HPLC法测定千层塔提取物中石杉碱甲的含量

HPLC法测定千层塔提取物中石杉碱甲的含量1潘见，金日生*，徐涛，周蓓蓓，胡学桥农产品生物化工教育部重点实验室（合肥工业大学），合肥230009*E-mail：rikn@摘要：建立了一种高效液相色谱测定千层塔提取物中石杉碱甲含量的新方法，首次将L－氨基酸引入生物碱高效液相色谱检测流动相。

色谱柱：Agilent Zorbax SB－C18（4.6mm×150mm）；流动相：甲醇－含1mmol/L L－赖氨酸的水溶液（50:50,v/v）；检测波长：310nm；流速：0.6ml/min。

结果表明在2～20µg /ml范围内石杉碱甲的量与其峰面积呈良好的线性关系；平均加样回收率为99.8％。

该方法灵敏、准确、选择性好。

关键词：石杉碱甲，HPLC1．引言石杉碱甲(Huperzin e A,Fig.1)是我国科学家首次从石杉科石杉属植物千层塔[Huperzia serrata (Thunb.) Trev.]中分离得到的一种生物碱[1]，是一种强效的可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂[2]，临床试验证实石杉碱甲对治疗重肌无力[3]和早老性痴呆有显著疗效[4]。

石杉碱甲的含量测定主要采用反相高效液相色谱法检测，对石杉碱甲片[5-7]及石杉碱甲胶囊[8]中石杉碱甲的测定均有良好的效果，当用于测定千层塔及提取物中的石杉碱甲含量[9]，石杉碱甲主峰易受邻峰的干扰难以达到满意分离度。

作者通过在流动相中添加L－赖氨酸，可使主峰与邻峰之间达到高分离度，且该方法简便、灵敏、准确、重现性好。

图1 石杉碱甲结构式Fig.1. The structure of Huperzine A2．实验部分2.1 仪器与试药高效液相色谱仪：Agilent 1100系列及其配套工作站；包括双元泵，在线脱气机，自动进1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20020359011）资助样器，紫外检测器。

甲醇（色谱级）；三乙胺（AR级）；L－赖氨酸（AR级）；重蒸水；石杉碱甲对照品由本实验室自制；千层塔提取物购自合肥拓峰生物工程有限责任公司。

2.2 色谱条件色谱柱：Agilent Zorbax SB－C18（4.6mm×150mm）；流动相：甲醇－含1mmol/L L －赖氨酸水溶液（50：50 v/v，）；检测波长：310nm；流速：0.6ml/min；进样量：5µＬ2.3 对照品溶液的配制精密称取石杉碱甲对照品，用0.1mol/L的盐酸水溶液配制成0.2mg/ml的对照品储备液，再稀释成2µg /ml至20µg /ml一系列浓度的对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备精密称取千层塔提取物0.2g，溶解于0.1mol/L的盐酸水溶液中超声溶解并定容于100ml 容量瓶中，0.45um滤膜过滤进样。

3．结果与讨论3.1 L－赖氨酸的使用石杉碱甲作为生物碱类化合物，在其反相高效液相色谱检测中，一般要在流动相中加入低浓度离子对试剂[10]，或一定浓度的电解质缓冲盐[6,9,11]，或有机胺改性剂[5,7,8]，以改善峰形，提高分离效能。

图2所示采用两种不同流动相时样品的色谱图。

图2－A中50％甲醇水流动相添加0.02％三乙胺，尽管色谱图中石杉碱甲主峰与相临峰清晰可辨，但分离度没达到基线分离。

图2－B中作者通过在流动相中添加0.5 mmol/L L－赖氨酸，可以明显的看到，石杉碱甲峰与相临峰完全分离。

究其原因，作者认为首先了L－赖氨酸显碱性，起到了与三乙胺类似的作用；其次，L－赖氨酸具有离子偶极作用，可能与石杉碱甲和杂质间具有不同的离子－偶极作用，这在提高 分离效能方面起到了很重要的作用。

图2 样品在不同流动相下的色谱图（A）0.04%三乙胺甲醇溶液－水(50:50,v/v)，(B)甲醇－1 mmol/L L-赖氨酸(50:50,v/v). Fig.2. chromatograms of study sample with mobile phase consisting of (A)0.04% triethylamine methanol solution-water(50:50,v/v),(B)methanol-1 mmol/L L-Lysine water solution(50:50,v/v)3.2线性关系的考察以外标法定量。

