限制性内切酶的应用 PPT
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江西省新余市第四中学高三一轮复习人教版生物选修三课件专题111限制性核酸内切酶(共12张PPT)
多能产生不同的DNA片段种类数是（ ）
A.3 B.4
C.9 D.12
C
8、一环状DNA分子，设其长度为1，已知某种限制性核酸内切酶 在该分子上有3个酶切位点，如图中箭头A、B、C所指。如果该 DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生0.2、0.3、0.5 三种不同长度的DNA片段。现有多个上述DNA分子，若在每个分 子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后， 这些DNA分子最多能产生长度不同的线状DNA的种类数是（ ）
图2 图1
（4）若用图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后形成重组
质粒，则应该选择的限制酶是 BamHⅠ 。在导入重组质粒后，为
筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需用添加 抗生素B 的培养基。
经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确
表达，其最可能的原因是
。
同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接
A 作正确的是（ ）
A．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割 B．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割 C．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割 D．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
4、下面是5种限制性内切酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图 (↓表示剪切点、切出的断面为黏性末端)：
C 请指出下列哪组表达正确（ ）
少有一个酶切位点被该酶切断，则理论上讲，经该酶酶切后，这些
C 线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是（ ）
A.3 B.4
C.9 D.12
7、如果一个环状DNA上有三种限制酶a、b、c的酶切位点。现有
多个该环状DNA分子，若在每个DNA分子上至少有一个酶切位点
被该酶切断，则理论上讲，经该酶酶切后，这些环状DNA分子最
限制性核酸内切酶切割原理方法结果分析及应用
5.DNA 酶 切 位 点 没 有 甲 基 化
( 如 Dpn1) 6.DNA 位点上存在其它修饰 7.DNA 不存在该酶识别顺序
验证
二 . 如果 DNA 切割不完全？ 1. 内切酶活性下降 2. 内切酶稀释方法不正确 3.DNA 不纯，反应条件不佳 4. 内 切 酶 识 别 的 DNA 位 点 上 的 碱 基 被 甲 基 化 或 存 在其它修饰 5. 部分 DNA 溶液粘在管壁上 6. 内切酶溶液粘度大，取样不准 7. 酶切后 DNA 粘性末端退火 8. 由于反应溶液、温度使内切酶变性 9. 过度稀释使酶活性降低
应用二
利用pBR322作为载体重组人体的抑生长激素也是一 个经常提到的应用例子。其过程和水稻叶绿体基因重组 大同小异，只是除了在质粒载体上插入抑生长激素基因 外，还将含有lac操纵子起始部分的片段（包括启动子， 操作区，核糖体集合位点和β-半乳糖苷酶的主要部分） 插在抑生长激素基因的旁边。由于有了lac操作子的控 制，重组基因产生的蛋白质的调节就变得比较容易了
限制性核酸内切酶切割原理、
方法、结果分析及应用
PPT制作：杜雨濛、张佳佳、陈靓
课堂内容回顾：
1、定义： 1、定义：限制性核酸内切酶是可以识别特 定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的 两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一 类酶，简称限制酶。 2、分类：
（根据酶的基因、蛋 白质结果、依赖的辅 助因子及DNA裂解的 特异性，将限制性内 切酶分为三种类型）
解决方法 1. 用 5-10 倍量过量消化 2. 用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶 3. 同上 4. 同上
5. 反应前离心数秒
6. 将内切酶稀释，增大取样体积 7. 电泳前将样品置 65 ℃保温 5-10 分钟，取出 后置冰浴骤冷 8. 使用标准反应缓冲液及温度 9. 适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏 10. 使用最佳反应体系
限制性内切酶应用.pptx
第8页/共43页
II型限制性内切酶的分类（一）
❖
内切酶中最普遍的是象Hha I、Hind III和
Not I这样在识别序列中进行切割的酶。这一类
酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都
以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的
是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到
DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的
位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。 通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X Buffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降 解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可 相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶 来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完 全反应。
II型限制性内切酶的分类（二）
❖
IIS型酶，比如Fok I和Alw I，它们在识别位点之外切开
DNA。这些酶的大小居中，约为400-650个氨基酸左右；它们
识别连续的非对称序列，有一个结合识别位点的域和一个专门
切割DNA的功能域。一般认为这些酶主要以单体的形式结合到
DNA上，但与临近的酶结合成二聚体，协同切开DNA链。因此
序列的功能域构成C端，或以独立的亚基形式存在。
当这些酶与底物结合时，它们或行使限制性内切酶的
功能切开底物，或作为修饰酶将其甲基化。
第11页/共43页
一些概念
❖粘末端和平末端 ❖同尾酶 ❖同裂酶 ❖同识异切酶 ❖消化 ❖星号活力
第12页/共43页
同裂酶和同尾酶：
同裂酶： 有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺
