宫颈癌细胞FHIT基因启动子CpG岛甲基化状态分析(20210215103916)

文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编借，有帮助欢迎下载支持. 宫颈癌细胞FHIT基因启动子CpG岛甲基化状态分析

【摘要】FHIT基因是一种与凋亡有关的肿瘤抑制基因，广泛存在

于各种细胞凋亡系统中，在多种肿瘤及细胞系中失活，其启动子部位CpG

岛甲基化是FHIT基因失活的主要机制之一。本研究应用甲基化特异性

PCR (Methylation spec辻ic PCR, MSP)对不同宫颈鳞癌细胞系FHIT基

因启动子CpG岛甲基化状态进行检测，在分子水平上了解FHIT 异常甲基

化与宫颈癌的相关性，为宫颈癌去甲基化治疗提供依据。

【关键词】宫颈癌；FHIT基因；甲基化PCR

Detection of Methylation of the FHIT Promoter 5'拟CpG

in Human Cervical Cancer Cell Lines

Abstract：The 5’ CpG island methylation of FHIT gene

has been detected in many carcinomas , and it maybe aroses

inactivation on FHIT gene .Such littie details on methylation

status of 5’ 拟CpG island of FHIT gene in cervical cancer cell

were reported, so this study was designed to explore methylation

status of 5’ 拟CpG island of FHIT gene in 6 cervical cancer

cell lines ・ We want to reveal the relationship bet ween FHIT

gene and tumourigensis and/or development in human cervical

cancer・

Key words: Cervical Cancer； Fragile histidine triad

(FHIT)gene； Methylation拟specific polymerase chain reaction (MSP)

国内外有关宫颈癌与FHIT基因启动子区甲基化的研究报道不多，结论尚不一致。Herman [1]等1996年建立的异常甲基化检测方法(MSP)具有灵敏度高、特异性好、操作简便的特点。本研究拟应用MSP技术分析人宫颈癌细胞株FHIT基因5'端CpG岛甲基化水平，旨在揭示FHIT 基因甲基化对人宫颈癌发生的影响，为寻找宫颈癌诊断和治疗的新方法提供理论和实验依据。

1材料与方法

1・ 1 材料SiHa. C4拟1、Hela> RJC拟1、CS1213 以及C33A 细胞株为西安交通大学第一附属医院临床分子生物学中心保存。

1.2主要试剂RPMI Medium 1640为美国GIBC0公司产品；热

启动Taq 酶、Hae Illdigest DNA Marker 购于Fl 本Takara 公司；

亚硫酸氢钠、氢鲍购于美国Sigma公司。FHIT甲基化扩增引物序列：F5_拟TTGGGGCGCGGGTTTGGGTTTTTACGC拟3 ；R 5_^CGTMACGACGCCGACCCCACTA拟3,扩增产物长度为74 b p ；非甲基化扩增引物序列扩增产物长度为 F 5_^TTGGGGTGTGGGTTTGGGTTTTTATG 拟3

；

5J^CATAAACAACACCAACCCCACTA拟3；两组引物由上海生工生物公司合成。

1.3方法

1.3.1提取样品常规细胞复苏、传代、收集细胞，-70°C保存。Qiagen DNeasy Tissue kit 提取细胞基因组的DNA。取2 H 1 DNA 样品加入98 Hl TE缓冲液稀释，经核酸蛋白分析仪测定260 nm和280 nm处

的吸光度，若比值在1. 8〜2. 0之间，说明样品中的核酸较纯。

1. 3. 2亚硫酸氢盐修饰双蒸水稀释2 ng DXA至10 U1, 加入3 mol/L NaOH 1. 1 U 1 混匀；37 °C水浴170 min〜20 min；加入

10 mmol/L氢鲍6 H 1,轻轻摇匀；加入3. 6 mol/L亚硫酸氢钠（pH

5.0） 104 U1,轻轻混匀；至于PCR仪中，55 °C温浴18 h（过夜）；

置于-20 °C保存。

1. 3. 3PCR 反应及产物检测94°C 3min、94°C 30 s、65°C 30 s、72°C 30 s、40 个循环、72°C延伸7min。取5 u 1 PCR 产物与1 H 1 6 Loading Buffer混合，上2%琼脂糖凝胶（0. 5TBE）, 90 V 电泳20 min,并以作为分子量参照标准进行产物鉴定，凝胶成像分析系

统分析并照相。2结果

6个宫颈癌细胞株中，SiHa> C4拟1、Hela、C33A甲基特异性引物和非甲基特异性引物均扩增扩增出73 bp的目的条带，呈现岀甲基化朵合性状态，而RJC拟1、CS 1213细胞仅甲基化引物扩增出了目的

条带，非甲基化引物未扩增出目的条带，表现为完全甲基化状态。

3讨论

引起基因表达异常主要有遗传学和表遗传学两种机制。后者可以通过基因甲基化而发生，是指D\A的CpG岛中胞喀唳被甲基基团修饰，这是DNA在转录水平上的修饰方式之一。DNA甲基化改变不仅可以直接或间接影响基因转录，也可通过5拟甲基胞咗噪脱氨基诱发胞咗唳转变为胸腺咗噪，引起基因异常表达，还可引起染色体结构改变，导致基因表达不稳定。正常宫颈组织、癌前病变和宫颈癌组织FHIT基因DNA甲基