水产食品过敏原及其抗原表位的研究-刘光明
鲤鱼过敏原_胶原蛋白_的体外模拟消化
第15卷第4期集美大学学报（自然科学版）Journal of Jimei University （Natural Science ）Vol.15No.4［收稿日期］2009－07－10［修回日期］2009－09－22［基金项目］国家自然科学基金资助项目（30871947）；福建省自然科学基金资助项目（2008J0067）［作者简介］刘光明（1972—），男，副教授，博士，从事水产食品安全研究.通讯作者：苏文金（1956—），男，教授，博士，从事海洋药物与食品方向研究.E-mail ：wjsu@.［文章编号］1007－7405（2010）04－0027－05鲤鱼过敏原（胶原蛋白）的体外模拟消化刘光明1，2，钟永嘉1，2，曹敏杰1，2，蔡秋凤1，2，张凌晶1，2，苏文金1，2（1.集美大学生物工程学院，福建厦门361021；2.福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室，福建厦门361021）［摘要］首先采用酸法提取纯化鲤鱼过敏原（胶原蛋白），依据美国药典提供的模拟胃液、肠液配方，分别利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对纯化的胶原蛋白进行酶解消化，以SDS －PAGE 和免疫印迹分析测定纯化的胶原蛋白在体外模拟胃液、肠液中的消化稳定性及免疫原性.结果表明，鲤鱼胶原蛋白经模拟胃液（胃蛋白酶）消化15min 出现较为明显的降解，消化1h 的产物仍具有一定的免疫原性；经模拟肠液（胰蛋白酶）消化30min 出现较为明显的降解，消化3h 的产物仍具有一定的免疫原性；经模拟肠液（胰凝乳蛋白酶）消化1 4h 均未出现明显降解，其消化产物仍具有较强的免疫原性.结果提示，鲤鱼胶原蛋白的耐消化性及免疫原性可能是导致食物性过敏反应的重要原因.［关键词］鲤鱼；过敏原；胶原蛋白；模拟胃肠液消化；SDS －PAGE ；免疫印迹［中图分类号］Q 512+.6［文献标志码］A0引言食物过敏是全世界普遍存在的一个食品安全问题，其症状在临床上表现为荨麻疹、哮喘、腹痛和腹泻等，严重时可导致过敏性休克［1－2］.1995年，联合国粮农组织（FAO ）报告，鱼类属于八大类常见过敏食物之一.在我国尤其是南方对鱼类过敏的发病率较高，如深圳250例过敏患者中对淡水鱼（鲤鱼）过敏的阳性率为28.27%［3］.胶原蛋白在食品、化妆品中均有广泛应用［4－7］，因食用含有胶原蛋白的各类食品而导致过敏的事件也屡见报道［6－7］.2001年，日本学者Hamada 等首次报道胶原蛋白是海水鱼类的过敏原［8］，但有关淡水鱼类胶原蛋白尤其是作为食物过敏原的研究则很少，仅见文献［9］.本文以我国有代表性的淡水鱼———鲤鱼为研究对象，采用酸法提取纯化胶原蛋白，依据美国药典提供的模拟胃液、肠液配方，分别利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶3种消化酶进行体外模拟胃肠液消化，并对消化产物进行SDS －PAGE 电泳和免疫印迹分析，以期获得淡水鱼过敏原（胶原蛋白）的相关基础数据，为降低胶原蛋白过敏性反应的发生、开发低过敏性的水产食品等提供理论基础.1材料与方法1.1材料鲤鱼（Cyprinus carpio ）购于集美农贸市场，现杀，直接用于实验或置于－20ħ保存备用.胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶购自Pierce 公司.兔抗鲨鱼胶原蛋白抗体由本实验室制备.1.2方法1.2.1胶原蛋白的提取纯化鱼皮胶原蛋白的提取［9－10］：鱼皮称重，剪碎，加入20倍体积预冷的0.1mol /L NaOH ，4ħ浸泡4h ；滤去NaOH 溶液，用蒸馏水洗涤8次，沥干；加入等量的质量分数为10%的异丙醇溶液，4ħ集美大学学报（自然科学版）第15卷浸泡1d ；滤去异丙醇溶液，用蒸馏水洗涤8次，沥干；加入等量的0.5mol /L HAc ，4ħ浸泡3d ；4ħ下20000r /min 离心30min ，取上清液；加入4mol /L NaCl 至终浓度为0.9mol /L ，4ħ静置1h ，4ħ下12000r /min 离心20min ，沉淀溶于25mmol /L 磷酸缓冲液中（pH =7.5）.鱼肉胶原蛋白提取［10－11］：鱼肉称重，加入10倍体积的20mmol /L Tris －HCl （pH =8.0），用组织捣碎仪均质；4ħ下12000r /min 离心15min ，取沉淀；加入10倍体积的0.1mol /L NaOH 溶解并均质，4ħ下12000r /min 离心15min ，取沉淀；用蒸馏水洗涤5次，加入3倍体积的0.5mol /L HAc 溶解并均质，4ħ下12000r /min 离心15min ，取上清液；加入4mol /L NaCl 至终浓度为0.6mol /L ，4ħ静置1h ，4ħ下12000r /min 离心20min ，取沉淀；加入0.5mol /L HAc 至沉淀完全溶解.1.2.2体外模拟消化实验模拟胃液（SGF ）和模拟肠液（SIF ）消化实验，依据美国药典配方［12］，参照Fu 等［13］的方法，反应体积为1mL ，反应温度为37ħ，其中胃蛋白酶与胶原蛋白的比例为1ʒ20，胰蛋白酶（或胰凝乳蛋白酶）与胶原蛋白的比例为1ʒ30.1.2.3SIF 消化的终止实验依据美国药典配方，SIF 以胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶为消化酶，在NaOH 溶液（含6.8mg /mL KH 2PO 4，pH 值7.5）中进行，通常采用95ħ下加热5min 使酶失活终止［13］；为确定胶原蛋白是否对热稳定，本文进行了胶原蛋白的SIF 消化的终止实验（即95ħ热稳定性）.1.2.4体外模拟消化产物的免疫印迹分析Dot blot 参照文献［14］的方法进行.滴加2μL 纯化的胶原蛋白于硝酸纤维膜上，干燥后再滴加，共3次；脱脂奶封闭，加入一抗（兔抗鲨鱼胶原蛋白抗体，1ʒ100），加入二抗（山羊抗兔IgG －HRP ，1ʒ2000），DAB 显色，拍照保存.Western blot 参照文献［14］的方法进行，SDS －PAGE 凝胶12M 34ku200.0116.397.466.2茁琢１琢２说明：M 为蛋白质分子量标准；1—2为鱼皮胶原蛋白；3—4为鱼肉胶原蛋白.图1纯化的鱼皮和鱼肉胶原蛋白的SDS-PAGE 电泳图谱Fig.1SDS-PAGE analysis of the purified collagen from the skin and muscle of carp电泳，湿法转膜，后续操作同Dot blot.2结果2.1胶原蛋白的提取纯化对从鲤鱼中提取纯化的胶原蛋白进行SDS －PAGE 电泳分析，结果如图1所示，鱼肉、鱼皮中均可得到纯化的胶原蛋白，二者的亚基构成和分子质量也较为相似，都含有两条α链（α1和α2）和高浓度的β链，α1、α2和β的分子质量依次约为130ku 、110ku 和200ku.