段丢失了可被Mst II或CvnⅠ切开的一个限
制性内切酶位点。由于基因突变改变了限制 性酶切的结果，用Southern blot分析方法 和限制性片段长度多态性（简称RFLP）分析 方法即可对镰刀型红细胞贫血症胎儿做产前 诊断，或对发病家族成员的基因组型进行分 析。
II型限制性内切酶的分类（一）
❖
内切酶中最普遍的是象Hha I、Hind III和
Not I这样在识别序列中进行切割的酶。这一类
酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都
以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的
是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到
DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的
位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。 通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X Buffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降 解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可 相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶 来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完 全反应。
II型限制性内切酶的分类（二）
❖
IIS型酶，比如Fok I和Alw I，它们在识别位点之外切开
DNA。这些酶的大小居中，约为400-650个氨基酸左右；它们
识别连续的非对称序列，有一个结合识别位点的域和一个专门
切割DNA的功能域。一般认为这些酶主要以单体的形式结合到
DNA上，但与临近的酶结合成二聚体，协同切开DNA链。因此
序列的功能域构成C端，或以独立的亚基形式存在。
当这些酶与底物结合时，它们或行使限制性内切酶的
功能切开底物，或作为修饰酶将其甲基化。
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一些概念
❖粘末端和平末端 ❖同尾酶 ❖同裂酶 ❖同识异切酶 ❖消化 ❖星号活力
第12页/共43页
同裂酶和同尾酶：
同裂酶： 有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺
段丢失了可被Mst II或CvnⅠ切开的一个限
制性内切酶位点。由于基因突变改变了限制 性酶切的结果，用Southern blot分析方法 和限制性片段长度多态性（简称RFLP）分析 方法即可对镰刀型红细胞贫血症胎儿做产前 诊断，或对发病家族成员的基因组型进行分 析。
质粒DNA的制备限制性内切酶切割重组PPT课件( 37页)
1.质粒DNA的提取与纯化(P70碱法)
2.限制性内切酶的酶切鉴定(P82)
3.定性鉴定:DNA 的琼脂糖凝胶电 泳
4.定量检测：DNA 的紫外分光光度法 测定(P39)
实验目的
掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的 作用 ;
掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切 酶
一.质粒DNA的提取
(1)重组质粒;
(2)BamHI 、Hind Ⅲ限制性内切酶;
(3)反应缓冲液。
32
2.3 实验步骤
(1)建立反应体系 (2)酶切反应（温育12h） (3)电泳鉴定（下次实验课内容）
33
2.4 双酶切体系
质粒DNA 10×M buffer BamHⅠ HindⅢ
ddH2O
10μl 2μl 1μl 1μl 6μl
主要存在于细菌体内。 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶 切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。
26
1.2 分类
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
1.3 作用
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰 系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。
1.4 命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
•
3、命运给你一个比别人低的起点是想告诉你，让你用你的一生去奋斗出一个绝地反击的故事，所以有什么理由不努力!
•
4、心中没有过分的贪求，自然苦就少。口里不说多余的话，自然祸就少。腹内的食物能减少，自然病就少。思绪中没有过分欲，自然忧就少。大悲是无泪的，同样大悟
无言。缘来尽量要惜，缘尽就放。人生本来就空，对人家笑笑，对自己笑笑，笑着看天下，看日出日落，花谢花开，岂不自在，哪里来的尘埃!
2.限制性内切酶的酶切鉴定(P82)
3.定性鉴定:DNA 的琼脂糖凝胶电 泳
4.定量检测：DNA 的紫外分光光度法 测定(P39)
实验目的
掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的 作用 ;
掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切 酶
一.质粒DNA的提取
(1)重组质粒;
(2)BamHI 、Hind Ⅲ限制性内切酶;
(3)反应缓冲液。
32
2.3 实验步骤
(1)建立反应体系 (2)酶切反应（温育12h） (3)电泳鉴定（下次实验课内容）
33
2.4 双酶切体系
质粒DNA 10×M buffer BamHⅠ HindⅢ
ddH2O
10μl 2μl 1μl 1μl 6μl
主要存在于细菌体内。 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶 切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。
26
1.2 分类
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
1.3 作用
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰 系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。
1.4 命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
•
3、命运给你一个比别人低的起点是想告诉你，让你用你的一生去奋斗出一个绝地反击的故事，所以有什么理由不努力!
•
4、心中没有过分的贪求，自然苦就少。口里不说多余的话，自然祸就少。腹内的食物能减少，自然病就少。思绪中没有过分欲，自然忧就少。大悲是无泪的，同样大悟
无言。缘来尽量要惜，缘尽就放。人生本来就空，对人家笑笑，对自己笑笑，笑着看天下，看日出日落，花谢花开，岂不自在，哪里来的尘埃!