分别取对照品储备液2.5，5.0，7.5，10，15，25ml置于250ml容量瓶中，用0.1mol/L的盐酸水溶液稀释至刻度，同体积进样，记录并储存色谱图。

以石杉碱甲峰面积Y对进样浓度X进行线性回归，得到线性方程Y＝42.54X–1.21，相关系数R＝0.999 。

结果表明石杉碱甲浓度与峰面积之间具有良好的线性关系，线性范围为2µg/ml～20µg/ml。

3.3方法的精密度和重现性在上述色谱条件下，对同一对照品溶液，重复测定５次后石杉碱甲峰面积的ＲＳＤ为0.69％。

对同一批样品按供试品溶液的制备方法平行制备５份，分别进样5µＬ，按外标法测定其含量并计算ＲＳＤ为1.52％。

3.4回收率试验称取千层塔提取物适量，按样品测定项方法测定石杉碱甲含量后，再称取样品3份，加入含石杉碱甲量相接近的对照品溶液，再按供试品溶液的制备项下处理，得供试品溶液，进样测定。

计算得平均回收率为99.8%，结果表明本方法回收率较好。

4 结论建立了一种高效液相色谱测定千层塔提取物中石杉碱甲含量的新方法，首次将L－氨基酸引入生物碱高效液相色谱检测流动相。

结果表明,本方法简便、快捷、灵敏、准确、重复性和选择性均良好，对其它生物碱的高效液相色谱检测具有重要的参考价值。

参考文献[1] 刘嘉森，俞超美，周有作等.石杉碱甲和石杉碱乙的化学研究[J].化学学报，1986，44：1035－1040.[2] 王月娥.石杉碱甲的抗胆碱酯酶的作用[J].中国药理学报，1986，7：110－113[3] 程源深,吕传真,应智林等.石杉碱甲治疗重症肌无力症128例[J].新药与临床,1986,59(4):197-199.[4] 唐希灿.石杉碱甲（双益平）一种有望治疗早老性痴呆症的药物[J].中国药理学报，1996，179（6）：481－484.[5] 孙建绪,翁 骏,高永良.石杉碱甲片溶出测定方法的研究[J]. 解放军药学学报.2003,19(6):464-466.[6] 王国峰,曾芳,郑子栋.高效液相色谱法测定石杉碱甲片的含量及其有关物质[J].药物分析杂志，2001，21（2）：85－88.[7] 高 青,周立春,夏瑞等.高效液相色谱法测定石杉碱甲片的含量及有关物质[J].中国药科大学学报,2004,35(4):338－340.[8] 周芝芳 林志红. 高效液相色谱法测定石杉碱甲胶囊的含量[J]. 药物分析杂志,1998,18(2):105-106.[9] 孙远明,余红英,杨跃生. HPLC法测定蛇足石杉中石杉碱甲含量[J].中草药，2002，33（12）：1078－1080.[10]Jincui Ye a, Su Zeng, Wanggang Zhang ,etal. Ion-pair reverse-phase high performance liquid chromatographymethod for determination of Huperzine-A in beagle dog serum. J. Chromatogra. B , 2005, 817 :187-191. [11]Q. P. Yang, X. L. Kou, K. B. Fugal,etal.Determination of huperzine A in formulated productsby reversed-phase-liquid chromatography using diode array and electrospray ionization mass spectrometric detection. Phytomedicine ,2003 (10):200-2005.Determination of Huperzine A in Huperzia serrata Extract by High Performance Liquid ChromatographyPan Jian, Jin Ri-sheng, Xu Tao, Zhou Bei-bei, Hu Xue-qiaoKey laboratory of Bio-process(Hefei university of technology),Ministry of Education,P.R.China193 Tun Xi Road,Hefei,Anhui 230009,P.R.ChinaAbstractA rapid and selective HPLC method for determination of Huperzine A in Huperzia serrata Extract has been developed and validated. Huperzine A was dissolved0.01mol/L HCl, chromatographed on a Agilent Zorbax SB-C18(150mm×4.6mm i.d.,5µm) column,with a mobile phase consisting of methanol-1 mmol/L L-Lysine water solution(50:50,v/v),and detected at 310 nm.The UV peak areas were used for quantitation of Huperzine A content.The coorelation coefficient (R2) of the calibration was 0.999 over the range of 2～20 ug/ml.The method was successfully applied to characterize and determinate the Huperzine A in Huperzia serrata Extract.Keywords:Huperzine A，HPLC作者简介：潘见(1955-)，男，安徽金寨人，博士，合肥工业大学教授，博士生导师；金日生(1982-)，男，安徽桐城人，合肥工业大学硕博连读研究生。