细菌的分离培养及培养性状的观察
细菌的分离培养
细菌的分离培养实验目的：掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。
实验材料：菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。
实验内容：一、平板划线接种法（分离培养法）原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。
若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。
用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养。
操作方法（三区划线法）：1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。
2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。
划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。
3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。
4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。
5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37°C温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。
二、液体培养基接种法用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。
可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。
操作方法：右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。
1、左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。
2、将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。
3、管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37C温箱孵育18-24小时，取出观察生长情况。
实验四 细菌、真菌、放线菌的分离与培养
实验报告课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验实验项目名称：微生物的分离与培养与菌落观察学生姓名：专业：环境工程学号：同组学生姓名：指导老师：实验地点：实验日期：2018 年 10月16日一、实验目的和要求1.掌握微生物接种培养技术2.掌握微生物分离纯化技术3.学习并掌握放菌落形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。
二、实验内容和原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现具有重要价值微生物的主要菌源。
在不同土壤中，各类微生物的数量千差万别。
为了分离获得某种微生物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗生素抑制不需要的微生物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL 抑制霉菌。
通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。
挑取单个菌落转接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯化。
1.菌种的分离纯化：从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“单一性”，防止其他微生物的混入。
2.平板涂布法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
用途上，一般多用于从菌种的纯化;优点是可以观察菌落特征，对混合菌进行分离;但不能计数3.平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
用途一般多用于筛选菌株。
实验五真菌的分离培养及形态观察
实验五真菌的分离培养及形态观察真菌分离培养应考虑所分离真菌的特性，配制合适的培养基，选择所需的气体环境。
同时, 由于真菌分离材料常污染有大量细菌，所以可在培养基中加入抗菌素并在分离培养过程中严格执行无菌操作。
目的要求1．掌握真菌分离培养方法。
2．认识真菌菌落的特征，比较与细菌菌落有何不同。
3．了解真菌载片培养法。
4．掌握观察真菌的基本方法，并观察其形态特征。
操作步骤—、真菌的分离培养方法（－）平板划线分离法1．取适合真菌的琼脂培养基融化，冷至45℃，注入无菌平皿中，每皿15～20ml，制成平板待用。
2．取要分离的材料（如田土、混杂的或污染的真菌培养物、真菌）少许，投入盛无菌水的试管内，振摇，使分离菌悬浮于水中。
3．将接种环经火焰灭菌并冷却后，蘸取上述菌悬浮液，进行平板划线(同细菌的划线法)。
4．划线完毕，置温箱中培养2～5d，待长出菌落后，钓取可疑单个菌落先作制片检查，若只有一种所需要的真菌生长，即可进行钓菌纯培养。
如有杂菌可从单个菌落中钓少许菌制成悬液，再作划线分离培养，有时需反复多次，才得纯种。