对比鱼皮和鱼肉胶原蛋白的提取结果还可以看出，胶原蛋白在鱼皮中的含量明显高于鱼肉，因此后续实验中均采用鱼皮胶原蛋白.2.2SIF 消化胶原蛋白的终止实验胶原蛋白的热稳定性实验结果显示，95ħ高温作用1min 胶原蛋白开始降解，作用5min 后产生明显降解，作用30min 胶原蛋白的3个亚基几乎完全降解，表明胶原蛋白对热不稳定，因此不宜采用文献［9］的95ħ高温终止SIF （胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）消化反应.本文后续SIF 实验采用的终止方法是：SIF 反应后取样，立即加入蛋白质，上样缓冲液，进行样品SDS 化，这样既能防止高温对胶原蛋白的降解作用，.·82·第3期刘光明，等：鲤鱼过敏原（胶原蛋白）的体外模拟消化2.3胶原蛋白的SGF 消化对纯化胶原蛋白的SGF 消化产物进行SDS －PAGE 电泳分析，结果如图2所示，SGF 消化开始后，胶原蛋白的3个亚基都发生了降解，其中β链降解较快，在α2链附近出现蛋白质条带加粗的现象；随着消化时间达到15min 时，α1链、α2链以及β链降解产物也逐渐被分解；当消化时间达到30min 时，胶原蛋白主要在80 100ku 处产生一系列的降解产物；当消化时间达到1h 时，胶原蛋白的3个亚基几乎完全分解，并出现约为30 40ku 的降解产物.2.4胶原蛋白的SIF 消化对纯化胶原蛋白的SIF （胰蛋白酶）消化产物进行SDS －PAGE 电泳分析，结果如图3所示，在胰蛋白酶作用30min 后，胶原蛋白的3个亚基都发生了降解；当消化时间达到1h 时出现明显降解，产生一些较大分子质量的降解产物（约为55ku 和45ku ）；当消化时间达到4h 时，3个亚基几乎完全降解，产生一些小分子质量的降解产物（约为35ku 和40ku ）.对纯化胶原蛋白的SIF （胰凝乳蛋白酶）消化产物进行SDS －PAGE 电泳分析，结果发现，胰凝乳蛋白酶对胶原蛋白的分解作用不明显（消化时间达到4h 仍未出现明显降解），推测可能是由于未经过胃蛋白酶分解，胶原蛋白的胰凝乳蛋白酶作用位点没有完全暴露出来，因此未能发生明显的降解作用.M 12345678200.0116.397.466.245.0ku说明：M —蛋白质分子量标准；1—0min ；2—1min ；3—5min ；4—10min ；5—15min ；6—30min ；7—60min ；8—对照（未加酶）.图2SGF(pepsin)消化胶原蛋白的SDS-PAGE 电泳图谱Fig.2SDS-PAGE analysis of SGF (pepsin)digestion on the collagen fromcarp M 12345678ku 9116.066.245.035.0说明：M —蛋白质分子量标准；1—0min ；2—1min ；3—15min ；4—30min ；5—1h ；6—2h ；7—3h ；8—4h ；9—对照（未加酶）.图3SIF(trypsin)消化胶原蛋白的SDS-PAGE 电泳图谱Fig.3SDS-PAGE analysis of SIF (trypsin)digestion on the collagen from carp2.5体外模拟消化产物的免疫印迹分析12345说明：1—对照（胶原蛋白未经消化处理）；2—胶原蛋白经胃蛋白酶消化1h 产物；3—胶原蛋白经胰蛋白酶消化3h 产物；4—胶原蛋白经胰凝乳蛋白酶消化4h 产物；5—牛血清蛋白经胃蛋白酶消化1h 的对照.图4点杂交分析胶原蛋白的体外模拟消化产物Fig.4Dot blot analysis of the digested products from the purified collagen of carp应用兔抗鲨鱼胶原蛋白抗体的Dot blot 分析鲤鱼胶原蛋白的体外模拟消化产物的结果如图4所示，结果表明，胶原蛋白经SGF （胃蛋白酶）作用1h 的产物仍具有一定的免疫原性，经SIF （胰蛋白酶）作用3h 的产物仍具有一定的免疫原性，经SIF （胰凝乳蛋白酶）作用4h 的产物仍具有较强的免疫原性.应用兔抗鲨鱼胶原蛋白抗体的Western blot 分析胃蛋白酶消化胶原蛋白的结果表明，当消化时间为15min 时，3个亚基的杂交显色条带均有变淡，且在α2的下面出现了其他的杂交显色条带；当消化时间为1h 时仍有模糊的杂交显色条带.胰蛋白酶消化胶原蛋白的Western blot 分析结果表明，当消化时间为15min 时，3个亚基的杂交显色条带没有多·92·集美大学学报（自然科学版）第15卷大的变化；当消化时间为30min 时，3个亚基的杂交显色条带才开始变淡；当消化时间为3h 时仍有较明显的杂交显色条带.胰凝乳蛋白酶消化胶原蛋白的Western blot 分析结果表明，随着消化反应的进行，直到消化时间为4h 时，3个亚基的杂交显色条带仍未发生明显变化.3讨论胶原蛋白是一种纤维状蛋白质，对称性差，分子结构类似于纤维，所以其溶解性较差［4，6］.酸法提取，即在一定的酸性条件下提取胶原蛋白，使用的酸有盐酸、乙酸等.Kimura 等［4］采用盐酸和蛋白酶结合的方法从海蛰中提取了胶原蛋白.Muyonga 等［6］用乙酸从Nileperch 幼鱼和成鱼鱼皮中提取酸溶性胶原蛋白，得率分别为63.1%、58.7%.本文采用酸法提取鲤鱼胶原蛋白，并作了一些改进：1）提取过程中加入20倍体积预冷的0.1mol /L NaOH ，于4ħ浸泡4h ，用于去除非胶原蛋白成分并防止内源性蛋白酶的作用；2）加入等量的质量分数为10%的异丙醇溶液于4ħ浸泡1d ，用于去除鱼皮中脂肪.对比鲤鱼鱼肉与鱼皮的胶原蛋白提取结果，可以看出，鱼皮的胶原蛋白含量明显高于鱼肉，因此在实验中均以鱼皮胶原蛋白为消化对象.加热和酶解能否破坏食物过敏原，影响因素主要有加热的温度与时间、酶解的时间、蛋白质和酶的比例以及过敏原内部特性、二硫键的断裂及重新形成新的分子作用力等［15］.本文实验结果表明，高温（95ħ）处理对胶原蛋白具有明显的降解作用，处理30min 时3个亚基几乎完全降解，说明胶原蛋白对热不稳定，因此不宜采用95ħ高温终止SIF （胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）消化反应.体外模拟消化实验结果表明，胃蛋白酶和胰蛋白酶可以在一定程度上消化胶原蛋白，其中胃蛋白酶作用15min 时有明显降解；胰蛋白酶作用30min 时有明显降解；胰凝乳蛋白酶对胶原蛋白消化1 4h 时均未见明显降解，原因可能是由于胶原蛋白未经胃蛋白酶消化，其胰凝乳蛋白酶的作用位点没有暴露出来.免疫印迹分析结果表明，胶原蛋白经胃蛋白酶消化1h 、胰蛋白酶消化3h 仍有一定的免疫原性，胶原蛋白经胰凝乳蛋白酶消化4h 仍有较强的免疫原性.［参考文献］［1］JONATHAN B ，STEPHEN C ，SAID E ，et al.Food allergy and intolerance ［M ］.2nd ed.London ：High HolbornHouse ，2002：425-434.［2］聂凌鸿，周如金，宁正祥.食物过敏原研究进展［J ］.生命的化学，2002，22（5）：474-477.［3］李燕春，吴彩霞，张豁达.深圳地区荨麻疹、湿疹变应原检测及脱敏治疗［J ］.中国麻风皮肤病杂志，2005，9（21）：751-752.