均相时间分辨荧光
kinase-glo激酶发光法和均相时间分辨荧光法
kinase-glo激酶发光法和均相时间分辨荧光法kinase-glo激酶发光法和均相时间分辨荧光法是两种常用的生物分子检测方法。
kinase-glo激酶发光法是一种非放射性检测方法，用于检测激酶活性。
该方法基于ATP的化学发光反应，通过测量发光强度来定量测定激酶活性。
该方法具有高灵敏度、高特异性和可重复性强的优点，因此在生物分子检测中广泛应用。
均相时间分辨荧光法是一种基于时间分辨技术的荧光检测方法。
该方法使用具有长寿命的荧光标记物，可以在无需分离样品的情况下进行直接检测。
该方法具有高灵敏度、高选择性、低背景干扰和可同时检测多个分子的优点。
在生物分子检测中，均相时间分辨荧光法可以用于检测蛋白质、核酸和细胞等生物样本中的目标分子。
这两种方法在生物分子检测中各有优缺点，选择哪种方法取决于具体的实验需求和条件。
在实际应用中，需要根据实验目的、样本类型、检测灵敏度和特异性等方面进行综合考虑，选择最适合的方法进行检测。
均相时间分辨荧光技术
卡尔·古斯塔法·莫桑德尔 （Carl·Gustaf·Mosander）
背景简介——镧
镧的发现
镧于1839年1月，由在斯德哥尔摩的卡罗林斯卡研究所的卡尔·古斯 塔法·莫桑德尔（Carl·Gustaf·Mosander）发现。他从在1803已 经发现的铈中提取了它。莫桑德尔注意到他的大多数氧化铈样本不 可溶，而有些是可溶的，他推断这是一种新元素的氧化物。他从铈 中提取出了第二种元素，他称之为didymium（镨钕混合物）。然而 他没有意识到didymium也是混合物，在1885年它被分离成了镨和钕。
利用长发射半衰期的稀土镧系元素作为供体荧光团，HTRF技术结合了荧光共振能量转移 （FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF, Time-Resolved Fluorescence） 两种技术。这种结合将TRF 的低背景特点和FRET 的均相实验方式融合在一起，使得 HTRF 技术拥有 如下优势：实验方式灵活、可靠，并且具有更高的灵敏度、 稳定，实验结果的假阳性率较低
镧系元素：lanthanide element
镧以及接着发现的铒、铽打开了发现稀土元素的第二道大门， 是发现稀土元素的第二阶段。他们的发现是继铈和钇两个元素后又 找到稀土元素中的三个。镧以及接着发现的铒、铽打开了发现稀土 元素的第二道大门，是发现稀土元素的第二阶段。他们的发现是继 铈和钇两个元素后又找到稀土元素中的三个。
二、荧光共振能量转移
荧光共振能量的缺点：
然而，这些生物测定法在荧光检测方面具有很大的缺点，因为它被来自散射激发光的背 景噪声显着抑制，并且受到样品中共存材料荧光（荧光化合物和粉尘/线）的显着干扰，使其 变得困难以获得高度敏感的测量而且在 FRET 实验中使用的供体和受体是快速荧光基团，半衰 期非常短，其背景荧光较强。
时间分辨荧光技术
时间分辨荧光技术时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。
（一）TRFIA分析原理在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。
大部分背景荧光信号是短时存在的，因此将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合，就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。
时间分辨荧光分析法（TRFIA）实际上是在荧光分析（FIA）的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。
荧光分析利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外-可见分光分析法中杂色光的影响，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。
但是，当进行超微量分析的时候，激发光的杂散光的影响就显得严重了。
因此，解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。
解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。
但普通的荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。
不过有非常少的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）的荧光寿命较长，可达1～2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法医学教|育网搜集整理。
