生物制药实验

实验一生物药物原料的选择、处理与保存

一、目的要求

1、了解各种不同生物药物原料的来源。

2、学习并掌握各种原料的选择原则、处理及保存方法。

二、基本原理

生物药物原料以天然的生物材料为主，包括人体、动物、植物、微生物和各种海洋生物等。生物药物的提取与分离方法因为原材料、药物的种类和性质的不同而有很大差异。因此在选择时应注意选择有效成分含量高、原料新鲜、来源丰富、杂志含量少的原料，还要选择最佳采集时间。

原料的处理依原料的种类不同而不同。动物原料采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻储存；植物原料确定后，要择时采集并就地去除不用的部分，将有用部分干燥，保鲜处理；微生物原料收集时，要及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理。原料的保存方法主要有三种：冷冻法、有机溶剂脱水法和防腐剂保险法。本实验着重介绍有机溶剂脱水法。

有机溶剂脱水法：植物、动物组织中常含有较多的脂肪和微生物，该类物质不仅容易氧化酸败，导致原料变质，而且还会影响纯化操作和制品收率。因此，将动植物原料置于脂溶性有机溶剂（丙酮、乙醚等）中进行脱脂、脱水，制成丙酮干粉，长期保存。

三、器材

剪刀、研钵、离心机、表面皿、冰箱

冷丙酮

四、操作步骤

1、取植物组织（芹菜叶片）适量（10-20 g），用水洗净，甩干。

2、用剪刀剪碎，放入研钵，加5倍体积的冷丙酮，研磨成浆糊状。

3、将上述研磨物转入50 mL离心管，于-20℃静置30 min。

4、取出，于4℃下4000 rpm离心20 min。

5、倒去上清液，将沉淀转到表面皿中，室温自然风干，制成丙酮干粉，可在4℃下长期保存。

五、实验报告

1、各种不同生物药物原料的选择原则是什么？

2、不同生物药物原料的处理及保存方法有哪几种？

实验二植物药物制备技术实验

——大蒜SOD的提取

一、目的要求

1、了解酶类药物的特性和功能

2、掌握超氧化物歧化酶（SOD）的提取过程。

二、基本原理

超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶，可催化超氧阴离子（O2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2 O2- + H2 = O2 + H2O2。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，用pH7.8的磷酸缓冲液提取。由于不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。SOD是一种重要的氧自由基清除剂，作为药用酶在欧美已有产品。由于SOD能专一性去除超氧阴离子自由基，故引起国内外生化界和医药界的极大关注。目前临床上应用集中在自身免疫性疾病上，如类风湿性关节炎、红斑狼疮、皮肌炎等。

三、试剂及器材

1、新鲜蒜瓣。

2、磷酸缓冲液：0.05 mol/L，pH7.8磷酸缓冲液

3、氯仿-乙醇混合溶剂：氯仿：无水乙醇= 3:5

4、冷丙酮（4-10℃）

5、碳酸盐缓冲液：0.05 mol/L，pH10.2

6、EDTA溶液：0.1 mol/L

四、操作方法

1、组织破碎：称取5 g蒜瓣，于研钵中研磨，使组织破碎。

2、SOD提取：将上述破碎的组织加入2-3倍体积的0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20 min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后5000 rpm离心15 min，弃去沉淀，收集上清液。

3、去除蛋白：向上述上清液中加入0.25倍体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15 min，然后5000 rpm离心15 min，弃去沉淀，上清即为粗酶液。

4、SOD的沉淀分离：将上述粗酶液加入等体积冷丙酮，搅拌15 min，然后5000 rpm 离心15 min，所得沉淀即为SOD。将SOD沉淀溶于0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液中，于55-60℃处理15 min，离心弃去沉淀，得到SOD酶液。

五、实验报告

1、提取过程中影响SOD活性的关键因素有哪些？

2、酶类药物制备过程中应该注意什么？如何减轻不良因素的影响？

实验三抗体诊断-玻片直接凝集法检测血型

一、目的要求

1、学习并掌握抗原抗体凝集反应的原理和方法

2、了解凝集现象和人类ABO血型系统的分类。

二，基本原理

在人类ABO血型系统中，红细胞膜上存在有不同的抗原物质，即凝集原A和B；与之对应，血清中则含有特异性抗体抗A（α凝集素）和抗B（β凝集素）。根据红细胞上所含凝集原种类不同，将人类ABO血型系统分为4中不同血型：凡含有凝集原A而血浆中不含有α凝集素的血液为A型；凡含有凝集原B而血浆中不含有β凝集素的血液为B型；凡无αβ凝集素，而仅含有凝集原A、B的血液为AB型；凡无原A、B凝集原，而仅含有αβ凝集素的血型为O型。

当一个人的红细胞同另一个人的血清相混合时，有时可看到红细胞彼此凝集在一起，这种现象称为红细胞凝集反应。这种现象正是红细胞表面抗原与血清中相应的抗体相遇时发生的凝集反应。

三、器材

一次性采血针、酒精棉球、镊子、玻棒、双凹玻片、记号笔

标准血清A和B各一盒

四、操作步骤

1、取双凹玻片一片，左上角写“A”，右上角写“B”，分别加入一滴标准血清A和B。

2、采指端血。

3、用玻棒两端分别取少许，分别放入A和B标准血清，混匀。

4、静置5 min。

5、观察。

五、实验报告

1、人ABO血型系统抗原抗体凝集反应图表

（+）阳性反应（—）阴性反应

2、根据反应，判断自己的血型。

实验四药物中蛋白含量测定

一、目的要求

学习蛋白质含量测定方法——lowry法的基本原理，并掌握该法的操作。

二、基本原理

Lowry法师双缩脲方法的发展，首先是在碱性溶液中形成铜-蛋白质复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂），产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在500 nm处有最大的吸收峰，颜色深浅与蛋白浓度成正比，可根据500 nm处吸光值大小计算蛋白质含量。

该法灵敏但费时。进行测定时，加Folin-酚试剂要特别小心，因为Folin-酚试剂仅在酸性条件下稳定，但上述还原反应只是在pH10的情况下发生，所以当Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。

该法也可用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

三、器材

分光光度计、比色杯、试管、试管架、微量移液器、Tip头、涡旋振荡器、量筒等。

0.25 mg/mL BSA、4%NaCO3、0.8% NaOH、1% CuSO4、2%酒石酸钠、Fol in-酚。

四、操作步骤

1、将4%NaCO3：0.8% NaOH = 1:1，制备A液。

2、将1% CuSO4：2%酒石酸钠= 1:1，制备B液。

3、将A：B = 50:1，制备C液。

4、取0.25 mg/mL BSA 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别加入5支试管中，用蒸馏水补充至1.0 mL。

5、取样品1.0 mL于另一支试管中。

6、向每支试管中加入C液5 mL，震荡混匀，静置10 min。

7、再向每支试管中加入Folin-酚试剂0.5 mL，混匀，静置30 min。

8、测定OD500，以蒸馏水为空白对照。

9、以OD500值为纵坐标，BSA浓度为横坐标，绘制标准曲线。

五、实验报告

1、用excel软件绘制标准曲线，并求出回归方程和R2值。

2、根据回归方程和样品的OD500值，计算样品中蛋白浓度。