［4］KIMURA S.Partial characterization of muscle collagen from prawns and lobster ［J ］.Journal of Food Science ，1986，51（2）：330-332.［5］吴耀松，廖艳阳，印大中.胶原蛋白在美容中的应用及皮肤衰老机制研究进展［J ］.中华现代皮肤科学杂志，2004，1（3）：219-223.［6］MUYONGA J ，COLE C ，DUODU K.Characterization of acid soluble collagen from skins of young and adult Nileperch （Lates niloticus ）［J ］.Food Chemistry ，2004，85（1）：81-89.［7］顾其胜，蒋丽霞.胶原蛋白与临床医学［M ］.广州：第二军医大学出版社，2003.［8］HAMADA Y ，NAGASHIMA Y ，SHIOMI K.Identification of collagen as a new fish allergen ［J ］.Bioscience Biotechnol-ogy Biochemistry ，2001，65（2）：285-291.［9］张联英.几种主要淡水鱼胶原蛋白的制备及其特性研究［D ］.青岛：中国海洋大学水产学院，2004.［10］陈申如，蔡扬鹏，曹敏杰，等.鲨鱼鱼皮、鱼骨胶原蛋白的纯化及其特性的初步研究［J ］.中国食品学报，2006，6（1）：173-178.［11］蔡秋凤，杜雪莉，张凌晶，等.星虫胶原蛋白的纯化及其性质的初步分析［J ］.台湾海峡，2007，26（4）：522-527.［12］US Food and Drug Administration.The national formulary ：Simulated gastric fluid and simulated intestinal fluid ，TS ·03·第3期刘光明，等：鲤鱼过敏原（胶原蛋白）的体外模拟消化［M ］.Washington ：Rockville ，1995：2053.［13］FU T J ，ABBOTT U R ，HATZOS C.Digestibility of food allergens and nonallergenic proteins in simulated gastric fluidand simulated intestinal fluid —A comparative study ［J ］.Journal of Agricultural and Food Chemistry ，2002，50（24）：7154-7160.［14］本奥斯伯，金斯顿，塞德曼，等.精编分子生物学实验指南［M ］.4版.马学军，舒悦龙，译.北京：科学出版社，2005：350-525.［15］HEFLE S L.Impact of processing on food allergens ［J ］.Advance Experimental Medical Biology ，1999，459：107-119.The Vitro Simulated Digestion of Carp Allergens CollagenLIU Guang-ming 1，2，ZHONG Yong-jia 1，2，CAO Min-jie 1，2，CAI Qiu-feng 1，2，ZHANG Ling-jing 1，2，SU Wen-jin 1，2（1.School of Biotechnology Engineering ，Jimei University ，Xiamen 361021，China ；2.Key Laboratory of Science andTechnology for Aquaculture and Food Safety （Jimei University ），Fujian Province ，Xiamen 361021，China ）Abstract ：Firstly ，acid method was used to extract the collagen from the skin and muscle of carp.Then pepsin ，trypsin and chymotrypsin were used to digest the extracted collagen at different conditions based on the simulated gastric fluid's and intestinal fluid's formula provided by US pharmacopoeia.And the digested products were detected the digestion stability and immunogenicity in the simulated gastric fluid and intestinal fluid by SDS －PAGE and Western blot.It was found that the collagen could be digested by pepsin at 15min ，and it still had a certain degree of immunogenicity after 1h.The collagen could be digested by trypsin at 30min ，and it still had a certain degree of immunogenicity after 3h.The collagen wasn't almost digested by chymotrypsin at 1 4h ，and it still had the immunogenicity after 4h.These results suggested that the diges-tion stability and immunogenicity of carp collagen were the major cause to induce the food allergy.Key words ：carp ；allergen ；collagen ；simulated gastric fluid and intestinal fluid ；SDS －PAGE ；Western blot（责任编辑马建华）·13·。
中国人的虾、蟹致敏过敏原组分分析
中国人的虾、蟹致敏过敏原组分分析孙一帆;黄建芳;王彩霞;向军俭【期刊名称】《中国免疫学杂志》【年(卷),期】2014(000)010【摘要】目的：分析鉴定中国人群的虾、蟹致敏组分，确定主要过敏原及其致敏率，为深入研究食物过敏原检测及脱敏治疗提供依据。
方法：通过46份虾蟹过敏症患者血清，对刀额新对虾、罗氏沼虾和锈斑鲟的蛋白粗提液进行Western blot 分析，统计数据得出其全部过敏原组分及其致敏率，并确定主要过敏原。