另外，也可在放大镜的观察下，用无菌镊子夹取一段待分离的真菌菌丝，直接放在平板上作分离培养，可获得该种真菌的纯培养。
（二）稀释分离法1．取盛有无菌水的试管5支（每管9ml），分别标记1、2、3、4、5号。
取样品（如田土等）1g，投入1号管内，振摇，使悬浮均匀。
2．用1ml灭菌吸管，按无菌操作法，从1号管中吸取1ml悬浮液注入2号管中，并摇匀；同样由2号管取1ml至3号管，依此类推，直至5号管。
注意每稀释一管应更换一支灭菌吸管。
3．用2支无菌吸管分别由4号、5号试管中各取1ml悬液，并分别注入2个灭菌培养皿中，再加入融化后冷至45℃的琼脂培养基约15ml，轻轻在桌面上摇转，静置，使冷凝成平板。
然后倒置温箱中培养，2～5d后，从中挑选单个菌落，并移植于斜面上。
二．真菌培养性状观察（一）真菌在固体培养基上的生长表现1 .酵母菌菌落：酵母菌在固体培养基上多呈油脂状或蜡脂状，表面光滑、湿润、黏稠，有的表面呈粉粒状、粗糙或皱褶。
细菌的分离培养与培养性状观察
冷至约 ５ ０ ￣ Ｃ， 用接 种 环取 一环 培 养物 于 第 一管 内 ， 随
即用两手掌心搓转振荡 ， 由第一管取入第二管 ， 搓匀 又从第二管取出一环至第三管振荡后 ，分别倒入 ３ 个 灭 菌 空平 板 内 ， 摇 匀待 凝 固后 ， 倒 置于 ３ ７ ℃温箱 内 ‘ 培养 ， ２ ４小时后观察结果 。第一个平板菌落最多 ， 第 二个 、 第三个递减 ， 可得到单个菌落 。
约５ ０克置于密封容器内与接种的厌氧菌共 同培养。 焦 性 没食 子 酸 法是 利 用 焦 性 没食 子 酸与 碱作 用
板盖使 之 成 １ 条狭 缝 ， 并靠 近火 焰 旁 。右 手持 接种 环
克， １ ０ ％氢氧化钠或氢氧化钾 １ ０ 毫升。 常用方法有试 管培 养 法 ， 干 板 培养 法 ， 干燥器 培养 法 。 二 氧 化 碳 培 养 法 利 用 少 数 细 菌 如 牛 型 布 氏 杆
菌 ，在含 有 ５ ％～ １ ０ ％的二 氧化碳 环境 下生 长 良好 ， 常 用 的方 法 为 烛缸 法 。取 干燥 器 （ 盖 口抹 上 凡上 林 ） ， 将 接种 好 的平板 或 斜 面放 入 器 内 ，点 燃 燃烛 直 立 于 缸 的隔 板 上 ， 盖上盖子 ， 因器 内氧 气 耗 尽 蜡 烛 自灭 ，
１ ～ ２ 毫米者为小菌落 ； ２ ～ ４ 毫米者为 中等大菌落 ； ４ 毫 米或 更 大者 为大 菌 落或 巨大 菌落 。菌落外 形 有 圆形 、 不 规则 形 、 卷毛状 、 根 状 等 。隆 起 度呈 扩 散 、 台状 、 凸
起、 乳头 状 、 突脐 状 、 覆轮 状 等 。边缘 如整 齐 、 缺刻 状 、 圆锯齿 形 、 波 状 裂 片状 、 镀 边 等 。观察 菌 落 表 面是 否 光滑 、 皱褶 、 颗 粒状 、 同心环 状 、 龟 裂状 等 。表 面光 泽
微生物实验中的接种分离和培养操作步骤
微生物实验中的接种、分离和培养操作步骤微生物实验中的接种、分离和培养操作步骤一、目的要求1、掌握各种分离、接种方法。
2、掌握无菌操作基本环节。
二、实验说明微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必需从中把它们分离出来。
在保存菌种时不慎受到到污染也需予以分纯。
微生物分离和纯化的方法很多，但基本原理却是相似的，即将待分离的样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。
然而上述工作又离不开接种，即将一种微生物移到另一灭过菌的培养基上的过程。
三、实验材料1、恒温培养箱。
2、接种环、玻璃棒、吸管、酒精灯。
3、培养基（上次实验配制的）。
4、大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌。
四、方法步骤（一）接种的操作1、斜面接种（接金黄葡萄球菌）（1）操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后点燃酒精灯。
（2）将菌种管和斜面握在左手大姆指和其它四指之间，使斜面和有菌种的一面向上，并处于水平位置。
（3）先将菌种和斜面的棉塞旋转一下，以便接种时便于拔出。
（4）左手拿接种环（如握钢笔一样），以火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管其余部位也过火灭菌。
（5）用右手的无名指、小指和手掌将菌种管和待接斜面试管的棉花塞或试管帽同时拔出，然后让试管口缓缓过火灭菌（切勿烧过烫）。
（6）将灼烧过的接种环伸入菌种管内，接种环在试管内壁或未长菌苔的培养基上接触一下，让其充分冷却，然后轻轻刮取少许菌苔，再从菌种管内抽出接种环。
（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。
从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。
有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。
从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。
有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
（8）接种完毕后抽出接种环灼烧管口，塞上棉塞。
微生物检验学之细菌的培养与分离技术
细菌的培养与分离技术一、基本条件二、细菌的接种与分离技术三、细菌培养的方法四、细菌的生长现象五、细菌L型的检查一、基本条件（一）细菌实验室中华人民共和国卫士行业标准中的微生物和生物医学实验室生物安全通过准则。