平时常用的稀土金属主要是Eu（铕）和Tb（铽），Eu荧光寿命1ms，在水中不稳定，但加入增强剂后可以克服；Tb荧光寿命1.6ms，水中稳定，但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解，因此从测量方法学上看Tb很好，但不适合用于生物分析，故Eu最为常用。
（二）时间分辨信号原理普通物质荧光光谱分为激发光谱和发射光谱，在选择荧光物质作为标记物时，必须考虑激发光谱和发射光谱之间的波长差，即Stakes位移的大小。
时间分辨荧光光谱技术在分析化学中的应用
时间分辨荧光光谱技术在分析化学中的应用分析化学是一门关于物质成分、组成和性质的研究学科，是化学基础科学中一项十分重要的领域。
在分析化学研究的过程中，如何快速、准确地获取样品的信息，是相当重要的。
时间分辨荧光光谱技术作为一种高分辨荧光光谱测量技术，已经在分析化学领域得到了广泛应用。
时间分辨荧光光谱技术是利用激发光对样品进行激发后，样品会发生发光现象，并通过荧光仪测量荧光光谱。
与传统荧光光谱相比，时间分辨荧光光谱技术能够更准确地确定激发波长和发射波长之间的荧光寿命，这对于确定物质的组成和性质具有重要意义。
一、分析化学中的应用时间分辨荧光光谱技术在分析化学中的应用非常广泛，以下列举几个例子：1. 化学传感器时间分辨荧光光谱技术被广泛应用于化学传感器的研制中。
由于荧光分子与环境的相互作用会导致荧光发射强度、发射波长甚至荧光寿命的变化，因此通过荧光光谱测量样品的荧光特性，可以精准测量样品中特定成分的浓度信息，实现对环境中污染物的监测。
2. 生物体内分析时间分辨荧光光谱技术被广泛应用于药物分析和生物体内分析中。
由于具有极高的灵敏度，在药物研制中可以测量药物在血液中的含量，研究药物的动力学作用。
在生物体内分析中，可以利用时间分辨荧光光谱技术测量组织和细胞中的荧光特性，研究细胞代谢、分裂等过程，寻找新的生物分子标志物。
3. 材料表征时间分辨荧光光谱技术在材料表征中的应用也日益重要。
利用时间分辨荧光光谱技术可以对材料结构改变、材料表面状态等进行准确测量，该技术已被广泛应用于纳米材料、有机半导体材料、生物材料等领域的表征。
二、时间分辨荧光光谱技术的优点1. 高分辨率时间分辨荧光光谱技术是一种高分辨的测量技术，具有比传统荧光光谱更高的准确度和精度。
由于荧光寿命可以精确测量，因此可以清晰区分不同荧光种类和荧光机理，有助于准确判定物质的组成和性质。
2. 灵敏检测时间分辨荧光光谱技术具有极高的灵敏度，可以测量十分微弱的荧光信号。
HTRF 技术
HTRF (homogeneous time resolved fluorescence)HTRF®是均相时间分辨荧光技术的简称，HTRF®技术是对TR-FRET技术的进一步改良，提供了更高的灵敏度和稳定性，为法国Cisbio公司的专利技术。
HTRF®技术结合了FRET 和时间分辨荧光（TRF''Time Resolved Fluorescence)）两种技术。
能量供体：Eu或Tb标记的穴状化合物元素；能量受体：XL665或d2----基于穴状化合物的供体与受体（第二荧光标记物）之间的荧光共振能量转移（FRET）。
在FRET中，受体发射荧光的寿命等同与供体的发射荧光的寿命。
因为Eu 的荧光衰减周期较长，所以含Eu的供体会诱导XL665受体长时间地发射荧光，受体激发后产生的荧光便能持续较长时间，这样通过时间分辨就可以区分那些短寿命的自身散射的荧光，这样从短寿命荧光背景中就很容易区分出FRET信号。
当由于生物分子相互作用导致两个荧光基团接近时，在激发时被穴状化合物捕获的部分能量释放，发射波长为620nm；另一部分能量转移到受体（acceptor）上，发射波长为665nm。
665nm的发射光仅仅由供体（donor）引起的FRET产生。
所以，当生物分子相互作用时，有两个激发光620nm和665nm；当不存在相互作用时，只有620nm一个激发光。
FRET利用两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为能量供体（Donor）和能量受体（Acceptor）。
Donor 被外来光源激发（例如氙灯或激光），如果它与Acceptor 比较接近，可以将能量共振转移到在Acceptor 上，使其受到激发，发出特定波长的发射光。
将Donor 和Acceptor 分别与相互作用的生物分子结合，生物分子的结合可以将Donor 和Acceptor 拉到足够近的距离，产生能量转移，由于Acceptor 的发射光来自能量转移，所以实验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤。
均相免疫分析技术-Binding Assay
N O