结果：Western blot 结果显示，虾与过敏患者血清IgE的反应强于蟹，且虾、蟹间存在很多Mr相同的过敏原；32～38 kD原肌球蛋白（ TM）、40 kD精氨酸激酶（ AK）、60～80 kD血蓝蛋白（ Hc）和21 kD肌质钙结合蛋白（ SCP）是虾的主要致敏组分，TM、AK和Hc是虾、蟹共同的主要过敏原，其中TM的致敏率最高；与国外研究结果相比，AK、Hc和SCP的致敏率相对较高，且发现虾中48 kD蛋白组分（未知过敏原）也具有较高致敏率。
结论：对中国人群而言，虾的致敏性强于蟹，且虾、蟹的主要致敏组分基本相同；中国人的虾蟹主要致敏组分及其致敏率与国外研究大致相同但略有差异；发现一种潜在的新型过敏原。
【总页数】5页(P1325-1329)【作者】孙一帆;黄建芳;王彩霞;向军俭【作者单位】暨南大学广东省分子免疫与抗体工程重点实验室，广州 510632;暨南大学广东省分子免疫与抗体工程重点实验室，广州 510632;暨南大学广东省分子免疫与抗体工程重点实验室，广州 510632;暨南大学广东省分子免疫与抗体工程重点实验室，广州 510632【正文语种】中文【中图分类】R392.8【相关文献】1.不同方法提取和处理中华绒螯蟹组织蛋白的过敏原组分分析 [J], 朱黎娜;侯丽英;张盈莹;周宇捷;李韶深;李会强2.梭子蟹过敏原致敏组分的分析研究 [J], 赵绮华;赖荷;陈丽金;王锡忠;邹泽红3.不同虾类的过敏原及其过敏原性 [J], 李振兴;林洪;李明华;曹立民4.中国人民银行上海市分行行长毛应樑在中盚耸俦O沼邢薰旧虾J蟹止境闪⑶斓渖系慕不? [J],5.酶解处理对小鼠模型中虾主要致敏蛋白的致敏性影响分析 [J], 张弛;潘家荣;梁世正;冯涛;傅丽丽;张永勇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
水产食物过敏原及其抗原表位的研究进展
（ 集 美 大学 食 品 与 生 物 工 程 学 院 ， 福 建 省 水 产 品 深 加 工 工 程 研 究 中心 ， 福建 厦门３ ６ １ ０ ２ １ ）
摘要 ： 近年来食物引起的过敏性疾病发病率 持续增 高 ， 严 重影 响 了人们 的生 活质量 。水 产 品是 中 国主要 的致敏 性食
敏性 休 克 ， 甚 至 是 危 及 生 命 Ｊ 。流 行 病 学 调 查 显 示， 美 国食 物 过 敏发 病 率 约 为 １ ％ 一１ ０ ％Ｅ ４ ］ ， 儿 童食
物过 敏 的发病 率 明显 高 于 成 人 食 物 过 敏 的 发 病 率 ，
在 欧洲 ， 成 人 食 物 过 敏 的发 病 率 为 ３ ％ ～６ ． １ ％， 儿
中图 分 类 号 ： ￥ ９ ８ ； Ｔ Ｓ ２ ５ ４ 文献标志码 ： Ａ 文章编号 ： ２ ０ ９ ５—１ ８ ３ ３ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ５— ０ ０ ０ １ — ８
要 由免 疫 系 统 Ｉ ｇ Ｅ介 导 的 速 发 型 不 良反 应 ， 根 据 美
１ 过 敏 性 疾 病概 述
童为 ０ ． ９ ％ ～１ ８ ． ３ ％， 其中２ ５ ％ 的学 龄 儿 童 有 过 敏 史， 小 学儿 童 的 发 病 率 为 ４ ％ ～７ ％＿ ５ Ｊ 。据 统 计 ， 在 西方 发 达 国家 ， ３ ％ ～ ８ ％ 的儿 童 和 １ ％ ～３ ％ 的成 人 受 到 食 物过 敏 的 困扰 Ｊ 。在 中 国 ， 一项 以 ２ ０ ０ ２年 中 国居 民 营 养 与 健 康 状 况 调 查 建 立 的 血 清 库 为 基 础 的研 究 显 示 ， 中 国 城 市 儿 童 的食 物 过 敏 率 约 为 ３ ． ２ ０ ％， 且 中 小 城 市 中 食 物 过 敏 率 略 高 于 大 城
甲壳类水产食物致敏原及其分子结构的研究进展
甲壳类水产食物致敏原及其分子结构的研究进展陈锦莉;何欣蓉;李发杰;林慧霞;黄彦鑫;赵晏;张叶豪;刘光明;杨阳【期刊名称】《食品安全质量检测学报》【年(卷),期】2024(15)7【摘要】甲壳类水产品是亚洲地区最主要的致敏食物。
食物过敏主要由摄入的食品致敏原引起,而食物致敏原的结构不仅与抗原表位的形成有关,也决定了其在食品加工和体内消化过程的稳定性。
本文针对甲壳类水产品,首先阐述了甲壳类水产食物过敏及致敏原的研究进展;进一步对甲壳类水产食物致敏原的分子结构及其与致敏性的构效关系展开论述,并基于此提出了致敏原脱敏策略。
目前已鉴定的甲壳类水产食物致敏原大部分属于肌动蛋白结合蛋白、磷酸原激酶和EF手型钙离子结合蛋白3个家族。
针对不同蛋白质家族致敏原的结构特点,通过食品加工技术消减致敏性或利用分子生物学手段获得低致敏性衍生物都是防控食物过敏的重要途径。
但甲壳类水产食物致敏原的结构信息有待完善,其与致敏性的构效关系也仍是未来致敏原研究的重要方向。
本文综合阐述了甲壳类水产食物致敏原结构特性及其与致敏性的构效关系,以期为甲壳类水产食物致敏原的系统研究和食品脱敏方法的建立提供思路。
【总页数】11页(P82-92)【作者】陈锦莉;何欣蓉;李发杰;林慧霞;黄彦鑫;赵晏;张叶豪;刘光明;杨阳【作者单位】厦门华厦学院环境与公共健康学院;集美大学海洋食品与生物工程学院【正文语种】中文【中图分类】F32【相关文献】1.食物致敏原表位定位技术的研究进展2.辐照技术消减食物过敏原致敏性研究进展3.甲壳类水产品过敏原及其致敏性消减技术研究进展4.体外消化模型评估食物过敏原致敏性研究进展5.美拉德反应影响甲壳类水产品致敏原致敏性的研究进展因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
水产品过敏原的研究现状和展望1
收稿日期： 2012-05-07 基金项目： 国家自然科学基金项目（31171660）；福建省自然
摘要 水产品作为人类食物的重要来源之一，其市场和消费群体不断扩大。 与此同时，由水产品引发的食物过 敏也日益增多，在联合国粮农组织公布的八大类过敏食物中，水产品就占了两大类。 水产品过敏原有小清蛋白 （Parvalbumin）、鱼卵蛋白（如鲑鱼的硫酸鱼 精 蛋 白 ）和 胶 原 蛋 白 （Collagen）、原 肌 球 蛋 白 （Tropomyosin，TM）、精 氨 酸激酶（Arginine kinase）、肌球蛋白轻链（Myosin light chain）、肌钙结合蛋白（Sarcoplasmic calcium binding protein）、血蓝蛋白亚基（Hemocyanin subunits）等。基于此，本文重点概述了国内外水产品过敏原及其加工脱敏技术 的研究现状，以及今后水产品过敏原研究的发展趋势。
发现 PV 是鱼类主要过敏原， 并命名为 Gad c 1。 PV 一般分为 α 和 β 两个类型，其中 α-PV 中含有 赖氨酸-丙氨酸的特征序列，而 β-PV 的特征序列 为丙氨酸-丙氨酸。 从序列上分析，大部分 PV 属 于 β 型。 现已证明，PV 作为鱼类的主要过敏原， 95 %以上的鱼类过敏患者的过敏症状是由其引 起 的[14]。 国 内 学 者 分 别 从 赤 魟[15]、鲢 鱼[16]、鲤 鱼[17]、日 本鳗鲡[18]中分离纯化出 PV，并对其进行性质分析 和过敏原性鉴定。 王海燕[19]完成了鳙鱼过敏原 PV 的克隆表达及纯化，并进行了免疫学验证。 李荔[20] 克隆到紫红笛鲷 PV 的基因序列， 分析发现该序 列与其它 PV 基因序列具有很高序列相似性。 国 外 学 者 对 鲤 鱼[21]、鲭 鱼[22]、狭 鳕[23]、真 鲷[24]等 的 小 清 蛋 白 也 进 行 了 研 究 。 Bugajska-Schretter[25]发 现 鳕 鱼、金枪鱼、鲑鱼、鲈鱼、鲤鱼和鳗鱼的 PV 之间能 发生广泛的交叉致敏反应。