1.细菌室必须安装严密的门窗，以防室内环境受到外界的污染。
且室内禁用风扇，避免细菌的播散。
2.细菌室必须安装供空气消毒的紫外线灯，置于操作台上面1m处，每天开始工作前照射20min。
3.室内应备有消毒剂，用于试验中发生菌液洒溅时的及时消毒处理。
同时还应备有供工作人员浸手用的盛有消毒剂的水盆、肥皂及自来水源等，应安装冲眼器。
4.室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地面至少一周用消毒剂擦洗1次。
5.对接收的标本、无菌器具、用过的物品等应明显分开并放在指定位置。
同时要对用过的物品及时进行灭菌处理。
6.细菌室根据当地的气温特点，安装空调机，以适合细菌实验工作。
同时室内应设置必要的消防设备。
7.细菌室必须安装生物安全柜，工作人员应在柜内处理标本及病原微生物。
（二）无菌实验室无菌实验室是细菌实验室内用于无菌操作的小室，其内部装饰、消毒条件要求更严格。
1.无菌室应完全封闭，人员出入应有两道门，其间应隔有缓冲区。
2.用前应以紫外线消毒30min，定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。
3.在无菌室中一般仅限于分装无菌的培养基及传染性强的细菌的接种，不进行有菌标本的分离及其他操作。
4.无菌室内应仅限操作人员进入，而且进入无菌室应着隔离衣和专用鞋，操作时戴口罩，随时保证室内的无菌状态。
5.无菌室应配备空调设备，保证不因室温而影响工作。
（三）基本设备和器具细菌实验室内必须具备的设备和器具有：用于细菌培养的温箱、CO2培养箱、厌氧培养设备；用于观察细菌形态及标本直接镜检的显微镜；用于物品灭菌的高压蒸气灭菌器、干烤箱；用于储存培养基、诊断用血清、抗生素及菌种等的冰箱和冷藏柜；用于挑取标本、接种等的接种器具，包括接种环和接种针；制备培养基时用的pH计；细菌检验操作时用于接种器具灭菌的火焰灯或酒精灯；还有各种必用的平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。
实验三 病原菌的分离培养
注：试管加棉塞(最好)
培养基分装完毕以后，在管口
上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好。
加棉塞时，应使棉塞长度的2/3在试管口内，如下图所示。
（五）病原真菌的分离培养
1．组织分离法 按照以下步骤进行：
(1) 取灭菌培养皿一个，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料 和分离人的姓名。 提示：为了保证无菌操作，应注意下面几点：工作前最好将 所需的物品都放在超净工作台内，工作中临时去取容易带来杂菌； 保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要 用70％酒精擦拭双手；工作中，特别在使用无菌操作间时，呼吸 要轻，不要说话。 (2) 取真菌叶斑病的新鲜病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个 病斑，用解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块(边长3--4mm)病 组织数块。 提示：选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌 混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋 生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。
4. 在空试管内倒入2～3mL已经溶解好的培养基，
【注意尽量不要让培养基沾到试管口】塞好硅胶
塞. 5.放入烧杯中,高压蒸汽灭菌. 6.摆斜面,凝固后放冰箱备用.
用于活化菌种， 或培养菌种的斜面
用于保存菌种的斜面
搁置斜面
当培养基冷却至50℃左右时，将试管带棉塞的一
端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的 斜面的长度不超过试管总长的一半。
（二）灭菌与消毒
任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培 养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。 常用的灭菌的方法有：干热灭菌、高压蒸汽灭菌、常压 蒸汽灭菌、常压间歇式灭菌超高温灭菌、过滤除菌、辐源自射灭菌、化学药品灭菌等方法。
细菌的分离培养及培养性状的观察
实验四 细菌的分离培养及培养性状的观察在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。
从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。
分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。
细菌分离培养应先从被检材料或病料中分离培养单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。
目的要求1．学习、掌握需氧菌和厌氧菌分离培养的基本要领和技术。
2．了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状。
3．了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。
4．掌握钓菌、纯培养及移植技术。