基因操作工具酶PPT课件
α- 32P-dATP
EcoR I 酶切末端
同位素标记的EcoR I 酶切末端
Back
3.3 Taq DNA聚合酶
显著特点：热稳定性。70℃反应2h残留活性90 %； 93℃ 反应 2 h残留活性60% ；94℃ 反应 2 h残 留活性40%。
应用：（1）对DNA的特定片段进行体外扩增； （2） DNA序列测定。
Back
2 DNA连接酶
2.1 定义及功能 2.2 种类及作用机理 2.3 使用时的注意事项
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2.1 定义及功能
DNA连接酶（DNA ligase）： 可使一段DNA 3`-OH末端和5`-P 末端
形成3`,5`-磷酸二酯键，把两DNA片段 连在一起封闭双链上形成的切口的酶。
OH P
5`
• 若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个 字母（大写）
• 若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先 后顺序用罗马字母表示。
例如：EcoRⅠ 从大肠杆菌R株分离的第一种限制酶命名为 EcoRⅠ， 其中E 代表属名（Escherichia)，co 代表种名（coli)， R 代表株系（RY13），Ⅰ 代表该菌株中首次分离到。
应用：缺口平移法制备DNA分子杂交探针
缺口
DNase I DNA聚合酶 I
DNA聚合酶 I dNTP*
缺口
缺口平移法制备DNA分子探针 Back
3.2 Klenow聚合酶
活性： 5`→3`聚合活性，3`→5` 外切酶活性，无5`→3`
外切酶活性。 用途： （1）填补或标记DNA的3`隐蔽末端； （2）催化合成cDNA第二链； （3）DNA序列测定
5-7 bp非对称序 列
第2讲 限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶
Restriction endonucleases
切割位点
识别位点处。
切开双链DNA。形成粘性末端（cohesine ends） 或平齐末端（blunt ends）。如：
粘性末端（sticky ends，cohesine ends） 含有几个核苷酸单链的末端。
分两种类型：
① 5’端凸出（如EcoR I切点）
由限制性物理图谱可获得如下信息：
①DNA大小； ②零点（环形图谱的起止点）； ③Ori； ④选择标记;
举例
常用的切割方法：单酶切、双酶切和部分酶切。
A
B
4kb
1.5kb 1kb 0.5kb
7kb 6kb 4.5kb 4kb 3kb 2.5kb 2kb 1.5kb 1kb 0.5kb
1kb 1.5kb 0.5kb 4kb
② 3’端凸出（如Pst I切点）1. 完全消化Fra bibliotek切割方式
内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。
1 23
4
12 3
4
2. 不完全消化 / 局部消化 只有有限数量的酶切位点被切开。
1 23
4
1
4
通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶 的用量可达到局部消化的目的。
DNA分子的限制性图谱 （restriction mapping，RM）
A为完全酶切 B为部分酶切
限制性物理图谱即限制性内切核酸酶作图。简单 地说就是DNA分子中限制性内切核酸酶切割位点 的定位，即DNA分子中各种不同限制性内切核酸 酶的酶切位点的线性排列图。
即标明限制酶在DNA分子上的限制性位点的数目、 限制性片段大小及其线性排列的顺序。
RM的表现形式（3种）： ①环形（图） ②线条形（图） ③环行与线条形相结合（图）
Restriction endonucleases
切割位点
识别位点处。
切开双链DNA。形成粘性末端（cohesine ends） 或平齐末端（blunt ends）。如：
粘性末端（sticky ends，cohesine ends） 含有几个核苷酸单链的末端。
分两种类型：
① 5’端凸出（如EcoR I切点）
由限制性物理图谱可获得如下信息：
①DNA大小； ②零点（环形图谱的起止点）； ③Ori； ④选择标记;
举例
常用的切割方法：单酶切、双酶切和部分酶切。
A
B
4kb
1.5kb 1kb 0.5kb
7kb 6kb 4.5kb 4kb 3kb 2.5kb 2kb 1.5kb 1kb 0.5kb
1kb 1.5kb 0.5kb 4kb
② 3’端凸出（如Pst I切点）1. 完全消化Fra bibliotek切割方式
内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。
1 23
4
12 3
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2. 不完全消化 / 局部消化 只有有限数量的酶切位点被切开。
1 23
4
1
4
通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶 的用量可达到局部消化的目的。
DNA分子的限制性图谱 （restriction mapping，RM）
A为完全酶切 B为部分酶切
限制性物理图谱即限制性内切核酸酶作图。简单 地说就是DNA分子中限制性内切核酸酶切割位点 的定位，即DNA分子中各种不同限制性内切核酸 酶的酶切位点的线性排列图。
即标明限制酶在DNA分子上的限制性位点的数目、 限制性片段大小及其线性排列的顺序。
RM的表现形式（3种）： ①环形（图） ②线条形（图） ③环行与线条形相结合（图）
DNA 的限制性内切酶酶切分析
6.观察结果：紫外分析仪上254nm观察，DNA存在处显绿色荧光条带 ，
观察酶切后与未酶切质粒的DNA带位置。
100bp DNA Marker 未酶切质粒
已酶切质 粒
点样孔
3000bp 1500bp 1000bp
500bp
2.96kp 1.9kp
注意事项
1. 第一步确保样品加到反应体系中,若有粘壁，用掌型离心机离 心到底部!
EcoR I
Bcl-2 (1.9kb)
操作步骤（改动）
1.酶切:
20ul反应体系
组分
加入体积
灭菌双蒸水
11ul
10×buffer H(含BSA） 2ul
质粒DNA
5ul
10U/ul EcoRI 2ul
掌型离心机混匀，37℃水浴反应1h
2.制胶(0.8%)：称取0.48g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1×TAE缓 冲液60ml，微波炉加热至沸腾，摇匀，至无颗粒。
3.倒胶：胶冷却至60℃左右(不烫手)，缓缓倒入电泳槽 (先胶布 封口，放好梳子)。 4.点样：1 ul含SYBR Green I的载样buffer
+5ul酶切产物 或+5ul 未酶切的质粒, 混匀。 （点样孔置负极端）
5.电泳：稳压条件下90V电泳，待染料(指示过5V/cm胶长度）
6.电泳时电场强度不超过5V/cm胶长
思考题：
1. DNA的纯度会不会影响酶切产物的质量？如果会，请 说明原因。
2. 比较本实验酶切后与未酶切质粒的电泳图谱，综合前 两个实验，分析可能的原因
2. 当样品在37℃ 水浴时，要盖紧盖子，否则水汽进入管内，使 反应体积大大增加，造成酶切失败
3. RE一定要在低温(－20℃)下贮存(含50％甘油) ，每次吸取后 应放在冰盒，用完后立即放在-20℃，新购的大包装酶应先分装
观察酶切后与未酶切质粒的DNA带位置。
100bp DNA Marker 未酶切质粒
已酶切质 粒
点样孔
3000bp 1500bp 1000bp
500bp
2.96kp 1.9kp
注意事项
1. 第一步确保样品加到反应体系中,若有粘壁，用掌型离心机离 心到底部!
