水产食品过敏原及其抗原表位的研究-刘光明
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点及抗原表位的几何特性、理化特性 可塑性方案：蛋白质分子中某些活动性较强的氨基酸残基组成 的柔Di性sco部T位op具e软有件较：强通的过可对塑蛋性白，质形的成空抗间原特表征位及的氨可基能酸性残较基大
的表面可及性分析计算，对每个氨基酸残基构成表位的可 可触及的能性可性方能进案性行：评主价要，分最析终抗确原定分构子象中表的位氨的基氨酸基残酸基组被成溶剂分子接
116.0 66.2 45.0
AK 35.0
25.0
18.4 14.4
泳道1：BSA； 泳道2：IgG； 泳道3：克氏原螯虾AK。
等电点测定
pH
3.0 4.0 5.0 6.5 (kDa) M
8.0 9.0 10.0
116.0 66.2 45.0 35.0
25.0
18.4 14.4
热稳定性分析
pH 稳定性分析
47~49,
72~74
TIM
13~18；68~70；96~99；130~140； 174~182；199~202
132， 135~138，
194
MLC
55~61；76~83；94~99；117~122
23, 54~57, 59~60, 79, 85, 96~100, 136~137
表位分布
2 C
3
1
AK分段表达
免疫学实验 动物实验
重叠肽：通过合成连续的重叠肽段，覆盖整个过敏原分子的一 级结构，用抗体筛选出阳性肽段
线性/构象表位的定位
噬菌体展示技术：将不同外源多肽基因与噬菌体衣壳蛋白基因相 融合，使外源多肽以融合蛋白形式表达在噬菌体表面，构建出噬 菌体随机肽库，通过酶-底物、抗原-抗体、配体-受体等生物分子 间亲和力从随机肽库中淘选出特定的肽段
A
116.0 66.2
45.0
AK
35.0
25.0
18.4 14.4
B
30 40 44 50 60 70 80 90 100 con (ºC)
B 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 con (pH)
M：蛋白分子量标准 ； con：对照；
(A)：SDS-PAGE； (B)：Dot blot
34
(B)
动物抗体鉴定
M：蛋白分子量标准；(A)：SDS-PAGE； (B)：Western-blotting (兔抗拟穴青蟹AK 抗体 1：4000) 1、3：纯化克氏原螯虾AK；
2、4：纯化的拟穴青蟹AK
PN
IgE结合活性检测 P：甲壳类过敏患者血清； N：健康人血清池 (阴性对照)。
纯化目的蛋白的质谱鉴定
流行病学调查结果
食品过敏原
食品过敏是IgE介导的速发型过敏反应，能够诱 发机体产生IgE，进一步诱导肥大细胞和嗜碱性粒细 胞释放介质从而引起过敏反应的食品成分就是过敏原
已报道的食品过敏原大部分是糖基化且具有酸性 等电点的蛋白质，分子量一般在10-90 kDa，具有较好 的热稳定性和消化耐受性
2. 过敏原的检测与鉴定
240
Purified protein
Scylla paramamosain
300
Purified protein
Scylla paramamosain
357
与Scylla paramamosain AK 的序列相似性分别为100 %。
过敏原的性质分析
AK的理化性质分析
糖蛋白鉴定 (PAS染色)
(kDa) 1 2 3
构象表位：在空间结构上相互临近的氨基酸或多糖组成，约由4~6 个氨基酸残基或者糖基组成，一般存在于天然抗原分子表面，不经 加工处理即可直接被识别
过敏原抗原表位的定位分析
线性表位
过敏原抗原表位的定位分析
表位预测
表位定位
基于蛋白质的氨基酸序列
化学切割/酶解 基因工程 重叠肽
噬菌体展示
构象表位
基于蛋白质三维构象
肽指纹图谱分析
肽段匹配结果
Purified protein
Scylla paramamosain
60
Purified protein
Scylla paramamosain
120
Purified protein
Scylla paramamosain
180
Purified protein
Scylla paramamosain
数据分析
构象表位的定位
定点突变：用基因工程方法在抗原特定位点引入突变，根据突 变产物的免疫活性检测结果定位抗原表位和表位中关键氨基酸
Ile253-Arg256、Arg294-Glu298、Arg309-Glu317、Ile325-Arg330和Ile352-Gln357
AK的构象表位预测
AK的7个预测构象抗原表位分布示意图 7个构象型表位：1：（91-92，94-98，101-102，263）；2：（106）；3：（115116）；4：（172-180，183）；5：（295，299）；6：（315）；7：（320-321）