操作步骤一．需氧性细菌分离培养法1. 平板划线分离法菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用平板划线法进行纯种分离，此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。
但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20 ml 培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。
划线分离主要有连续划线法（图4-1）和分区划线法（图4-2）两种。
划线法示意图见图4-3。
（1）连续划线法以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落。
将菌种点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余菌体。
将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却，然后从接种细菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30～40度角，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠。
划线完毕，关上皿盖。
灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。
培 养皿倒置于适宜的恒温箱内培养。
培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。
实验四 细菌、真菌、放线菌的分离与培养
实验报告课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验实验项目名称：微生物的分离与培养与菌落观察学生姓名：专业：环境工程学号：同组学生姓名：指导老师：实验地点：实验日期：2018 年 10月16日一、实验目的和要求1.掌握微生物接种培养技术2.掌握微生物分离纯化技术3.学习并掌握放菌落形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。
二、实验内容和原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现具有重要价值微生物的主要菌源。
在不同土壤中，各类微生物的数量千差万别。
为了分离获得某种微生物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗生素抑制不需要的微生物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL 抑制霉菌。
通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。
挑取单个菌落转接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯化。
1.菌种的分离纯化：从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“单一性”，防止其他微生物的混入。
2.平板涂布法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
用途上，一般多用于从菌种的纯化;优点是可以观察菌落特征，对混合菌进行分离;但不能计数3.平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
用途一般多用于筛选菌株。
病原物的分离与培养
病原物的分离与培养病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。
一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。
所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。
病原物的分离与培养，需经以以几个步骤:1.有关器皿的灭菌和消毒；2.制作培养基；3.病原菌的分离4.病原菌的培养。
－、灭菌与消毒灭菌与消毒是两个不同的概念。
灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。
消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。
消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。
(一) 热力灭菌热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。
1．干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。
在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。
因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃)，时间长1～2 h。
但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。
干热灭菌使用的仪器是烘箱。
干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。
火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。
涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。
通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。
此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。
进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；电烘箱内温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。
微生物学理论指导：细菌在培养基中生长现象
（⼀）分离培养基上菌落的⽣长现象 1.观察菌落：菌落的各种特征包括⼤⼩、形状、突起、边缘、颜⾊、表⾯、透明度和粘度等。
根据细菌菌落表⾯特征不同，可将菌落分为三型： （1）光滑型（S型）菌落 （2）粗糙型（R型）菌落 （3）粘液型（M型）菌落 2.⾎琼脂上的溶⾎ α溶⾎：⼜叫草绿⾊溶⾎，菌落周围⾎培养基变为绿⾊环状；红细胞外形完整⽆缺。
β溶⾎：⼜称完全溶⾎，红细胞的溶解在菌落周围形成⼀个完全清晰透明的环。
γ溶⾎：即不溶⾎，菌落周围的培养基没有变化；红细胞没有溶解或⽆缺损。
双环：在菌落周围完全溶解的晕圈外有⼀个部分溶⾎的第⼆圆圈。
如产⽓荚膜梭菌。
3.⽓味：通过某些细菌在平⽫培养基上代谢活动产⽣的⽓味，结合液体培养基上的性状，有助于细菌的鉴定。
如铜绿假单胞菌（⽣姜⽓味）、变形杆菌（巧克⼒烧焦⽓味）、厌氧梭菌（腐败的恶臭味）、放线菌（泥⼟味）等。
4.⾊素 脂溶性⾊素：使菌落本⾝出现颜⾊改变。
如⾦黄⾊葡萄球菌的⾦黄⾊⾊素。
⽔溶性⾊素：使菌落周围的培养基出现颜⾊变化。
如铜绿假单胞菌的铜绿⾊⾊素。
（⼆）细菌在液体培养基中的⽣长现象 浑浊⽣长：⼤多数细菌。
沉淀⽣长：少数链状排列的细菌如链球菌、炭疽芽胞杆菌。
菌膜⽣长（表⾯⽣长）：专性需氧菌如枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌。
（三）细菌在半固体培养基中的⽣长现象 半固体培养基⽤于观察细菌的动⼒ 有鞭⽑的细菌除了在穿刺接种的穿刺线上⽣长外，在穿刺线的两侧均可见⽻⽑状或云雾状浑浊⽣长，为动⼒阳性。
⽆鞭⽑的细菌只沿穿刺线呈明显的线状⽣长，为动⼒试验阴性。
微生物检验学之细菌的培养与分离技能技术总结
精心整理细菌的培养与分离技术一、基本条件二、细菌的接种与分离技术三、细菌培养的方法四、细菌的生长现象五、细菌L 型的检查一、基本条件（一）细菌实验室1.2.3. 4. 5.菌处理。
6.7. 1. 2. 3.4. 5. pH二、细菌的接种与分离技术（一）平板划线分离法在被检标本中，常混杂有多种细菌，平板划线分离法可使这多种细菌在培养基表面分散生长，各自形成菌落，以便根据菌落的形态及特征，挑选单个菌落进行纯培养。
常用的平板划线分离法有以下两种： 1.连续划线分离法杂菌不多的标本。
2.分区划线分离法杂菌量较多的标本。
（二）斜面接种法该法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。
（三）液体接种法多用于一些液体生化试验管的接种。
（四）穿刺接种法此法主要用于半固体培养基、明胶及双糖管的接种。
（五）倾注平板法测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数时常用此方法。
（六）涂布接种法常用于纸片法药物敏感性测定，也可用于被检标本中的细菌计数。
三、细菌培养的方法根据临床初步诊断及待检细菌的种类，可选用不同环境条件进行培养。
常用的有需氧培养法、二氧化碳培培养瓶置35℃6～18h后，用肉眼观察其生长现象，如：溶血、产生气体或混浊度等。
应每天肉眼检查细菌生长情况，若为生长阳性应做进一步的分离鉴定和药敏；若为生长阴性，应孵至第7天弃去。
有些细菌如奈瑟菌属和嗜血杆菌属的菌株，心杆菌属、放线杆菌属的细菌都需要较长时间培养。
血培养孵育24h后，肉眼观察阴性的血培养瓶，一般不需做常规显微镜检查，因培养物中有105菌落形成单位CFU/ml，才能通过革兰染色检出细菌。
（三）细菌在半固体培养基中的生长现象半固体培养基用于观察细菌的动力，有动力的细菌除了在穿刺接种的穿刺线上生长外，在穿刺线的两侧均可见有混浊或细菌生长的小菌落。
五、细菌L型的检查细菌L型是细胞壁缺陷从而生物学特性发生改变的一种细菌，是细菌在不利环境下种系保存的一种形式。
实验五微生物的分离、培养
学会使用微生物分离、培养的实验技术
选择适当的培养基
根据目标微生物的特性和生长需求，选择适宜的培 养基配方和制备方法。
无菌操作技术
在实验过程中，严格遵守无菌操作原则，防止外来 杂菌污染。
微生物接种与培养
掌握微生物的接种方法，包括划线法、涂布法、倾 注法等，并控制适当的培养温度和湿度。
了解微生物在自然界中的分布和作用
采集方法
根据微生物生长环境的不 同，采用适当的采集方法， 如挖掘、过滤、无菌操作 等。
样品保存
采集后的样品应立即进行 保存，以保持微生物的活 性，常用的保存方法有低 温、干燥、真空等。
微生物的分离
样品处理
将采集的样品进行预处理， 如破碎、研磨、离心等， 使微生物从样品中分离出 来。
培养基选择
根据分离的微生物种类和 实验目的，选择适宜的培 养基，以满足微生物生长 的需求。
实验设计不够严谨
本实验在对照设置方面存在不足，未设置空白对照组以排除非特异性污染的影响。在未来的实验中，应完善实验设计 ，增加对照组以增强实验说服力。
实验结果分析不全面
在实验结果分析中，我只关注了微生物的形态和生长情况，未对微生物的生理生化特性进行深入研究。 建议在后续实验中增加相关分析，以更全面地了解微生物的特性。