EcoR I
Bcl-2 (1.9kb)
操作步骤（改动）
1.酶切:
20ul反应体系
组分
加入体积
灭菌双蒸水
11ul
10×buffer H(含BSA） 2ul
质粒DNA
5ul
10U/ul EcoRI 2ul
掌型离心机混匀，37℃水浴反应1h
2.制胶(0.8%)：称取0.48g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1×TAE缓 冲液60ml，微波炉加热至沸腾，摇匀，至无颗粒。
3.倒胶：胶冷却至60℃左右(不烫手)，缓缓倒入电泳槽 (先胶布 封口，放好梳子)。 4.点样：1 ul含SYBR Green I的载样buffer
+5ul酶切产物 或+5ul 未酶切的质粒, 混匀。 （点样孔置负极端）
5.电泳：稳压条件下90V电泳，待染料(指示过5V/cm胶长度）
6.电泳时电场强度不超过5V/cm胶长
思考题：
1. DNA的纯度会不会影响酶切产物的质量？如果会，请 说明原因。
2. 比较本实验酶切后与未酶切质粒的电泳图谱，综合前 两个实验，分析可能的原因
2. 当样品在37℃ 水浴时，要盖紧盖子，否则水汽进入管内，使 反应体积大大增加，造成酶切失败
3. RE一定要在低温(－20℃)下贮存(含50％甘油) ，每次吸取后 应放在冰盒，用完后立即放在-20℃，新购的大包装酶应先分装
限制性内切酶的应用
限制性内切酶在生物传感器中的优势：高特异性、高灵敏度、操作简便等
基因组测序：限制性内切酶在DNA片段的精确切割中起到关键作用，是基因组测序的基础步骤之一。
分子生物学研究：限制性内切酶在分子生物学研究中用于制备特定DNA片段，是基因克隆、基因表 达和基因功能研究的重要工具。
生物技术药物开发：限制性内切酶在生物技术药物开发中用于对目的基因进行精确的切割和调控， 从而实现基因治疗和基因疫苗等创新药物的开发。
在基因表达研究中的应 用：通过限制性内切酶 对基因进行切割，可以 研究基因的表达调控机 制。
在疾病诊断中的应用： 限制性内切酶可以用于 检测特定的基因突变或 变异，有助于疾病的早 期诊断。
在个性化医疗中的应用： 限制性内切酶可以用于 编辑患者的基因，为个 性化医疗提供技术支持。
限制性内切酶在基 因编辑技术中的应 用，如CRISPRCas9系统，可用 于创建疾病模型， 以研究疾病的发病 机制和治疗方法。
合成生物学：限制性内切酶在合成生物学领域中用于设计和构建人工生物系统，从而实现精确控制 细胞代谢和行为的目的。
PART SIX
伦理问题：基因编辑技术可能引发人类基因库的污染，对人类生命尊严和伦理道德造成威胁。
法律问题：基因编辑技术可能违反法律法规，对人类基因库的改变和干预需要得到相关部门的 批准和监管。
责任问题：基因编辑技术可能引发责任问题，例如对基因编辑技术的滥用、误用等行为需要承 担相应的法律责任。
透明度问题：基因编辑技术需要公开透明，对技术的使用和结果需要向公众和相关部门进行报 告和公示。
安全性问题：限制性内切酶在基因 治疗中的使用可能引发不可预测的 副作用和风险
法律问题：限制性内切酶的使用和基 因治疗的应用需要遵守相关法律法规 和伦理准则，以确保安全性和合法性
基因组测序：限制性内切酶在DNA片段的精确切割中起到关键作用，是基因组测序的基础步骤之一。
分子生物学研究：限制性内切酶在分子生物学研究中用于制备特定DNA片段，是基因克隆、基因表 达和基因功能研究的重要工具。
生物技术药物开发：限制性内切酶在生物技术药物开发中用于对目的基因进行精确的切割和调控， 从而实现基因治疗和基因疫苗等创新药物的开发。
在基因表达研究中的应 用：通过限制性内切酶 对基因进行切割，可以 研究基因的表达调控机 制。
在疾病诊断中的应用： 限制性内切酶可以用于 检测特定的基因突变或 变异，有助于疾病的早 期诊断。
在个性化医疗中的应用： 限制性内切酶可以用于 编辑患者的基因，为个 性化医疗提供技术支持。
限制性内切酶在基 因编辑技术中的应 用，如CRISPRCas9系统，可用 于创建疾病模型， 以研究疾病的发病 机制和治疗方法。
合成生物学：限制性内切酶在合成生物学领域中用于设计和构建人工生物系统，从而实现精确控制 细胞代谢和行为的目的。
PART SIX
伦理问题：基因编辑技术可能引发人类基因库的污染，对人类生命尊严和伦理道德造成威胁。
法律问题：基因编辑技术可能违反法律法规，对人类基因库的改变和干预需要得到相关部门的 批准和监管。
责任问题：基因编辑技术可能引发责任问题，例如对基因编辑技术的滥用、误用等行为需要承 担相应的法律责任。
透明度问题：基因编辑技术需要公开透明，对技术的使用和结果需要向公众和相关部门进行报 告和公示。
安全性问题：限制性内切酶在基因 治疗中的使用可能引发不可预测的 副作用和风险
法律问题：限制性内切酶的使用和基 因治疗的应用需要遵守相关法律法规 和伦理准则，以确保安全性和合法性
实验五质粒酶切质粒限制性内切酶消化酶切完整PPT
2) 命名原则
• 1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原则，1980年Roberts在此基础 上进行了系统分类
① 限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名 (genus)；第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)。 ② 第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)。 ③ 若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的 先后顺序用罗马字母表示。
第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