抗原性方案 ：通过计算氨基酸残基在抗原表位中出现的频率找 出表位中最常出现的氨基酸残基
AK的线性表位预测
AK的亲水性、可塑性、抗原性及表面可及性分析
AK的9个预测线性抗原表位分布示意图 9个线性表位：Leu39-Thr44、Glu87-Asp103、Lys146-Lys151、Thr174-Leu181、
5. 水产品过敏原的抗原表位
过敏原
线性表位
构象表位
11~16；20~32；36~42；55~60；
TM
69~77；97~107；119~126；132~140 ；146~150；157~165；177~186；
210~225；244~257；261~270
43~44,
SCP
141~145；149~156；175~179
水产食品过敏原及其 抗原表位的研究
集美大学 刘光明
目录
1. 食品过敏与食品过敏原 2. 过敏原的检测与鉴定 3. 水产品的过敏原 4. 过敏原的抗原表位 5. 水产品过敏原的抗原表位 6. 问题与展望
1. 食品过敏与食品过敏原
食品过敏是指由免疫系统介导的不良反应 全世界约有3-4%的成年人和6-8%的儿童对食品产生过 敏反应，食品过敏已成为全球关注的公共卫生问题
116.0
4.0
66.2
45.0
0.3
3.0
35.0
25.0
0.2
2.0
18.4
14.4
0.1
1.0
0
0.0 0
20
40
60
80
100
120
140
160
Fraction No. (3mL/tube)
纯化目的蛋白的结合活性检测
(kDa) M 1 2
116.0 66.2 45.0 35.0
25.0
18.4 14.4
消化稳定性分析
A (kDa) M 0 1 2 5 10 15 30 60 con (min)
B (kDa) M 0 1 15 30 60 120 180 240 con (min)
116.0 66.2
116.0 66.2
45.0
45.0
AK
AK
35.0
35.0
25.0
25.0
18.4
18.4
14.4
A：肌浆蛋白过敏组分鉴定；B：肌原纤维过敏组分鉴定 M：标准蛋白；MS：肌浆蛋白；MF：肌原纤维蛋白；1-14：甲壳类过敏患者血清；
N：健康人混合血清池
过敏组分的纯化与鉴定
过敏蛋白 离心 纯化
硫酸铵盐析
柱层析
纯化蛋白
质谱鉴定
克氏原螯虾肌浆蛋白中40 kDa过敏组分的纯化鉴定
肌浆蛋白样品前处理
40 kDa目的蛋白纯化前处理
180°
N
N
C PC-TIM-1
PC-TIM-2
3
4 C
2 1
180°
N
N
C
65
抗原表位的定位
线性表位的定位
化学切割/酶解：将蛋白质切割成较小的片段，再通过抗体筛选出活 性片段并用一定的方法分离和鉴定这些片段的氨基酸序列
过敏原蛋白
切割/酶解成肽段
HPLC分离纯化
免疫活性检测
质谱鉴定
基因工程技术：利用微生物对过敏原进行分段表达，这种方法需 要设计特定的引物克隆过敏原特定片段，借助于表达宿主对基因 片段进行表达，再对表达产物进行免疫活性检测
鱼类主要过敏原，是一种钙离子结合蛋白，分子量12 kDa， 存在5个IgE结合位点，对热和pH均稳定
次要过敏原
肌钙结合蛋白 （sarcoplasmic calcium-binding protein，SCP）
甲壳类动物中的新型过敏原，分子量20 kDa，具有多态性，亚型存在不 同的IgE结合活性
磷酸丙糖异构酶 （triosephosphate isomerase，TIM）
14.4
C
100
Inhibition rate (%)
80
60
胃蛋白酶 (1 h)
40
胰液 (4 h)
20
对照
0 0 0.02 1 0.2 2 2 3 20 4 40 5
Inhibitor concentration (μg/mL)
M：蛋白分子量标准； (A)：模拟胃液消化； (B)：模拟肠液消化； (C)：消化产物抑制性ELISA。
M：标准蛋白；1：肌肉组织 捣碎液；2：离心后上清；3： 70 %盐析上清；4：70 %盐析 沉淀溶解液；5：90 %盐析上 清；6：90 %盐析沉淀溶解液
Q-Sepharose阴离子交换柱层析
Absorbance at 280 nm NaCl Conc. (moL/L)
(kDa) M 39
5.0
A (kDa) M 30 40 42 44 46 48 50 55 60 70 80 90 100 con (ºC)
116.0 66.2
45.0
AK
35.0
25.0
18.4 14.4
(kDa) M 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 con ( pH)
克氏原螯虾、褐虾、鲭鱼等新型过敏原，分子量28 kDa，TIM具有Hale Waihona Puke Baidu个构 象表位和5个线性表位