培养结果分析
根据观察结果，对微生物的生长情 况进行分析，得出相应的结论。
04
实验结果与分析
微生物的形态观察
总结词
通过显微镜观察，记录微生物的形态特征，如形状、大小、颜色、运动性等。
详细描述
在实验中，我们观察到了多种微生物的形态特征。例如，细菌呈球形、杆形或螺旋形，大小通常在0.5-5微米之 间；霉菌呈丝状或网状结构，有分枝和无分枝，大小因菌种而异；原生动物通常比细菌大，形态多样，如变形虫、 草履虫等。对未来实验的展望Fra bibliotek1 2
微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏实验
实验微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏一、实验目的和要求1.了解微生物的分离纯化方法。
2.学习检测水中大肠菌群的方法。
3.学习微生物的保藏及鉴定方法。
4.熟悉革兰氏染二、实验原理多管发酵法多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。
乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。
1.初发酵试验水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。
48小时后仍不产气的为阴性结果。
2.平板分离初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂，平板上划线分离菌落。
3.复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。
原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
三、实验器材及试剂1.水样污水样本2、培养基及试剂：二甲苯、苯酚、琼脂粉、香柏油、乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、革兰氏一液、革兰氏二液、革兰氏三液、革兰氏四液。
3、器材及耗材:双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、纱布、吸耳球、产气管、培养皿、移液管等四、实验方法及步骤1.第一天实验前的准备1）配制3支乳糖胆盐液体培养基，每支10mL，并加入产气管。
配置营养琼脂培养基，灌装进2支试管中，配置200mL伊红美兰培养基150mL,于121℃高温高压灭菌20分钟，后放进恒温干燥箱。
2）包扎5套培养皿，包扎6根1mL、1根10mL移液管和3支滴管。
于121℃高压灭菌锅中灭菌20分钟。
3）称取一定量的液体石蜡，约为锥形瓶的三分之一。
于121℃高温高压灭菌20分钟。
兽医微生物实验指导剖析
兽医微生物实验教案实验一显微镜油浸系的使用及细菌基本形态构造的观察【目的要求】1.掌握正确使用及护理显微镜的方法，特别是油浸系的使用及护理。
2.正确认识细菌的基本形态和构造。
【油浸系的原理】油浸系是在油浸镜与标本之间加1滴香柏油，调整光源检查细菌标本的方法。
油浸镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95×、100×等。
其镜头标记国产镜多用“油”字表示，国外产品则用“Oil”(Oil Immersion)或HI(homogenmus Immersion)表示。
而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长，镜片最小，这也是识别的另一种标志。
其使用原理是由于香柏油与玻璃的折光率相似(香柏油为1.515，玻璃为1.52)。
镜检时，滴加香柏油的作用是使光源尽可能多的进入物镜中，避免光线通过折光率低的空气(折光率为1.O)而散失，因而能提高物镜的分辨率，使物像明亮清晰。
【器材及试剂】1.菌种：大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、炭疽杆菌、细菌的三型等标本片；2.仪器：普通光学显微镜；3.材料：香柏油，二甲苯，擦镜纸等。
【操作步骤】(一)细菌基本形态构造的观察1.准备安置显微镜→调节光源→调节双筒目镜间距→调节聚光器数值孔径值。
将光圈完全开放，升高聚光镜与载物台同高，置标本片于载物台上，在低倍镜下对光，用于转动反光镜以调节之，至视野最亮时为止。
若用天然光源宜用反光镜平面，较弱光源用凹面。
检查未染色标本，光不宜太强，染色标本需强光。
光线强弱可通过放大或缩小光圈、升降聚光镜、旋转反光镜调节之。
2.观察将香柏油一滴滴于标本片有颜色的观察区，并置于载物台上，用片夹固定好，用推进器将观察区置于物镜正下方，依次用高倍镜→油镜观察。
用油浸镜检查，使油镜头浸入油滴中，几乎与标本面接触为度。
然后由接目镜注视镜内，同时慢慢转动粗调节螺旋提起镜筒(绝对不能下降镜筒)至能模糊看到物像时，再转动细螺旋(细螺旋转动一般不超过1周)，直至物像清晰为止。
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实验四 细菌的分离培养及培养性状的观察在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。
从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。
分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。
细菌分离培养应先从被检材料或病料中分离培养单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。