S
O O
340-350 nm
N
energy transfer
O2 680 nm 1Dg O2
Signal Amplification
Donor: Phthalocyanine（酞菁）
检测波长: 520-620nm
AlphaLISA beads
Donor beads
在AlphaLISA受体微珠中，蒽和红荧烯被一种镧系元素铕 (Europium)螯合物替代。被激发的铕螯合物可以在615nm左右 形成波段更窄的更强的可检测光。该反应的半衰期为0.3秒， 可使用时间分辨的方法检测。
AlphaLISA beads
1O2
N
N
OSi
N
N Si N
N
SiO
N
N
O2 680 nm 1Dg O2
Signal Amplification
Donor: Phthalocyanine （酞菁）
N
N
O
S
1DgO2
S O
O
O
Europium
energy transfer
检测波长: 607-623nm
小结
检测特性 荧光类型 特异性 高通量 灵敏度 检测范围 上样体系 抗体需求 信号稳定性 数据分析 仪器需求
人力
TR-FRET
Alpha
ELISA
均相，无需洗涤
均相，无需洗涤
非均相，需多次洗涤
FRET，物理荧光
化学发光
颜色反应
高 易实现高通量
高 易实现高通量
高 实现高通量较困难
灵敏（皮摩尔）
高灵敏（亚皮摩尔）
htrf法
htrf法
HTRF是均相时间分辨荧光技术的缩写，是一种免洗技术，用来检测纯液相体系中待测物。
它结合了荧光共振能量转移（FRET）和时间分辨荧光（TRF）两种技术，将FRET的均相实验方式和TRF的低背景特性融合在一起，提供了更高的灵敏度和稳定性。
对于夹心实验，HTRF技术使用两种识别感兴趣蛋白质的抗体，其中一种抗体与供体结合，另一种与受体结合。
如果两个抗体识别分析物，供体激发时会发出荧光，能量会转移到附近的受体，从而产生特定的受体荧光。
供体荧光也被测量，并与受体荧光的比率被应用。
HTRF技术可应用于G蛋白耦联受体研究、激酶活性检测、免疫检查点检测、细胞因子分泌检测、抗体检测等领域，目前广泛应用于新药研发候选药物的大通量筛选。
免疫荧光实验技术
595～600nm（橙 FITC的衬比染色或双
红色）
标记FAT
四甲基异硫氰酸罗 丹明 (TRITC) 藻红蛋白（PE）
Eu3+螯合物
550nm 490-560nm 340nm
620nm（橙红色） FITC的衬比染色或双 标记FAT
575nm（红色） 双标记FAT、流式细 胞术
613nm
时间分辨荧光免疫测 定
免疫荧光技术实验 封闭，抗体孵育
封闭：目的是为了减少抗体的非特异性结合，最常 用的封闭剂为 BSA, （PBS pH 7.5）,其他可选择的封 闭剂还有 1% 凝胶 gelatin, 1% bovine 或与二抗种 属相同的血清（3-10%）等。室温和4℃均可以。
抗体孵育：直接免疫荧光法中的一抗和间接免疫荧 光法中的二抗都是荧光抗体，因此在这些抗体孵育 的时候必须注意避光。此外，为保证结合质量和防 止干燥，抗体孵育应尽量在湿盒中进行。
免疫荧光技术简介:荧光
发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强 度。
激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录 的相应的荧光发射强度。
荧光寿命：荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的 时间。
荧光淬灭：荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退 称为荧光淬灭。如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、 I-等 。
荧光显微镜
Chance Favors Only the Prepared Mind.
免疫荧光技术简介:抗体
抗体（Antibody）：抗体指机体的免疫系统在抗原刺 激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞 所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球 蛋白。主要分布在血清中，也分布于组织液及外分 泌液中。
均相时间分辨荧光技术 ppt课件
让-马里·莱恩 （Jean-Marie Lehn）
背景简介——穴状配合物
穴状化合物的形成是将一个阳离子纳入到一个立体笼中。笼 能收集光然后将能量转移到核心的镧系元素。大环的性质有利于 跟镧系元素紧密相连，这种不可破的连接会形成异常稳固的复合 体。穴结构能耐受一些特殊的实验条件如大量存在的阳离子 （ Mg2+和 Mn2+等）、螯合物（ EDTA）、溶剂或者温度。
