酶法拆分
酶法制备D-氨基酸
酶法制备D-氨基酸进展姓名施绘程 学号 3100104825 课程名称生物有机化学 指导老师徐刚 专业生物工程
酶法制备D-氨基酸进展 摘要：酶法制备D-氨基酸具有其他方法所不可比拟的优势。目前应用最广泛的是N-乙酰-氨基酰化酶和D-海因酶手性拆分途径。氨基酰化酶可以用于生产多种不同氨基酸，海因酶途径副产物可以自发消旋化。对于这两种途径，目前的研究主要集中在通过改变反应条件提高酶的活性和选择性，以及通过固定化技术提高酶的生产率。 1.概述 在自然界中已经发现了300种氨基酸中，虽然其中约有90%为L-型氨基酸，只有约10%为D-型氨基酸或其它氨基酸，而且D-型氨基酸不能构成重要的生物分子——蛋白质，但是近年来，随着科学研究的深入，人们发现许多植物、微生物和高等植物中都有D-氨基酸的存在，D-型氨基酸虽然不是构成蛋白质的基本结构单元，但D-氨基酸同样具有非常重要的作用，D-型氨基酸所具有的特殊性质和功效是L-氨基酸不可代替的[1，2]。 D-型氨基酸在食品行业中主要用作甜味剂。D-苯丙氨酸、D-天冬氨酸和D-丙氨酸都是合成甜味剂的重要原料，其中D-丙氨酸本身就是一种强甜味剂。由于D-氨基酸及二肽在人体内几乎不发生代谢作用，而且没有毒性，可以作为非营养性甜味剂，适于肥胖症、高血压以及糖尿病患者食用[3]。 在农业上，D-缬氨酸可用于合成新型高效农药拟除虫菊酯和氯氟戊菊酯，由D-缬氨酸与相应的醇经酯化而制得缬氨酸杀虫菊酯是一类广谱的很有发展前景的杀虫杀螨剂，能有效她防治棉花、果树、蔬菜等作物的包括鳞翅目和双翅目等在内的主要害虫。D-色氨酸可以作为6-苯基腺嘌呤的合成前体，6-苯基腺嘌呤能够很好的刺激植物细胞和组织的生长，促进花芽的分化，提高作物的产量[2]。 多种D-氨基酸是合成成抗生素、抗糖尿病、抗癌、镇定、抗心血管疾病等多种药物的重要中间体。图1列出了目前医药市场上部分含有D-型氨基酸的药物及其临床应用。[1] 另外，D-氨基酸还可以应用于化妆品添加剂、染发剂等日用化学品中。 2.D-氨基酸制备方法 化学法生产D-氨基酸反应条件相对比较剧烈、污染大，产率低并且费用高，因此不适合大规模生产；由于D-型氨基酸属于非天然氨基酸，因此用发酵法制备D-氨基酸比较困难，得到的氨基酸光学纯度和产率都比较低。而于酶法具有拆分效率高、立体选择性高、反应条件温和、专一性强、操作简单和有利于环保等优点，从而使得它在工业生产中具有很好的应用前景。
氨基酰化酶法拆分制备手性氨基酸
浙江大学 硕士学位论文 氨基酰化酶法拆分制备手性氨基酸 姓名：钟琦 申请学位级别：硕士 专业：生物化学工程 指导教师：关怡新 20040201
摘要 氨基酸是构成蛋白质的基础，同时也是一种十分重要的营养物质，它在生命活动中起着举足轻重的作用。 在传统的２０种天然氨基酸中，除没有手性中心的甘氨酸外，其他１９种氨基酸均为Ｌ构型。随着研究的不断深入，越来越多非天然构型一Ｄ型氨基酸的作用被发现，它们的需求也随之产生。对于Ｌ型和Ｄ型都有利用价值的氨基酸，化学合成结合手性拆分的方法，具有低成本、适于大规模生产等优点。而高效、绿色、安全的氨基酰化酶法拆分，是拆分氨基酸的最佳方法之一。 蛋氨酸和苯丙氨酸，都是人体必需的氨基酸。喹｝氨酸是一种重要的饲料添加剂。Ｌ．苯丙氨酸是合成抗病毒和抗癌药物及人工甜昧剂的原料，Ｄ．苯丙氨酸能增强人体的免疫功能，具有出色的镇痛作用。 首先，选取了氨基酰化酶含量较为丰富且方便易得的米曲霉３０４２作为酶源。通过硫酸铵分级沉淀、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０凝胶层析和ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ阴离子交换层析从米曲霉３０４２中提取到了米曲氨基酰化酶，该酶的纯化倍数为５４．２９，比活为６４７．６６Ｕ／ｍｇ，总收率为４９．５３％。以Ｎ．乙酰．ＤＬ－蛋氨酸为底物的酶促反应最适ｐＨ为７．５．８．０，最适反应温度随催化反应时间的延长而降低，缓冲体系中的离子对酶活有抑制作用，而低浓度的ｃ０２＋对酶活有激活作用。 将游离酶用于拆分Ｍｅｔ和Ｐｈｅ。最佳拆分条件和拆分结果分别为： Ｍｅｔ：反应温度为３７℃；ｐＨ７．５；Ｃ０２＋浓度为５×１０４ｍｏｌ／Ｌ；初始底物浓度为０．３ｍｏｌ／Ｌ。产品：Ｌ－Ｍｃｔ，％Ｏ．Ｐ＝９６．２％，收率７０．５％；Ｄ．Ｍｅｔ，％Ｏ．Ｐ＝－９５．３％，收率５０．５％。 Ｐｈｅ：反应温度为３７℃；ｐＨ７．０；ｃ０２＋浓度为５×１０＂４ｍｏｌ／Ｌ；初始底物浓度为０．２ｍｏｌ／Ｌ。产品：Ｌ－Ｐｈｅ，％Ｏ．Ｐ＝９８．６％。收率６８．２％；Ｄ．Ｐｈｅ，％Ｏ．Ｐ－－９７．１％，收率６０．１％。 之后，采用了离子交换凝胶吸附法和海藻酸钙微胶囊包埋法对酶进行固定化。 吸附法所选用的固定化介质是国产ＤＥＡＥ．Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ凝胶。研究表明，固定化ＤＳＡ的热稳定性明显优于游离酶。利用ＤＳＡ柱进行Ｍｅｔ的连续拆分，稳定工作３０天后，酶活仍保留６０％以上。经初步估算，氨基酰化酶固定化后，酶活利用率提高１０倍以上，具有良好的工业应用前景。 包埋有氨基酰化酶的海藻酸钙凝胶珠分别与聚阳离子ＰＭＣＧ和ＰＤＭＤＡＣＣ形成微胶囊。对于本体系，两种聚阳离子具有相似的效果。两种微胶囊酶的固定化率都较高，同时酶的泄漏问题也得到了较好的解决。但是随着反应次数的增加，