目的要求1．学习、掌握需氧菌和厌氧菌分离培养的基本要领和技术。
2．了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状。
3．了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。
4．掌握钓菌、纯培养及移植技术。
操作步骤一．需氧性细菌分离培养法1. 平板划线分离法菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用平板划线法进行纯种分离，此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。
但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20 ml 培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。
划线分离主要有连续划线法（图4-1）和分区划线法（图4-2）两种。
划线法示意图见图4-3。
（1）连续划线法以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落。
将菌种点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余菌体。
将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却，然后从接种细菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30～40度角，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠。
划线完毕，关上皿盖。
灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。
培 养皿倒置于适宜的恒温箱内培养。
培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。
(2)分区划线法（四分区划线法）取菌、接种、培养方法与“连续划线法”相似。
分区划线法划线分离时平板分4个区，故又称四分区划线法。
其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最图4-1连续划线法 图4-2分区划线法 图4-3 划线分离示意图大。
为防止第4区内划线与1、2、3区线条相接触，应使4区线条与1区线条相平行，这样区与区间线条夹角最好保持120度左右。
先将接种环蘸取少量菌在平板上1区划3-5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖，将平板转动60～70度。
灼烧接种环，待在平板边缘上冷却后，再按以上方法以1区划线的菌体为菌源，由1区向2区作第2次平行划线。
第2次划线完毕，同时再把平皿转动约60～70度，同样依次在3、4区划线。
划线完毕，灼烧接种环，关上皿盖，倒置于37℃恒温箱中培养24h后，在划线区观察单菌落。
2. 倾注平皿分离法被检材料若含有两种或两种以上细菌时,可借助溶化的琼脂将细菌稀释，待琼脂冷凝后,分散的细菌就被固定在原地形成菌落.这样也能达到分得纯种的目的。
根据材料中存在菌数的多少，倾注平皿前可将被检材料不稀释或用生理盐水作适当稀释。
其具体方法如下：取三支预先准备的普通琼脂培养基试管，水浴加热融化，冷至约50℃，用火焰灭菌接种环钓取待分离物接种至第一管内，充分摇匀后，自第一管取一接种环内容物至第二管，以同样方法自第二管移种至第三管。
然后分别倾注一个已灭菌的平皿，凝固后倒转置于37℃温箱内培养24h。
结果多数细菌在琼脂内生长成菌落，仅少数菌落出现在表面，通常第一个平板内的菌落数较多而密集，第二、三个平板则逐渐减少，可见单个菌落。
3. 芽胞需氧菌分离培养法如果被检材料中可疑有带芽孢的细菌，可先将被检材料加少量生理盐水或肉汤，置于80℃水浴箱中维持15～20分钟，或85℃加热10分钟，再进行培养。
材料中若有带芽孢的细菌仍可存活而生长繁殖，不耐热的细菌繁殖体则被杀灭。
4．利用化学药品的分离培养法（1）抑菌作用有些药品对某些细菌有极强的抑制作用，而对另外一些细菌没有抑制作用，所以可利用这种特性进行细菌的分离，例如通常在培养基中加入结晶紫或青霉素等化学药品来抑制革兰氏阳性菌的生长，以分离得到革兰氏阴性菌。
（2）杀菌作用将病料如结核病料用15％硫酸溶液处理，其他杂菌均被杀死，而结核杆菌因具有抗酸性而存活。
（3）鉴别作用利用细菌对某种糖的分解能力，通过培养基中指示剂的变化来鉴别某种细菌。
例如远藤氏培养基可以用来鉴别大肠杆菌与沙门氏杆菌。
5. 实验动物分离法被检病料中疑有某种病原菌存在，可将病料以无菌操作取出，放入灭菌乳钵或组织匀浆器内，加3～5倍量无菌生理盐水制成混悬液，吸取一定量混悬液注射（肌肉、腹腔、皮下或静脉）入易感实验动物,待实验动物死后，取其脏器，常可分离到纯的病原菌。
例如，疑有猪丹毒杆菌存在的病料，可注射于鸽体，鸽死后，再取其脾脏以分离猪丹毒杆菌，可得到纯培养。
6. 琼脂斜面分离法取琼脂斜面3管，用接种环蘸取欲检病料少许（如为脏器，先将表面烧烙后，用灭菌解剖刀切开，以灭菌接种环由切口插入、转动、钓取组织），混合于第1管的凝集水中，再作斜面划线；然后抽出接种环，不经烧灼，继续在第2管、第3管斜面上作同样划线。
划毕，置37℃温箱中培养。
经此法分离培养后，第2管的菌落较第1管为少，第3管的菌落更少，如此较易得到单个菌落，达到纯培养之目的。