Eco R V (10442)
35S prom oter UTR
多克隆位点 p U C 1 8 M C S lacZ prom oter
35S prom oter
Eco R V (8842)
绿色荧光蛋白基因 GFP N O S 终止子加尾信号
T-D N A right border
第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源 基因的插入。
第五步：是否含有表达系统元件，即：启动子——核糖体结合位点——克隆位点——转录终止信号。
T ×C第CGG四6步mA：TC 再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源 DNA片段。 dam甲基化酶识别序列切割位点应用多功能单功能
双功能
异源三聚体
同源三聚体
异源二聚体
ATP、 Mg2+ 、SAM
Mg2+
ATP、 Mg2+
距识别序列1kb处
4~6bp回文序列
距识别序列下游 24~26bp处
随机性切割
识别序列内或附近 特异切割
随机性切割
不常用
常用
数量很少，无实际 作用
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶
目 录
• 限制性核酸内切酶的概述 • 限制性核酸内切酶的分类 • 限制性核酸内切酶的工作原理 • 限制性核酸内切酶的应用 • 限制性核酸内切酶的未来发展
01
限制性核酸内切酶的概述
定义和特性
定义
限制性核酸内切酶是一类能识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定 部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。
在生物科学领域的应用
基因克隆和DNA重组技 术
限制性核酸内切酶是基因克隆和DNA重组 技术中的关键工具，用于切割和重组DNA 片段。
基因诊断和基因治疗
限制性核酸内切酶可用于检测和纠正基因突变，为 基因诊断和基因治疗提供有效手段。
生物制药和生物技术
限制性核酸内切酶在生物制药和生物技术领 域中用于生产重组蛋白、抗体和治疗性核酸 等生物制品。
双活性酶
02
同时具有切割和磷酸酶活性，如BstAPI。
多活性酶
03
同时具有多种活性，如FokI同时具有切割、磷酸酶和甲基化酶
活性。
03
限制性核酸内切酶的工作原理
识别和切割DNA的过程
识别
限制性核酸内切酶能够识别特定的 DNA序列，通常是4-6个核苷酸组成 的序列。
切割
在识别位点处，限制性核酸内切酶将 DNA链切开，形成两个断开的磷酸二 酯键。
产生黏性末端
限制性核酸内切酶切割DNA后，通常产生具有突出末端的片段，也称为黏性末端 。这种黏性末端可以用于DNA的连接和重组。
04
限制性核酸内切酶的应用
在基因工程中的应用
1 2 3
基因克隆
限制性核酸内切酶能够将DNA分子切割成特定序 列的片段，为基因克隆提供精确的DNA片段。
目 录
• 限制性核酸内切酶的概述 • 限制性核酸内切酶的分类 • 限制性核酸内切酶的工作原理 • 限制性核酸内切酶的应用 • 限制性核酸内切酶的未来发展
01
限制性核酸内切酶的概述
定义和特性
定义
限制性核酸内切酶是一类能识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定 部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。
在生物科学领域的应用
基因克隆和DNA重组技 术
限制性核酸内切酶是基因克隆和DNA重组 技术中的关键工具，用于切割和重组DNA 片段。
基因诊断和基因治疗
限制性核酸内切酶可用于检测和纠正基因突变，为 基因诊断和基因治疗提供有效手段。
生物制药和生物技术
限制性核酸内切酶在生物制药和生物技术领 域中用于生产重组蛋白、抗体和治疗性核酸 等生物制品。
双活性酶
02
同时具有切割和磷酸酶活性，如BstAPI。
多活性酶
03
同时具有多种活性，如FokI同时具有切割、磷酸酶和甲基化酶
活性。
03
限制性核酸内切酶的工作原理
识别和切割DNA的过程
识别
限制性核酸内切酶能够识别特定的 DNA序列，通常是4-6个核苷酸组成 的序列。
切割
在识别位点处，限制性核酸内切酶将 DNA链切开，形成两个断开的磷酸二 酯键。
产生黏性末端
限制性核酸内切酶切割DNA后，通常产生具有突出末端的片段，也称为黏性末端 。这种黏性末端可以用于DNA的连接和重组。
04
限制性核酸内切酶的应用
在基因工程中的应用
1 2 3
基因克隆
限制性核酸内切酶能够将DNA分子切割成特定序 列的片段，为基因克隆提供精确的DNA片段。
第六讲基因工程48ppt课件
2、构造重组•DNA分子
以质粒作载体为例
• 用与提取目的基因相同 的限制酶切割质粒使之 出现一个切口，将目的 基因插入切口处，让目 的基因的黏性末端与切 口上的黏性末端互补配 对后，在连接酶的作用 下连接形成一个环形的 重组DNA分子。
提取质粒并用 限制酶切割
用连接酶将目的 基因和质粒连接
目的基因与质粒的连接
3、将目的基因导入受体细胞并扩增
基因工程中常用的受体细胞有大肠杆 菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物 细胞等。
转化是指外源DNA分子或片段被细菌 细胞吸收，并整合进细胞染色体的遗 传现象，若受体细胞是动/植物细胞， 通常称为转染。
导入受体细胞常用的方法是借鉴细菌 或者病毒侵染细胞的途径。通常还要 对一些受体细胞进行增大通透性的处 理。（氯化钙或高压电脉冲打孔）
先将细胞核内的基因组转录为RNA，以信使RNA（mRNA） 为模板，在逆转录酶的作用下根据碱基互补原则人工合成一段 与之互补的DNA片段，再以此单链DNA为模版，人工合成另 外一条互补的DNA子链，从而获得所需的目的基因。