从 HTRF 能应用到临床诊断就能看出它也适用于浓度高的血 清在读板前或者孵育时加入氟离子能增强实验对大量化合物的抗 干扰性，对实验没有干扰而给实验提供了很大的灵活性。
穴没有光漂白性，多次读数后信号没有损失，因此能按照需 要的次数去读，这就给许多动力学检测提供了可能。
专利号： US Patent US 5,527,684 由于在该结构上的贡献，让-马 里·莱恩在 1987 年获得了诺贝尔 奖。
时间分辨荧光（ TRF）利用稀土元素中镧系元素的独特 性质。在 TRF 中常用的镧系元素是钐（ Sm）、铕（ Eu）、 铽（ Tb）和镝（ Dy）。与传统荧光基团相比，它们具有大 的Stoke's shifts 和非常长的发射半衰期（从微秒到毫秒）， 这使它们在生物学荧光应用领域中日益重要。
一、时间分辨荧光
镧系元素是57～71的15种化学元素的统称。包括镧、铈、镨、 钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥，它们都是稀 土元素的成员。
背景简介——穴状配合物
Cisbio Bioassays最初在体外诊断方面的成就提供了丰富的免 疫化验的经验，通过与Jean-Marie Lehn 教授在稀土荧光特性方面 研究合作，造就了如今的HTRF技术。如今，全球各大制药企业、药 物研究所和新药筛选中心都将HTRF作为重要的化合物筛选方法进行 药物研发。
kinase-glo激酶发光法和均相时间分辨荧光法 -回复
kinase-glo激酶发光法和均相时间分辨荧光法-回复KinaseGlo激酶发光法和均相时间分辨荧光法是生物科学领域中常用的实验方法，用于研究细胞信号传导和蛋白质激酶活性。
本文将详细介绍这两种实验方法的原理、步骤和应用。
一、KinaseGlo激酶发光法1.原理：KinaseGlo激酶发光法是一种测定激酶活性的方法，通过检测细胞中激酶活性的变化来研究细胞信号传导。
该方法利用一种特殊的底物，当底物被激酶磷酸化后，会释放出化学能量，激发一个化学反应，最终产生可检测的光信号。
2.步骤：步骤一：准备细胞样品，可以是细胞培养物或组织样品，根据实验需要选择合适的细胞类型和培养条件。
步骤二：制备样品溶液，将细胞样品裂解，并加入适量的底物和试剂，使其反应。
反应时间、试剂浓度等参数可以根据实验需要进行调整。
步骤三：检测光信号，将反应体制转移到适当的检测平台上，一般是一个带有光学检测器的微孔板读板器。
通过引入一种化学荧光基团和底物反应产物，激发光信号的产生。
步骤四：数据分析，将得到的光信号进行定量分析，通常是通过比较不同样品的光信号强度，计算出激酶活性的变化。
3.应用：KinaseGlo激酶发光法在生物医学研究中具有广泛的应用价值。
例如，在肿瘤治疗研究中，可以利用该方法研究激酶抑制剂对肿瘤细胞中激酶活性的抑制效果；在生物标志物研究中，可以利用该方法研究某些激酶活性与疾病的相关性；在药物筛选中，可以利用该方法研究激酶抑制剂的效果等。
二、均相时间分辨荧光法1.原理：均相时间分辨荧光法是一种用于研究生物分子的荧光性质和行为的方法。
该方法基于荧光分子在激发后发射光信号的特性，通过时间分辨荧光光谱的测量，可以获得样品中荧光分子的信息。
2.步骤：步骤一：制备样品溶液，根据实验需要选择适当的溶剂和浓度，将待测的荧光分子溶解其中。
步骤二：激发荧光分子，通过激光或其他合适的光源激发样品中的荧光分子。
步骤三：测量荧光信号，使用时间分辨荧光光谱仪测量样品中的荧光光谱，并记录下相应的荧光强度和发射波长。
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Bagnols-sur-Cèze法国-2009年11月5日-Cisbio Bioassays ()公司是IBA旗下的子公司，也是药物研究和药物筛选领域HTRF (均相时间分辨荧光)技术的发明者。
今天Cisbio公司宣布，其在中国和韩国已建立了自己的销售团队，以便进一步开发亚洲市场。
本土销售团队将能让Cisbio为这两个迅速增长的生物制药市场的客户提供GPCR和激酶研究的HTRF平台、生物标志物检测以及其他相关的服务。
Cisbio Bioassays公司所销售的基于HTRF技术的产品包括：IP1, cAMP, Cellul’erk 以及Tag-lite™细胞表面受体平台。
这些业务将会通过IBA集团旗下的IBA中国分公司()来操作。
为了在亚洲市场拓展应用于癌症诊断和治疗方面的放射药物产品、仪器和方法, IBA集团于2007年建立了IBA中国公司。
韩国的销售业务则由位于首尔的代理商JCBio公司(www.jcbio.co.kr)负责。
JCBio公司专注于为制药和生物技术实验室提供相关商品。
“在过去的10年里，我们一直致力于在欧洲、北美和亚洲建立本土化的团队，针对特定市场并拓展我们在当地的业务。