水产品中生物胺的检测与控制技术研究进展
芳香族胺 单胺
非挥发性胺 (175~181)
酪氨酸
LD50: 229 mg/kg(小鼠静脉); 口服 6 mg: 4 h 内严重中毒
脂肪族胺 二胺
非挥发性胺 (158~160)
鸟氨酸
LD50: 1750 mg/kg(小鼠腹腔); 460 mg/kg(大鼠经口)
脂肪族胺 二胺
3.1 色谱法
色谱法是利用不同生物胺与固定相和流动相之间的 作用力(分配、吸附、离子交换等)的差别进行多次平衡, 使 各物质达到相互分离后, 结合各类检测器进行的分析, 为 生物胺的常用检测方法。 3.1.1 反相高效液相色谱法
反 相 高效 液相色 谱 (reversed-phase high-performance liquid chromatography, RP-HPLC)广泛应用于水产品中非 挥发性生物胺的定量分析, 灵敏度较高, 能够实现大批量 样品的检测。由于生物胺无紫外吸收, 也无荧光效应, 一般 需对其进行衍生化处理。紫外检测器(UV)为常用的检测器, 灵敏度较高, Mazzucco 等[7]对蛤蚌等食品中组胺及总生物 胺量经丹磺酰氯柱前衍生后进行 RP-HPLC-UV 分析, 检测 限(LOD)为 1.50 mg/kg。荧光检测器(FLD)具有更高的灵敏 度和选择性, Donthuan 等[8]对于发酵鱼制品中组胺、色胺、 尸 胺 、 酪 胺 、 亚 精 胺 经 氯 甲 酸 9- 芴 甲 酯 衍 生 后 进 行 RP-HPLC-FLD 分析, LOD 为 0.02~0.5 µg/kg。Li 等[9]对鱼、 虾等中的生物胺采用改进的 RP-HPLC-FLD 方法, 经乙基 吖啶酮磺酰氯荧光标记后无需衍生处理直接进行分析, LOD 为 0.27~0.69 µg/L。二极管阵列检测器(DAD)作为新 型生物胺衍生物检测器逐渐被广泛运用, Gong 等[10]将鱼 露、虾酱等产品经丹磺酰氯柱前衍生后, 进行 RP-HPLC 分 离, 利用 DAD 分析了腐胺、尸胺、组胺、苯乙胺、酪胺、 精胺、亚精胺、色胺 8 种生物胺，结果显示， 鱼露中均检 测到 8 种生物胺，虾酱中生物胺的含量较低。但 HPLC 存 在衍生操作繁琐、耗时较长等不足, 并且衍生产物不稳定 会影响其重现性。 3.1.2 气相色谱法
虾类过敏原的识别_纯化和检测技术研究_刘光明
记的羊抗人 IgE 抗体）反应，TBST 洗涤，加入 DAB 显色，观察并拍照。 1.2.7 酶联免疫吸附测定（ELISA）[9] 1.2.7.1 双抗夹心 ELISA 将 100 μL 抗体 （过敏 患者血清或兔抗锯缘青蟹原肌球蛋白抗体） 加入 板孔，4 ℃过夜；TBST 洗涤 3 次，5%脱脂奶封闭 30 min；TBST 洗涤 3 次，加 入 抗 原 （原 肌 球 蛋 白 稀 释 液）100 μL，37 ℃孵育 2 h；TBST 洗涤 3 次，加入相 应一抗 （兔抗锯缘青蟹原肌球蛋白抗体或过敏者 血 清 ）100 μL，37 ℃孵 育 30 min；TBST 洗 涤 5 次 ， 加入二抗 （辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG 抗 体或过氧化物酶标记的羊抗人 IgE 抗体）100 μL， 37 ℃ 孵 育 30 min；TBST 洗 涤 5 次 ，OPD 显 色 ， H2SO4 终止，测 OD490 值。 1.2.7.2 间接 ELISA 将 100 μL 抗原 （原肌球蛋 白稀释液） 加入孔板，37 ℃孵育 2 h；TBST 洗涤 3 次， 加入一抗 （兔抗锯缘青蟹原肌球蛋白抗体）， 37℃孵育 30 min；TBST 洗涤 5 次，加入二抗（辣根 过 氧 化 物 酶 标 记 羊 抗 兔 IgG 抗 体 ），37 ℃孵 育 30 min；TBST 洗涤 5 次，OPD 显色，H2SO4 终止反应， 测 OD490 值。
锯缘青蟹原肌球蛋白过敏者血清的筛选
［ 关键词 】食 物过 敏；水产品 ；问卷调查 ；Ｅ ＩＡ ＬＳ ［ 中图分类号 ］Ｔ ０ Ｓ２ ７ ［ 献标志码 ］Ａ 文
Ｏ 引言
近 年来 ，食 物 过敏 患者 日益 增 加 ，食 物 过 敏 已经 成 为 重 要 的 食 品安 全 问题 之 一． 食 物 过 敏 主 要 由超 敏反 应 引起 ，超 敏 反应 有 Ｉ、 Ⅱ、 Ⅲ 、Ⅳ ４种 类 型 ，而食 物 过 敏 主要 由 Ｉ型超 敏 反应 引起 ， 可 分为 ＩＥ介 导 和非 Ｉ ｇ ｇ Ｅ介导 ． 过敏 原 被摄 入 机体后 ，刺 激淋 巴细胞 产生 特 异 性 ＩＥ抗 体 ，该抗 体 ｇ
１３ 过敏原 （ 。 原肌球蛋白）的制备 锯缘青蟹 （ｃｌ Ｆ ｔ） Ｓｙ ａｓ Ｆ ｏ 属于十足 目短尾次 目梭子蟹科青蟹属，购 自集美菜市场．取新鲜蟹肉， ｌ ｅａ 加入 １ 体积 （ ）冰冷 的 ２ ｍ ｌＬｐ Ｏ倍 ｍ： ０ｍ ｏ Ｈ值 为 ７５的磷 酸缓 冲液 （ ５ ｍｏ ＬＫ １，经组织 捣 ／ ． 含 ０ｍ ｌ Ｃ） ／
锯缘 青蟹原 肌 球 蛋 白过敏 者血 清 的筛 选
李 兵 ，刘光 明 ，蔡秋凤 ，黄 园园 ，苏文金 ，曹敏杰 ，
（． １ 集美大学生物工程学院，福建 厦 门３ １２ ；２ 福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室，福建 厦门 ３１ １ ６０１ ６０ ） ２
［ 要］为了解集 美大 学学生 的饮食 及食 物过 敏情况 ，对 在校学 生进行 了问卷 调查．调 查共 分发 了 摘
・
１ ６・ ８
集美大学学报 （ 自然科学版 ）
第ｌ ５卷
ｌ 实验 方 法
１ １ 调查对 象 ．
集 美大学在 校学生 ，年龄在 １ ２ ． ７～ ２岁
克氏原螯虾过敏原的研究进展
克氏原螯虾过敏原的研究进展作者：许宁宁赵祥杰杨荣玲来源：《农业与技术》2019年第08期摘要：克氏原螯虾（淡水小龙虾）肉味鲜美，营养丰富，却具有高致敏性。
本文综述国内外有关小龙虾的养殖和食物过敏情况、小龙虾的过敏原物质以及变应原抗原表位等研究进展，为进一步研究小龙虾的过敏原提供一定的参考。
关键词：克氏原螯虾；过敏原；表位；进展中图分类号：S-3 文献标识码：ADOI：10.19754/j.nyyjs.20190430003基金项目：淮安市重点研发计划项目“盱眙龙虾变应原鉴定及加工脱敏关键技术与应用”（项目编号：HAS201603）；江苏省大学生创新训练省级指导项目“食品热加工方法对盱眙龙虾过敏原性的影响研究与应用”（项目编号：Z205C18281）；淮阴工学院大学生创新训练项目“龙虾各部位嘌呤含量分布及其加工应用”（项目编号：Z205C17535）*为本文通讯作者克氏原螯虾（Procambarus clarkii）俗称淡水小龙虾，原产美国南部路易斯安那州和墨西哥北部，后由日本引种到我国[1]，由于克氏原螯虾具有较强的适应性，繁殖能力较强，在我国较大范围内均有养殖，今年来在长江流域养殖规模得到迅速增加，克氏原鳌虾产量也显著提高，江苏省的盱眙被命名为“中国小龙虾之乡”。