mRNA→单链DNA→ 双链DNA（cDNA）
DNA合成仪
（3）聚合酶链式反应（PCR） （如目的基因的核酸顺序已知）
在植物转基因中多采用农杆菌作为目的基因受体，再利用 重组农杆菌感染植物细胞进行转化，将目的基因整合到植 物基因中。
（7）转基因动物
转基因动物主要用于生产器官移植的研究，生产对人类有价 值的产品，使动物具有某些可遗传的抗性对付某些疾病与不 良环境，目前出于对安全性考虑，禁止将转基因动物进入食 品。 目前将人的某些基因转入动物，生产某些蛋白类药物已经广 泛实施。一般动物转基因多采用受精卵注射法，将目的基因 直接注射入动物的受精卵中，有一部分生产出的动物细胞内 含有这些目的基因。还有胚胎干细胞法，将目的基因转化胚 胎干细胞，再进行胚发育，一旦成为生殖细胞，可获得稳定 的遗传。
鸟枪法ppt
3.鸟枪法的优缺点
❖优点： 不需要高密度的图谱 速度快、简单、成本低
❖缺点： 拼接组装困难，尤其在重复序列
多的区域
❖主要用于重复序列少、相对简单的原核 生物基因组
用途
• “鸟枪法”最初主要用于测定微生物 基因组序列。近年来，美国塞莱拉公司先 后利用改进的全基因组“鸟枪法”完成了 果蝇和人类基因组的测序工作，证明了它 在测定大基因组上的可行性和有效性。
1使用多种限制性内切酶将生物细胞染色体dna切割成基因水平的许多片段2将这些片段与适当的载体结合将重某一基因的菌株从中将重组的dna分离回收4将重叠的序列进行拼接最终得到dna序列优点
鸟枪法测序
1.定义：
• 将目的DNA随机的处理成大小不同的片段， 再将这些片段的序列连接切酶将生物细胞染 色体DNA切割成基因水平的许多片段
• （2）将这些片段与适当的载体结合，将重 组D转化子中选 出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA 分离回收
• (4)将重叠的序列进行拼接，最终得到DNA 序列
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时具有限制和修饰酶活性。有些酶识别连续序列，并在 识别位点的一端切开DNA链；而另一些酶识别不连续的 序列（如Bcg I：CGANNNNNNTGC），并在识别位点 的两端切开DNA链，产生一小段含识别序列的片段。这
些酶的氨基酸序列各不相同，但其结构组成是一致的。 他们在N端有一个负责切开DNA的功能域，这个域又与 DNA修饰域连接；此外还有一到两个识别特异DNA序 列的功能域构成C端，或以独立的亚基形式存在。当这
大家好
4
❖ 限制性内切酶常常伴随一到两种修饰酶
（甲基化酶）出现。后者的作用是保护细胞自 身的DNA不被限制性内切酶破坏
❖ 限制性内切酶和它的"搭档"--甲基化酶一 起就构成了限制-修饰（R-M）系统。在一些RM系统中，限制性内切酶和修饰酶是两种不同 的蛋白，它们各自独立行使自己的功能；而在 另一些系统中，两种功能由同一种限制-修饰酶 的不同亚基，或是同一亚基的不同结构域来执 行
❖ 在已纯化分类的3000种限制性内切酶中， 已发现了超过250种的特异识别序列。
大家好
3
❖ 保护细菌不受噬菌体的感染，这一观点已 被人们广泛接受。它们作为微生物免疫机制的 一部分行使其功能。当一个没有限制性内切酶 的细菌被病毒感染时，大部分病毒颗粒都能成 功地进行感染。然而一个有限制性内切酶的同 种细菌被成功感染的比率显著下降。出现更多 的限制性内切酶将会起到多重保护作用；而一 个拥有4到5种各自独立的限制性内切酶将会使 细胞坚不可摧。
的形式结合到DNA上，但与临近的酶结合成二
聚体，协同切开DNA链。因此一些IIS型的酶
在切割有多个识别位点的DNA分子时，活性可
能更高。
大家好
11
II型限制性内切酶的分类（三）
❖ 第三种II型限制性内切酶（有时也被称为IV型限制
性内切酶）是一类较大的、集限制和修饰功能于一体的 酶，通常由850-1250个碱基组成，在同一条多肽链上同
切酶可以切割，另一种则不能。例如HpaⅡ 和MspⅠ的识别顺序都是
5’……CCGG……3’，如果其中有5’-甲基
胞嘧啶，则只有HpaⅡ能够切割。这些有相
同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工 酶）。
大家好
14
同尾酶：
有时两种酶切割序列不完全相同，但却能 产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶， 可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但 原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生
点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片
段和跑胶条带，因此是三类限制性内切酶中唯
一用于DNA分析和克隆的一类。II型限制性内
切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组成，
ห้องสมุดไป่ตู้
因而任意一种限制性内切酶的氨基酸序列可能
与另一种限制性内切酶的氨基酸序列截然不同。
实际上，从已知的情况上看，这些酶很可能是
在进化过程中各自独立产生的，而非来源于同 一个祖先。
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5
限制性内切酶命名的次序如下：
❖ A） 用3个字母代表来源的生物（如Bam代 表 Bacillus amyloliquefaciens）
❖ B） 1个字母或阿拉伯数字代表菌株 （BamH）
❖ C） 1个罗马字母代表发现或鉴定的次序 （BamHI）