” Cisbio Bioassays 市场部主管François Degorce说道，“我们的目标是成为一个客户至上的服务性公司，并让业务遍及全球。
我们在中国和韩国的团队将帮助我们促进与该两个重要市场的客户的关系。
”
作为2009年度 Frost & Sullivan北美技术创新奖项的获得者，Cisbio Bioassays凭借着其专利技术HTRF领先于均相荧光方法领域。
HTRF是一种很灵敏且稳定的技术，主要应用于药物研发的高通量筛选阶段。
除了基于HTRF的一些产品外，Cisbio还能提供一系列的定制服务，其包括：为客户特定的实验蛋白，抗体或化合物等进行标记，为客户设计和研发实验方法，以及为客户提供HTRF 技术培训。
Cisbio Bioassays总部在法国，同时在Bedford, Massachusetts(美国)也有基地；在日本和印度则通过独家代理来销售商品。
HTRF 技术介绍
HTRF(均相时间分辨荧光)是用来检测均相体系中待测物的一种最常用的方法，是用来研究药物靶标的理想的平台。
这种技术结合了荧光共振能量转移(FRET) 和时间分辨技术(TR)。
在TR-FRET 实验中，当供体和受体相离很近时，在供体和受体之间会有荧光共振能量转移而产生信号。
采用双波长检测能够显著减小缓冲液和培养基的干扰，最终的信号跟产物形成的量成比例。
HTRF技术被广泛应用于基于细胞实验和生化实验的药物研发的不同阶段，从实验开发，lead 到hit，高通量筛选（HTS），到临床前研究。
这是一种很灵敏且稳定的技术，可以使用384和1536孔板。
自从10年前HTRF技术进入药物研发领域以来，研究者采用该技术加快了很多基于抗体的研究，包括GPCR（配体结合，受体二聚化，cAMP 和IP-1 的检测，以及磷酸化ERK的定量）, 激酶，细胞因子和生物标志物，生物过程（抗体和蛋白生产），以及蛋白和蛋白，蛋白和多肽，蛋白和DNA/RNA相互作用的实验。
HTRF技术也可以取代大部分ELISA，因为HTRF具有同等的检测
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范围和检测极限，而且更节省实验时间，并且不需要洗板的步骤。
HTRF也是基于TR-FRET的化学技术,但它的许多特点把它与其他TR-FRET产品区分开来。
其中一个特点就是由于使用了镧系元素，从而具有非常长的半衰期（铕和铽），镧系元素与络合的穴相结合，这种结合的穴状物与其他所有TR-FRET产品使用的螯合技术相比能增加实验的稳定性，另外使用专利化的比值测量能矫正干扰因素。
其他HTRF ®技术的特点包括：
•均质性（不需要洗板）
•低背景
•实验体积的小型化很简捷
•化合物和培养基的干扰小
•对一些添加剂如DMSO和EDTA的耐受性 •与许多读扳机相兼容
总体而言，HTRF在生物分子检测和定量方面是相当灵敏和稳定的技术，可以广泛应用于药物研发领域。
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详细技术特点
穴与螯合物
穴的形成是将一个阳离子纳入到一个立体笼中。
笼能收集光然后将能量转移到核心的镧系元素。
这个大环的这些性质有利于跟镧系元素紧密相连，这种不可破的连接会形成异常稳固的复合体。
这种穴结构能抵抗一些特殊的实验条件如大量存在的阳离子（Mg2 +和Mn2 +等），螯合物（EDTA），溶剂或者温度。
从HTRF 能应用到临床诊断（TRACE®技术和Kryptor®工作站技术）就能看出它也适用于浓度高的血清（50%）。
在读板前或者孵育时加入氟离子能增强实验对大量化合物的抗干扰性。
以铀氨基丁三醇穴（TBP铀）为例，双吡啶的一部分增加活化参数达到大约25-30kcal/mole 的ΔG*。
因此穴结构分子能被用于恶劣的化学条件，例如在固相肽类合成过程中，穴结构分子在三氟乙酸存在的固相化学和反相色谱中非常稳定，而不用考虑铀会从笼中分离。
作为对比的是螯合物跃迁很容易达到0-10 kcal/mole的ΔG*，例如羧酸根部分质子化。
这就解释了为什么螯合物跟穴结构分子不一样，在酸性介质中不稳定，稀有金属离子容易被介质中的离子如锰置换。
时间灵活和实验安全
如果仪器坏了，在一段时间之后仍然可以读板。
HTRF结果能持续7天以上保持稳定且较大的实验窗口。
动力学研究
穴没有光漂白性，多次读数后信号没有损失。
因此能按照需要的次数去读，这就给许多实验的动力学检测提供了可能。
灵活的实验模式
许多化学和生物添加剂，如带血清的培养液，牛血清白蛋白，二甲基亚砜，去污剂，酶的淬灭剂（EDTA），对实验测量没有干扰因而给实验提供了很大的灵活性。
作者：谢兵，周时勇
联系邮箱：shiyong.zhou@和yin.zhou@
2010年4月22日第七十五期第 18 页，共 26 页下一页 返回。