菌种毒力试验方法

菌种毒力试验方法

一、产毒液体培养基的制备

1.马铃薯-酵母膏-蔗糖培养基

取去皮马铃薯200-300g，切成小块，加水1000mL，煮沸20min，纱布过滤，制成马铃薯汁并补充水分至1000mL，加入10g酵母膏，100g蔗糖，分装后121℃高压灭菌15min。

2.麦芽汁-酵母膏培养基

1000mL麦芽汁中加入10g酵母膏，分装后121℃高压灭菌15min。

3.麦芽汁-蛋白胨培养基

1000mL麦芽汁中加入1g蛋白胨，分装后121℃高压灭菌15min。

4.葡萄糖天门冬素培养基

葡萄糖10.0 g

天门冬素0.5 g

K2HPO4 0.5 g

蒸馏水1000.0 mL

调pH 7.2-7.4，分装后121℃高压灭菌15min。

5.高氏合成1号培养基

可溶性淀粉20.0 g

KNO3 1.0 g

K2HPO40.5 g

MgSO4·7H2O 0.5 g

NaCl 0.5 g

FeSO4·7H2O 0.01 g

蒸馏水1000.0 mL

调pH 7.2-7.4，分装后121℃高压灭菌15min。

6.麦芽汁培养基

200 mL麦芽汁分装后，121℃高压灭菌15min。

7.0.5%蛋白胨培养基

取2.0g葡萄糖，0.6g酵母膏，1.0g蛋白胨，4.0g琼脂，加蒸馏水至200mL，分装后121℃高压灭菌15min。

二、培养物制备

将送检菌种或转种的纯培养物（适宜的培养基斜面，28±1℃培养5-7d），确证为纯培养物后，分别接种于适宜的产毒培养基中，一般菌种接种于麦芽汁-酵母膏、麦芽汁-蛋白胨及马铃薯-酵母膏-蔗糖三种产毒培养基中，放线菌接种于葡萄糖天门冬素培养基和高氏合成1号培养基中，红发夫酵母接种于麦芽汁培养基和0.5%蛋白胨培养基中，置28±1℃培养14d。

将培养物经流动蒸汽1h后，过滤，所得滤液部分于80℃恒温下浓缩2.5倍备用，余者直接供实验用。

三、小鼠毒力实验

每种产毒液体培养基需小鼠80只，雌雄各半，分别随机分为4组，每组10只。剂量组设置为：培养基空白对照组、培养基2.5倍浓缩空白对照组、培养物原液组、培养物2.5倍浓缩组。将受试物以20.0mL/kg BW的剂量给小鼠一次性灌胃后观察14d，记录实验过程中小鼠的中毒表现及死亡情况。

四、试验数据统计

对小鼠的初始体重、终体重各实验原始数据进行方差齐性检验，满足“方差齐”要求的数据资料用两样本均数比较的t检验进行统计处理；对方差不齐的数据资料用t’检验进行统计处理。

五、结果判定

小鼠的初始体重各组间均衡，受试物对终体重无不良影响，实验过程中小鼠未出现毒性反应或死亡，可判定受试菌种安全。