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6
❖
按照亚基组成、酶切位置、识别位点、
辅助因子等因素划分为三大类
❖ I型限制性内切酶是一类兼有限制性内切酶 和修饰酶活性的多个亚基的蛋白复合体。它们 在识别位点很远的地方任意切割DNA链。尽管 I型酶在生化研究中很有意义，但由于不产生确 定的限制片段和明确的电泳条带，因而不具备 实用性。
大家好
7
❖
II型酶在其识别位点之中或临近的确定位
氨酸腺苷的存在。这些酶一般都比较小，亚基一般 都在200-300个氨基酸左右。
大家好
10
❖
IIS型酶，比如Fok I和Alw I，它们在识别
位点之外切开DNA。这些酶的大小居中，约为
400-650个氨基酸左右；它们识别连续的非对称
序列，有一个结合识别位点的域和一个专门切
割DNA的功能域。一般认为这些酶主要以单体
这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成
商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体 的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列； 但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非 对称序列。一些酶识别连续的序列（如EcoR I识别 GAATTC）；而另一些识别不连续的序列（如Bgl I 识别GCCNNNNNGGC）。限制性内切酶的切割后 产生一个3‘羟基端和一个5’磷酸基团。它们的活性 要求镁离子的存在，而相应的修饰酶则需要S-甲硫
❖ 当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代 流传开来的时候，以NEB为代表的许多公司寻 找更多的限制性内切酶
大家好
2
❖ 限制性内切酶的形式多样，从大小上来说， 它们可以小到如Pvu II（157个氨基酸），也可 以比1250个氨基酸的Cje I更大
❖ 除了某些病毒以外，限制性内切酶只在原 核生物中被发现
限制性内切酶的应用
病毒免疫室
大家好
1
限制性内切酶的发现
❖ 30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异 性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限 制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而
这种“限制”病毒生存的办法则可归功于细胞 内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。这些酶 可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基 因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组 成、功能及表达非常有用的工具。
一个新的酶切位点。如Xba Ⅰ(T`CTAGA)、 Nhe Ⅰ(G`CTAGC） 、Spe Ⅰ(A`CTAGT)切割
大家好
8
❖ III型限制性内切酶也是兼有限制-修饰两种 功能的酶。它们在识别位点之外切开DNA链， 并且要求识别位点是反向重复序列；它们很少 能产生确定的切割片段，因而不具备实用价值， 也没有人将其商业化。
大家好
9
II型限制性内切酶的分类（一）
❖ 内切酶中最普遍的是象Hha I、Hind III和Not I
些酶与底物结合时，它们或行使限制性内切酶的功能切 开底物，或作为修饰酶将其甲基化。
大家好
12
❖ 粘末端和平末端 ❖ 同尾酶 ❖ 同裂酶 ❖ 同识异切酶 ❖ 消化 ❖ 星号活力
大家好
13
同裂酶和同尾酶：
同裂酶： 有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺
序和切割位置都相同，其差别只在于当识别 顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内
些酶的氨基酸序列各不相同，但其结构组成是一致的。 他们在N端有一个负责切开DNA的功能域，这个域又与 DNA修饰域连接；此外还有一到两个识别特异DNA序 列的功能域构成C端，或以独立的亚基形式存在。当这
大家好
4
❖ 限制性内切酶常常伴随一到两种修饰酶
（甲基化酶）出现。后者的作用是保护细胞自 身的DNA不被限制性内切酶破坏
❖ 限制性内切酶和它的"搭档"--甲基化酶一 起就构成了限制-修饰（R-M）系统。在一些RM系统中，限制性内切酶和修饰酶是两种不同 的蛋白，它们各自独立行使自己的功能；而在 另一些系统中，两种功能由同一种限制-修饰酶 的不同亚基，或是同一亚基的不同结构域来执 行
❖ 在已纯化分类的3000种限制性内切酶中， 已发现了超过250种的特异识别序列。
大家好
3
❖ 保护细菌不受噬菌体的感染，这一观点已 被人们广泛接受。它们作为微生物免疫机制的 一部分行使其功能。当一个没有限制性内切酶 的细菌被病毒感染时，大部分病毒颗粒都能成 功地进行感染。然而一个有限制性内切酶的同 种细菌被成功感染的比率显著下降。出现更多 的限制性内切酶将会起到多重保护作用；而一 个拥有4到5种各自独立的限制性内切酶将会使 细胞坚不可摧。
的形式结合到DNA上，但与临近的酶结合成二
聚体，协同切开DNA链。因此一些IIS型的酶
在切割有多个识别位点的DNA分子时，活性可
能更高。
大家好
11
II型限制性内切酶的分类（三）
❖ 第三种II型限制性内切酶（有时也被称为IV型限制
性内切酶）是一类较大的、集限制和修饰功能于一体的 酶，通常由850-1250个碱基组成，在同一条多肽链上同