7. 琼脂平板涂布分离法被检病料如血液、腹水等，可用灭菌毛细吸管或吸管吸取1～2滴置于平板中央，用灭菌的L形玻棒作均匀涂布。
如估计细菌数很多，可直接用火焰灭菌的接种环钓菌，并做分区划线。
如为脏器病料，可先作成乳悬液再行涂布；或取其一小块，用镊子夹住，表面烧烙后，用灭菌刀切开，以其切面直接进行涂布，此法适用于含菌量较少的病料的分离。
8. 营养肉汤分离法当组织病料中含病原菌少，或有抗菌药残留时，用上述琼脂斜面或平板分离法可能无菌落长出，这时可以无菌操作剪取一小块病料直接投入肉汤，经37℃培养，在肉汤中长出细菌后，再用琼脂斜面或琼脂平板分离。
二、厌氧性细菌分离培养法细菌接种后，直接放在恒温箱内培养，可以使需氧菌与兼性厌氧菌生长繁殖；但对厌氧菌，则需将培养环境或培养基中的氧气除去，或将氧化型物质还原，降低其氧化还原电势，才能生长繁殖。
在有氧的环境下，培养基的氧化还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。
为使培养基降低电势，降低培养环境的氧分压是十分必要的。
现有的厌氧培养法很多，主要有生物学法、化学法和物理学法，可根据各实验室的具体情况而选用。
（一）生物学方法培养基中含有植物组织（马铃薯、燕麦、发芽谷物等）或动物组织（新鲜动物组织小片，或加热的肌肉、心脑等），因组织的呼吸作用，以及组织中可氧化物质的氧化而消耗氧气（肌肉、脑磷脂中不饱和脂肪酸的氧化，碎肉培养基的应用），造成厌氧环境，以利于厌氧性细菌的生长繁殖。
同时，组织中所含的还原性化合物（谷胱甘肽）也可使氧化-还原电势下降。
此外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在同一环境中，则环境中的氧被需氧菌消耗，造成厌氧环境，也有利于厌氧菌的生长繁殖。
1. 动物组织及其他物质加入法在液体培养基内加入肝脏、肾脏等动物脏器，因其中的半胱氨酸的一SH基极不稳定，为强还原剂，所以可利用此培养基进行厌氧培养，在培养之前将肝片肉汤加热，以驱出空气，冷却，然后接种培养。
2. 共栖培养法将厌氧菌与需氧菌共同培养在同一个平皿内，利用需氧菌的生长繁殖将氧气消耗后，造成厌氧环境利于厌氧菌生长。
其具体方法是将培养皿的一半接种消耗氧气能力极强的需氧菌如灵杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌等。
另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37℃恒温箱中培养2～3d，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。
（二）化学方法利用还原能力强的化学物质，将环境或培养基内的氧气消耗，或还原氧化型物质，降低氧化-还原电势。
1. 焦性没食子酸法焦性没食子酸在碱性溶液内能大量地吸收氧而造成厌氧环境，有利于厌氧菌的生长繁殖。
通常100cm3空间用焦性没食子酸1g及10％氢氧化钠或氢氧化钾10m1。
具体方法有下列几种：（1）平板培养法将厌氧菌划线接种于适宜的琼脂平板，取一小团直径约2cm的脱脂棉，置于平皿盖的内面中央，其上滴加0.5ml 10％氢氧化钠溶液；在靠近脱脂棉的一侧放置0.5g焦性没食子酸，暂勿使两者接触。
立即将已接种的平板覆盖于平皿盖上，迅速用融化的石蜡密封平皿四周。
封毕，轻轻摇动平皿，使被氢氧化钠溶液浸湿的脱脂棉与焦性没食子酸接触，然后置37℃恒温箱中培养24～48h后，取出观察。
（2）Buchner氏试管法（图4-4）取一大试管，在管底放焦性没食子酸0.5g及玻璃珠数个或放一螺旋状铅丝。
将已接图4-4 Buchner氏厌氧培养法图4-5 瑞氏厌氧培养法种的培养管放入大试管中，迅速加入2％NaOH溶液0.5ml，立即将试管口用橡皮塞塞紧，必要时周围用石蜡密封。
37℃培养24～48h后观察。
（3）瑞氏厌氧培养法（图4-5）将已接种细菌的培养管的脱脂棉棉塞在火焰中灼烧灭菌后，塞入管中离培养基1～1.5cm处，置适量焦性没食子酸于其上，加入10%NaOH溶液2ml，迅速用橡皮塞将管口塞紧，以胶泥或石蜡严密封闭置温箱中培养。
（4）史氏厌氧培养法用图4-6所示的厌氧培养皿，在皿底一边置焦性没食子酸，另一边置NaOH溶液，将已接种的平皿翻盖于皿上，并将接合处用胶泥或石蜡密封，然后摇动底部，使氢氧化钠与焦性没食子酸混合，置温箱中培养。
（5）平皿厌氧培养法置一片中有小圆孔的金属板于两平皿之间，上面的平皿接种细菌，下面的平皿盛焦性没食子酸及氢氧化钠溶液，用胶泥封闭后置温箱中培养（图4-7）（6）玻罐或干燥器法置适量焦性没食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面，将培养皿或试管置于隔板上，并在玻罐内置美兰指示剂一管，从罐侧加入氢氧化钠溶液于罐底，将焦性没食子酸用纸或纱布包好，用图4-6 史氏厌氧培养法图4-7 平皿厌氧培养法线系住，暂勿与氢氧化钠接触，等一切准备好后，将线放下，使焦性没食子酸落入氢氧化钠溶液中，立即将盖盖好，密封，置温箱中培养。
2. 李伏夫（）氏法此法是利用连二亚硫酸钠（Sodiumhyerosulphite）和碳酸钠以吸收空气中的氧气,释放二氧化碳造成厌氧环境。
其反应式如下：Na2S2O4+Na2CO3+O2→Na2SO4+Na2SO3+CO2取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内（如是液体培养基，则直立于罐内），最上端保留可容纳1～2个平皿的空间（视玻罐的体积而定），按玻罐的体积每1000cm3空间用连二亚硫酸钠及碳酸钠各30g，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。