒等颗粒性抗原有较
强抗原性，可不加佐剂，直接腹腔注射。 2. 可溶性蛋白质抗原需加佐剂。 本研究室经验：
免疫方法
2. 脾内免疫： 2.1 0 天：基础免疫
15 天：脾内免疫 18 天：细胞融合 2.2 0 天：脾内免疫
4 天：细胞融合
免疫方法
脾内免疫 优点：时间短，使用抗原量少。
技术-培养
原代培养：去除纤维细胞及淋巴细胞， 防止细菌、真菌污染。
传代培养：增殖力低的细胞需要饲养 细胞适当密度, 基本长满后 传代, 前10代不稳定，注意 培养条件，适当调整培基。
技术- 鉴定与建株
鉴定：组织来源 、形态特征、核型染色体分 析、生长特性、对细胞因子的反应（TNF)、 集落形成、致瘤实验（裸小鼠）
细胞保持永生性：自我复制 形态学：大小不一 逐渐一致 增殖力更强：DNA合成期、分裂期达50% 突变性：不同于正常细胞，失去稳定的控制高分化
变低分化 表面性状：负电荷数量>正常，贴壁性，抗原性可
变异 接触抑制减弱或消失： 悬浮生长特征： 成瘤性：移植到动物体内可成瘤
肿瘤细胞in vitro 培基
RPMI1640：最常用，+10~20%FCS，上皮 性 或悬浮性（+0.03%谷氨酰胺）
DMEM：常用 F12： 适用于上皮性癌，如肝癌， L-15： 注意：+2g/L NaHco3 或
+20mmol/L HEPESpH7.2 RPMI1640+F12或L-15（1:1）：适用肉瘤
培养液特殊添加剂
常用的促细胞生长因子及使用的终浓度
添加剂
终浓度
添加剂பைடு நூலகம்
终浓度
BSA transferrin insulin 氢化可的松
10-5mol/ml 5-10 g/ml
5 pg/ml 10-5mol/ml
EGF FGF NGF
5ng/ml 5ng/ml 5ng/ml
肿瘤细胞的培养
与常规细胞培养技术相同 一个细胞群体，存在多种亚群，复杂性 建株细胞较正常细胞易于培养
培养技术 - 取材
手术标本 活检标本 胸腹水穿刺 细针头穿刺 内窥镜活检
关键：新鲜、无菌、及时、准确
技术- 分离纯化
分离：剪碎、酶消化、Ficoll、Percoll等 密度沉降分离
纯化：反复贴壁去除成纤维细胞 自然淘汰去除正常细胞 利用特异抗原标志筛选法( panning) 分亚型 流式细胞仪分选 克隆建株 高转移株的建立：反复接种
肿瘤细胞DNA合成途径：
叶酸衍生物
氨基酸、小分子化合物合成DNA
HGPRT -TK
次黄鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 胸腺嘧啶核苷激酶
核苷酸前体
单克隆抗体的制备
HAT特点：“A”— 叶酸拮抗物 骨髓瘤-骨髓瘤：DNA合成途径阻断；缺HGPRT，
不能利用“H”—死亡。 脾细胞-脾细胞：有HGPRT，缺增殖能力—死亡。 骨髓瘤-脾细胞：HGPRT+无限增殖能力— 存活。
可溶性抗原：2~10g
单克隆抗体的制备
单克隆抗体的制备
基本原理：Bunet抗体选择学说，每个B细 胞只能够产生一种针对它的特异性抗原决定 簇的抗体。从一个祖先B细胞分裂繁殖形成 的纯细胞系，称为克隆。
单克隆抗体的制备
单克隆抗体定义：来自克隆系的细胞基因完 全相同，产生的抗体完全相同。这种从一株 克隆系产生的抗体 — 单克隆抗体（McAb)。
肿瘤细胞培养技术
解放军总医院免疫室 林星石研究员
Histroy
肿瘤类型：间充质 上皮 神经外胚层 造血源性（1955-1958-1963-1965）
In vitro: 原代 传代 建系（1967-1970） 配基成分：纯血清 含血清 无血清 生物学特性：细胞 亚细胞 酶和分子
肿瘤细胞in vitro的特点
1975年Kohler 和 Milstein 首先利用细胞融 合技术制备了永久分泌单克隆抗体的杂交瘤 细胞株。
单克隆抗体的制备
特点：肿瘤细胞易体外培养和长期生长； B淋巴细胞 分泌特异性抗体； 二者杂交融合杂交瘤，继承二者性质。 HAT培基：H—次黄嘌呤、 A—氨基蝶呤 T—胸腺嘧啶核苷
单克隆抗体的制备
激情素
-
助黏附
维生素A
抑制生长及分化
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调整培基中的成分可调控细胞的生长与分化
影响培养肿瘤细胞生长的因素
PH 营养：如血清效价低 细胞生长因子的自分泌及旁分泌 癌基因抑癌基因的变化 排泄废物的影响 细胞外基质的作用 细胞相互间的作用 污染
体内：裸鼠或免疫功能抑制鼠，成瘤率、抑瘤 生长率、转移率、生存时间及死亡率
作用机理的研究：基因、蛋白、酶、标志、受体
肿瘤细胞培养的应用
肿瘤细胞的遗传特性：各种癌基因及抑 癌基因的分析、染色体定位（FISH法）
肿瘤细胞的生物学行为：细胞周期 （FACS)、信号传递
肿瘤细胞的标志与激素、受体变化（免 疫细胞化学、放射自显影、酶免疫、荧 光免疫、放射免疫、免疫印迹）