切酶可以切割，另一种则不能。例如HpaⅡ 和MspⅠ的识别顺序都是
5’……CCGG……3’，如果其中有5’-甲基
胞嘧啶，则只有HpaⅡ能够切割。这些有相
同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工 酶）。
大家好
14
同尾酶：
有时两种酶切割序列不完全相同，但却能 产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶， 可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但 原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生
点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片
段和跑胶条带，因此是三类限制性内切酶中唯
一用于DNA分析和克隆的一类。II型限制性内
切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组成，
ห้องสมุดไป่ตู้
因而任意一种限制性内切酶的氨基酸序列可能
与另一种限制性内切酶的氨基酸序列截然不同。
实际上，从已知的情况上看，这些酶很可能是
在进化过程中各自独立产生的，而非来源于同 一个祖先。
大家好
5
限制性内切酶命名的次序如下：
❖ A） 用3个字母代表来源的生物（如Bam代 表 Bacillus amyloliquefaciens）
❖ B） 1个字母或阿拉伯数字代表菌株 （BamH）
❖ C） 1个罗马字母代表发现或鉴定的次序 （BamHI）
大家好
6
❖
按照亚基组成、酶切位置、识别位点、
辅助因子等因素划分为三大类
❖ I型限制性内切酶是一类兼有限制性内切酶 和修饰酶活性的多个亚基的蛋白复合体。它们 在识别位点很远的地方任意切割DNA链。尽管 I型酶在生化研究中很有意义，但由于不产生确 定的限制片段和明确的电泳条带，因而不具备 实用性。
大家好
7
❖
II型酶在其识别位点之中或临近的确定位
氨酸腺苷的存在。这些酶一般都比较小，亚基一般 都在200-300个氨基酸左右。
大家好
10
❖
IIS型酶，比如Fok I和Alw I，它们在识别
位点之外切开DNA。这些酶的大小居中，约为
400-650个氨基酸左右；它们识别连续的非对称
序列，有一个结合识别位点的域和一个专门切
割DNA的功能域。一般认为这些酶主要以单体
这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成
商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体 的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列； 但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非 对称序列。一些酶识别连续的序列（如EcoR I识别 GAATTC）；而另一些识别不连续的序列（如Bgl I 识别GCCNNNNNGGC）。限制性内切酶的切割后 产生一个3‘羟基端和一个5’磷酸基团。它们的活性 要求镁离子的存在，而相应的修饰酶则需要S-甲硫
❖ 当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代 流传开来的时候，以NEB为代表的许多公司寻 找更多的限制性内切酶
大家好
2
❖ 限制性内切酶的形式多样，从大小上来说， 它们可以小到如Pvu II（157个氨基酸），也可 以比1250个氨基酸的Cje I更大
❖ 除了某些病毒以外，限制性内切酶只在原 核生物中被发现
限制性内切酶的应用
病毒免疫室
大家好
1
限制性内切酶的发现
❖ 30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异 性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限 制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而
这种“限制”病毒生存的办法则可归功于细胞 内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。这些酶 可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基 因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组 成、功能及表达非常有用的工具。
一个新的酶切位点。如Xba Ⅰ(T`CTAGA)、 Nhe Ⅰ(G`CTAGC） 、Spe Ⅰ(A`CTAGT)切割
大家好
8
❖ III型限制性内切酶也是兼有限制-修饰两种 功能的酶。它们在识别位点之外切开DNA链， 并且要求识别位点是反向重复序列；它们很少 能产生确定的切割片段，因而不具备实用价值， 也没有人将其商业化。
大家好
9
II型限制性内切酶的分类（一）
❖ 内切酶中最普遍的是象Hha I、Hind III和Not I
些酶与底物结合时，它们或行使限制性内切酶的功能切 开底物，或作为修饰酶将其甲基化。
大家好
12
❖ 粘末端和平末端 ❖ 同尾酶 ❖ 同裂酶 ❖ 同识异切酶 ❖ 消化 ❖ 星号活力
大家好
13
同裂酶和同尾酶：
同裂酶： 有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺
序和切割位置都相同，其差别只在于当识别 顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内