克氏原鳌虾肉质细腻、味道鲜美、营养丰富，虾黄中含有蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、微量元素等，具有较高的营养价值[1]，是深受广大消费者喜爱的食品。
近年来，随着克氏原螯虾等水产品的消费量日益增多，由食用克氏原鳌虾发生食物过敏和横纹肌溶解的病例时有发生[2]，引发消费者的关注，需要对引起过敏的变应原物质进一步研究，以便更安全食用。
1 克氏原螯虾养殖、消费与食物过敏情况近年来在长三角乃至在全国克氏原螯虾的消费量骤增，以致出现各种各样的“龙虾节”，而市场上天然克氏原螯虾供不应求，导致价格上涨，为了满足市场需求，人工无公害化养殖克氏原螯虾已成为农民脱贫致富的新途径[3]。
蟹类水产品过敏原及其致敏性消减技术研究进展
蟹类水产品过敏原及其致敏性消减技术研究进展刘光明;刘庆梅;杨阳;刘萌;李梦思;桓霏;郜帅;曹敏杰【期刊名称】《食品科学技术学报》【年(卷),期】2022(40)4【摘要】蟹类是我国重要的经济水产品,也是诱发过敏反应的主要食物之一。
因此,了解蟹类水产品过敏原种类及抗原表位,探究有效的蟹类致敏性消减技术等极为迫切。
阐明蟹类水产品过敏原及其抗原表位是消减其致敏性的重要前提,概述了国内外分离鉴定的蟹类水产品过敏原,包括原肌球蛋白、精氨酸激酶、肌质钙结合蛋白、磷酸丙糖异构酶、细丝蛋白c等;总结了利用生物信息学技术、噬菌体展示技术、一珠一化合物技术等定位分析蟹类水产品过敏原的线性表位和构象表位概况。
比较了辐照技术、超声技术、美拉德反应技术、酶法交联技术、微生物发酵技术等现代加工处理方法,或修饰过敏原抗原表位或破坏过敏原蛋白质结构,从而消减蟹类水产品过敏原致敏性。
着重分析了蟹类水产品过敏原的未来研究趋势,提出蟹类水产品过敏原结构与致敏性的构效关系解析是该领域的研究难点;对比了物理法、化学法、生物法在蟹类水产品致敏性消减方面的优缺点,提出未来重点发展复合加工处理方式,以便更大程度地降低过敏原致敏性,从而为低致敏性的蟹类食品或生物制品的开发提供技术依据。
【总页数】10页(P25-34)【作者】刘光明;刘庆梅;杨阳;刘萌;李梦思;桓霏;郜帅;曹敏杰【作者单位】集美大学海洋食品与生物工程学院/水产品深加工技术国家地方联合工程研究中心/厦门市海洋功能食品重点实验室【正文语种】中文【中图分类】TS254.1;TS202.1【相关文献】1.生物加工技术对水产品主要过敏原的致敏性消减作用研究进展2.辐照技术消减食物过敏原致敏性研究进展3.甲壳类水产品过敏原及其致敏性消减技术研究进展4.芝麻过敏原及其致敏性消减技术研究进展5.水果过敏原及其致敏性消减技术研究进展因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
鲤鱼过敏原(胶原蛋白)的体外模拟消化
拟肠液 （ 胰蛋 白酶 ）消化 ３ ｉ ０ｍ ｎ出现较为 明显 的降解 ，消化 ３ｈ的产物仍具有一定 的免 疫原性 ；经模 拟肠
液 （ 胰凝乳蛋 白酶 ）消化 １ ４ｈ均未出现明显降解 ，其消化产物仍具有较强 的免疫原性．结果提示 ，鲤鱼 —
胶 原 蛋 白 的耐 消 化 性 及 免 疫 原性 可能 是 导 致 食 物 性 过 敏 反 应 的 重 要 原 因 ． ［ 键 词 ］ 鲤 鱼 ；过 敏 原 ；胶 原 蛋 白 ；模 拟 胃肠 液 消 化 ；Ｓ Ｓ—Ｐ Ｇ ；免 疫 印 迹 关 Ｄ Ａ Ｅ
１ 材 料 与方 法
１１ 材料 ．
鲤鱼 （ ｙｒ ｕ ａｐｏ Ｃｐｉ ｓｃｒｉ）购 于集美 农 贸市 场 ，现 杀 ，直 接 用 于实验 或置 于 一２ ｎ ０℃ 保存 备用 ． 胃蛋
白酶 、胰蛋 白酶 、胰凝 乳蛋 白酶购 自 Ｐｅｃ 司．兔抗 鲨鱼胶 原蛋 白抗体 由本实 验室制 备． ｉ ｅ公 ｒ
鱼 ）过敏的 阳性率为 ２ ．７％ ．胶原蛋 白在食 品 、化妆 品中均有广泛应用 ８２ ，因食 用含有胶原 蛋 白 的各类食品而导致过敏 的事件也屡见报 道 。 ．２０ 年 ， 日本学 者 Ｈ ｍ ｄ ０１ ａ ａａ等首次 报道胶 原蛋 白是海 水
鱼类的过敏原 Ｊ ，但有关 淡水鱼类胶原蛋 白尤 其是作 为食物过敏原 的研究则很 少 ，仅见文献 ［］ ９ ．本 文 以我国有代表性 的淡水鱼—— 鲤鱼为研究对象 ，采用 酸法提取纯化胶原蛋 白 ，依 据美 国药典提供 的模 拟
鱼 肉胶 原蛋 白提取 ¨ 。］ 。“ ：鱼 肉称 重 ，加入 １ 体 积 的 ２ ｍ ｌＬ ｓ Ｃ ｐ ０倍 ０ｍ ｏ —Ｈ Ｉ（ Ｈ＝８０ ，用 组 ／ ．） 织捣碎 仪均质 ；４℃下 １ ０ ｒｎ离心 １ ｉ，取 沉淀 ；加入 １ ２００ｒａ ／ｉ ５ｒｎ ａ ０倍体积 的 ０１ｍ ｌＬＮ Ｏ ． ｏ ａ Ｈ溶解 并 ／ 均质 ，４ｃ下 １ ０ ｍｎ离心 １ ｎ ＝ ２ ０ｒ ｉ 【 ０ ／ ５ｍｉ，取沉淀 ；用蒸馏水 洗涤 ５次 ，加人 ３倍体积 的 ０５ｍｏ ＬＨ ｃ ． ｌ Ａ ／ 溶解并均质 ，４℃下 １ ０ ／ ｉ ２００ｒｍｎ离心 １ ｉ，取上清 液 ；加入 ４ｍ ｌＬＮ Ｃ 至终浓度为 ０６ｍ ｌＬ ５ｍｎ ｏ ａＩ ／ ． ｏ／ ，
三文鱼过敏原小清蛋白分离纯化及免疫结构鉴定
三文鱼过敏原小清蛋白分离纯化及免疫结构鉴定马涛;王一侠;金振涛;谷瑞增;鲁军【摘要】小清蛋白是鱼类的主要过敏原,三文鱼小清蛋白具有不同的亚型,分子量相近,序列基本相同,给分离纯化带来了不小的挑战.本试验采用硫酸铵盐析、Qxl-Sepharose离子交换结合凝胶过滤等方法定向纯化小清蛋白β1型,并应用免疫印迹法对纯化的小清蛋白进行过敏原性鉴定,结合激光辅助解析/飞行时间质谱进行结构鉴定.结果显示,硫酸铵盐析、离子交换层析结合凝胶过滤纯化方法可以得到纯度达90%以上的小清蛋白β1型,且蛋白具有很强的免疫反应活性.针对该蛋白的研究不仅有利于过敏原检测方法的建立,也可为低致敏性水产品的开发提供理论依据.%Parvalbumin is the major allergen of fish species. The different subtypes of salmon parvalbumin with close molecular weight and sequence bring great challenges to protein separation and purification. Parvalbu-minβ1 was purified by heat treatment,(NH4)2SO4 salting out method and Qxl-Sepharose chromatography com-bined by gel filtration. Western blotting was used to identify the allergenicity of purified Parvalbumin. MALDI-TOF/MS was used to further identify the characteristic of parvalbumin structure. The results revealed that the purity of the parvalbuminβ1 was more than 90 percent and it had immunological reactive activity. Investigation into this protein is beneficial not only to detecting allergen, but also to producing aquatic products with low aller-genicity.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2017(038)004【总页数】5页(P1-5)【关键词】三文鱼;原肌球蛋白;分离纯化;免疫印迹【作者】马涛;王一侠;金振涛;谷瑞增;鲁军【作者单位】中国食品发酵工业研究院北京市蛋白功能肽工程技术研究中心,北京100027;中国食品发酵工业研究院北京市蛋白功能肽工程技术研究中心,北京100027;中国食品发酵工业研究院北京市蛋白功能肽工程技术研究中心,北京100027;中国食品发酵工业研究院北京市蛋白功能肽工程技术研究中心,北京100027;中国食品发酵工业研究院北京市蛋白功能肽工程技术研究中心,北京100027【正文语种】中文根据流行病学调查，全世界范围内约有2%的成年人、8%的婴幼儿对食物产生过敏反应，其中90%以上的食物过敏反应由蛋、奶、鱼、甲壳类动物、花生、大豆、坚果和小麦等八大类食物引起[1]。
鱼类过敏原研究进展
（１．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆＴｒｏｐｉｃａｌ Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｓｅａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＯｃｅａｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０３０１；２．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＣｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４９）
物过敏是与鱼类相关的１２Ｊ。在挪威，儿童对鱼类过敏 则跟对鸡蛋过敏一样常见，而在芬兰，儿童对鱼类 过敏则更常见【ｊＪ。近年来，鱼类更是作为一种重要的 食品调料应用于市场，其不明确的标注和国际贸易 的发展使得鱼类过敏的风险大大增加，对鱼类过敏 原的鉴定、过敏机制的探讨以及脱敏技术的研究变 得愈加重要。本综述比较了不同类别的鱼类过敏原， 探讨了新的过敏原、可能的潜在的分子和免疫机制、 诊断和处理这个终身存在的过敏反应的创新方法， 为提高食品中鱼类过敏原的检测水平，改进过敏疾 病的诊断方法提供依据。
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｆｉｓｈ ａｌｌｅｒｇｅｎ；ａｌｌｅｒｇｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ；ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｈｙｐｏ－ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ
水产品在人类饮食营养架构和健康生活中扮演 着一个非常重要的角色，但其在易感个体中会引起
严重的ＩｇＥ抗体介导的不良反应。据世界变态反应组 织报道，在２００８年，约有２０％￣３０％的世界人口受到 一种或多种类型的过敏反应的影响，水产品过敏尤 为严重…。人们常因为烹饪习惯把水产品中鱼类和甲 壳类动物同时讨论，但其过敏原引起的致敏机制是 不同的，所以得分开进行全面的讨论。鱼类是ＦＡＯ 公布的八大类易引起食物过敏症状的食物种之 一。一般对鱼类过敏的患者通常不只会对单一种鱼 过敏，而是对一系列不同种的鱼类都会产生过敏反 应。对于喜爱吃鱼的地区而言，其人口中对鱼类过 敏的比例会相对较高。在西班牙，小孩食物过敏中 有１８％为鱼类过敏，而在瑞典，则有３９％的小孩食
食品过敏原及其检测分析技术
食品过敏原及其检测分析技术
余清;黄红霞;刘绍文
【期刊名称】《质量技术监督研究》
【年(卷),期】2009(000)002
【摘要】本文综述了食品过敏原、检测分析技术等方面的研究现状及发展趋势,涉及过敏性食物种类、主要的食品过敏原、过敏原的生物活性及形成机制,并对食品过敏原现有的检测分析技术及其发展方向做了相关的介绍。
【总页数】5页(P27-31)
【作者】余清;黄红霞;刘绍文
【作者单位】福建省中心检验所;福建省质量技术监督局
【正文语种】中文
【中图分类】R155.5
【相关文献】
1.食品加工技术对于食品过敏原的影响 [J], 夏秀华
2.应用生物共振技术对过敏性紫癜患者过敏原检测分析 [J], 颜信芬;朱培华;杨巧巧
3.食品检测分析技术在食品安全中的作用 [J], 王金梅
4.食品检测分析技术在食品安全中的有效性 [J], 吴思利;翁剑梅
5.现代食品检测分析技术在食品安全中的应用 [J], 肖陈
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AK的线性表位预测
AK的亲水性、可塑性、抗原性及表面可及性分析
AK的9个预测线性抗原表位分布示意图 9个线性表位：Leu39-Thr44、Glu87-Asp103、Lys146-Lys151、Thr174-Leu181、
Ile253-Arg256、Arg294-Glu298、Arg309-Glu317、Ile325-Arg330和Ile352-Gln357
AK的构象表位预测
AK的7个预测构象抗原表位分布示意图 7个构象型表位：1：（91-92，94-98，101-102，263）；2：（106）；3：（115116）；4：（172-180，183）；5：（295，299）；6：（315）；7：（320-321）
数据分析
构象表位的定位
定点突变：用基因工程方法在抗原特定位点引入突变，根据突 变产物的免疫活性检测结果定位抗原表位和表位中关键氨基酸
3. 水产品的过敏原
主要过敏原
原肌球蛋白（tropomyosin，TM）
TM是一种甲壳类及软体类动物的泛过敏原，分子量38 kDa， 结构稳定且耐高温
精氨酸激酶（Arginine kinase，AK）
甲壳类动物过敏原，分子量40 kDa，等电点6.5，热加工和酸 碱处理能够降低其免疫反应性
小清蛋白（Parvalbumin，PV）
116.0
4.0
66.2
45.0
0.3
3.0
35.0
25.0
0.2
2.0
18.4
14.4
0.1
1.0
0
0.0 0
20
40
60
80
100
120
140
160
Fraction No. (3mL/tube)
纯化目的蛋白的结合活性检测
(kDa) M 1 2
116.0 66.2 45.0 35.0
25.0
18.4 14.4
14.4
C
100
Inhibition rate (%)
80
60
胃蛋白酶 (1 h)
40
胰液 (4 h)
20
对照
0 0 0.02 1 0.2 2 2 3 20 4 40 5
Inhibitor concentration (μg/mL)
M：蛋白分子量标准； (A)：模拟胃液消化； (B)：模拟肠液消化； (C)：消化产物抑制性ELISA。
4. 过敏原的抗原表位
过敏原
致敏阶段
过敏阶段
APC
Y
TCR
B
Y
Th2
Y
IL-4, IL-13 …
Y YY
Y YY
效应细胞
炎症反应 介质释放
临床 症状
食物过敏与抗原表位
抗原表位，又称为抗原决定簇，是指抗 原结构表面存在的可促使机体产生抗体 或与免疫细胞结构中抗原受体发生结合 的免疫活性区
线性表位：约10~20个氨基酸左右的小分子多肽，这些表位由序列 上相连的氨基酸组成，须由抗原呈递细胞将抗原加工处理为小分子 多肽才能被识别
AK分段表达
免疫学实验 动物实验
重叠肽：通过合成连续的重叠肽段，覆盖整个过敏原分子的一 级结构，用抗体筛选出阳性肽段
线性/构象表位的定位
噬菌体展示技术：将不同外源多肽基因与噬菌体衣壳蛋白基因相 融合，使外源多肽以融合蛋白形式表达在噬菌体表面，构建出噬 菌体随机肽库，通过酶-底物、抗原-抗体、配体-受体等生物分子 间亲和力从随机肽库中淘选出特定的肽段
34
(B)
动物抗体鉴定
M：蛋白分子量标准；(A)：SDS-PAGE； (B)：Western-blotting (兔抗拟穴青蟹AK 抗体 1：4000) 1、3：纯化克氏原螯虾AK；
2、4：纯化的拟穴青蟹AK
PN
IgE结合活性检测 P：甲壳类过敏患者血清； N：健康人血清池 (阴性对照)。
纯化目的蛋白的质谱鉴定
核磁共振 氢氘交换-质谱串联
定点突变 噬菌体展示
抗原表位的预测
线性表位预测：
亲水性方案：抗原表位一般暴露于抗原分子表面，而通常蛋白
质中构亲象水表性位氨预基测酸：残基位于蛋白质表面，疏水性氨基酸残基包
埋于分子内部，因此氨基酸残基的亲水性在一定程度上决定了 它是基否于能蛋够白构质成三抗维原构表象位的预测 ：根据蛋白质的空间结构特
点及抗原表位的几何特性、理化特性 可塑性方案：蛋白质分子中某些活动性较强的氨基酸残基组成 的柔Di性sco部T位op具e软有件较：强通的过可对塑蛋性白，质形的成空抗间原特表征位及的氨可基能酸性残较基大
的表面可及性分析计算，对每个氨基酸残基构成表位的可 可触及的能性可性方能进案性行：评主价要，分最析终抗确原定分构子象中表的位氨的基氨酸基残酸基组被成溶剂分子接
分子量18~20 kDa，MLC分为18 kDa的基本轻链（MLC1）和20 kDa的调 节性轻链（MLC2）
肌钙蛋白C （troponin C，TnC）
褐虾和北极虾中发现的17 kDa次要过敏原，Ca2+对其致敏性的影响等有待 进一步研究
血蓝蛋白 (hemocyanin, HMC)
存在于血淋巴中，由六个氨基酸数为630~660、分子量70~80 kDa的异源 亚基构成的六聚体，被证实是罗氏沼虾、克氏原螯虾的新型过敏原
肽指纹图谱分析
肽段匹配结果
Purified protein
Scylla paramamosain
60
Purified protein
Scylla paramamosain
120
Purified protein
Scylla paramamosain
180
Purified protein
Scylla paramamosain
180°
N
N
C PC-TIM-1
PC-TIM-2
3
4 C
2 1
180°
N
N
C
65
抗原表位的定位
线性表位的定位
化学切割/酶解：将蛋白质切割成较小的片段，再通过抗体筛选出活 性片段并用一定的方法分离和鉴定这些片段的氨基酸序列
过敏原蛋白
切割/酶解成肽段
HPLC分离纯化
免疫活性检测
质谱鉴定
基因工程技术：利用微生物对过敏原进行分段表达，这种方法需 要设计特定的引物克隆过敏原特定片段，借助于表达宿主对基因 片段进行表达，再对表达产物进行免疫活性检测
ELISA
包被待测抗原
抗体
Western blot
酶标二抗
显色
Dot blot
过敏原的鉴定——肌肉蛋白的血清学分析
A
B
(kDa) M MF
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 N
116.0
66.2
45.0
46.0
35.0 30.0
25.0
18.4 14.4
36 kDa
克氏原螯虾肌原纤维蛋白过敏组分的鉴定
鱼类主要过敏原，是一种钙离子结合蛋白，分子量12 kDa， 存在5个IgE结合位点，对热和pH均稳定
次要过敏原
肌钙结合蛋白 （sarcoplasmic calcium-binding protein，SCP）
甲壳类动物中的新型过敏原，分子量20 kDa，具有多态性，亚型存在不 同的IgE结合活性
磷酸丙糖异构酶 （triosephosphate isomerase，TIM）
240
Purified protein
Scylla paramamosain
300
Purified protein
Scylla paramamosain
357
与Scylla paramamosain AK 的序列相似性分别为100 %。
过敏原的性质分析
AK的理化性质分析
糖蛋白鉴定 (PAS染色)
(kDa) 1 2 3
5. 水产品过敏原的抗原表位
过敏原
线性表位
构象表位
11~16；20~32；36~42；55~60；
TM
69~77；97~107；119~126；132~140 ；146~150；157~165；177~186；
210~225；244~257；261~270
43~44,
SCP
141~145；149~156；175~179
M：标准蛋白；1：肌肉组织 捣碎液；2：离心后上清；3： 70 %盐析上清；4：70 %盐析 沉淀溶解液；5：90 %盐析上 清；6：90 %盐析沉淀溶解液
Q-Sepharose阴离子交换柱层析
Absorbance at 280 nm NaCl Conc. (moL/L)
(kDa) M 39
5.0
A
116.0 66.2
45.0
AK
35.0
25.0
18.4 14.4
B
30 40 44 50 60 70 80 90 100 con (ºC)
B 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 con (pH)
M：蛋白分子量标准 ； con：对照；
(A)：SDS-PAGE； (B)：Dot blot
A (kDa) M 30 40 42 44 46 48 50 55 60 70 80 90 100 con (ºC)
116.0 66.2
45.0
AK
35.0
25.0
18.4 14.4
(kDa) M 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 con ( pH)