细丝蛋白C （Filamin C，FLN c） 是克氏原螯虾新型过敏原，分子量90 kDa，具有8个构象表位和9个线性 表位，FLN c与TIM因存在相同抗原表位区域而能够结合相同的抗体
肌球蛋白轻链 （myosin light chain，MLC）
胃肠道
皮肤系统
严重时可导致过敏性休克甚至危及生命
呼吸道
八大类过敏食物 - FAO/WHO (1995)
花生
蛋
鱼 大豆
奶
坚果
小麦
甲壳类
4
在我国，婴幼儿对奶和鸡蛋类过敏较为常见，而成年 人中甲壳类水产品过敏患者的比例最高
3.0
2.5
2.0
1.5
Children
1.0
Adults
0.5
0.0
(%) Milk Egg TrePeeannutust Fish Shellfish
ELISA
包被待测抗原
抗体
Western blot
酶标二抗
显色
Dot blot
过敏原的鉴定——肌肉蛋白的血清学分析
A
B
(kDa) M MF
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 N
116.0
66.2
45.0
46.0
35.0 30.0
25.0
18.4 14.4
36 kDa
克氏原螯虾肌原纤维蛋白过敏组分的鉴定
核磁共振 氢氘交换-质谱串联
定点突变 噬菌体展示
抗原表位的预测
线性表位预测：
亲水性方案：抗原表位一般暴露于抗原分子表面，而通常蛋白
质中构亲象水表性位氨预基测酸：残基位于蛋白质表面，疏水性氨基酸残基包
埋于分子内部，因此氨基酸残基的亲水性在一定程度上决定了 它是基否于能蛋够白构质成三抗维原构表象位的预测 ：根据蛋白质的空间结构特
4. 过敏原的抗原表位
过敏原
致敏阶段
过敏阶段
APC
Y
TCR
B
Y
Th2
Y
IL-4, IL-13 …
Y YY
Y YY
效应细胞
炎症反应 介质释放
临床 症状
食物过敏与抗原表位
抗原表位，又称为抗原决定簇，是指抗 原结构表面存在的可促使机体产生抗体 或与免疫细胞结构中抗原受体发生结合 的免疫活性区
线性表位：约10~20个氨基酸左右的小分子多肽，这些表位由序列 上相连的氨基酸组成，须由抗原呈递细胞将抗原加工处理为小分子 多肽才能被识别
分子量18~20 kDa，MLC分为18 kDa的基本轻链（MLC1）和20 kDa的调 节性轻链（MLC2）
肌钙蛋白C （troponin C，TnC）
褐虾和北极虾中发现的17 kDa次要过敏原，Ca2+对其致敏性的影响等有待 进一步研究
血蓝蛋白 (hemocyanin, HMC)
存在于血淋巴中，由六个氨基酸数为630~660、分子量70~80 kDa的异源 亚基构成的六聚体，被证实是罗氏沼虾、克氏原螯虾的新型过敏原
3. 水产品的过敏原
主要过敏原
原肌球蛋白（tropomyosin，TM）
TM是一种甲壳类及软体类动物的泛过敏原，分子量38 kDa， 结构稳定且耐高温
精氨酸激酶（Arginine kinase，AK）
甲壳类动物过敏原，分子量40 kDa，等电点6.5，热加工和酸 碱处理能够降低其免疫反应性
小清蛋白（Parvalbumin，PV）
的表面可及性分析计算，对每个氨基酸残基构成表位的可 可触及的能性可性方能进案性行：评主价要，分最析终抗确原定分构子象中表的位氨的基氨酸基残酸基组被成溶剂分子接
116.0 66.2 45.0
AK 35.0
25.0
18.4 14.4
泳道1：BSA； 泳道2：IgG； 泳道3：克氏原螯虾AK。
等电点测定
pH
3.0 4.0 5.0 6.5 (kDa) M
8.0 9.0 10.0
116.0 66.2 45.0 35.0
25.0
18.4 14.4
热稳定性分析
pH 稳定性分析
47~49,
72~74
TIM
13~18；68~70；96~99；130~140； 174~182；199~202
132， 135~138，
194
MLC
55~61；76~83；94~99；117~122
23, 54~57, 59~60, 79, 85, 96~100, 136~137
表位分布
2 C
3
1
AK分段表达
免疫学实验 动物实验
重叠肽：通过合成连续的重叠肽段，覆盖整个过敏原分子的一 级结构，用抗体筛选出阳性肽段
线性/构象表位的定位
噬菌体展示技术：将不同外源多肽基因与噬菌体衣壳蛋白基因相 融合，使外源多肽以融合蛋白形式表达在噬菌体表面，构建出噬 菌体随机肽库，通过酶-底物、抗原-抗体、配体-受体等生物分子 间亲和力从随机肽库中淘选出特定的肽段
A
116.0 66.2
45.0
AK
35.0
25.0
18.4 14.4
B
30 40 44 50 60 70 80 90 100 con (ºC)
B 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 con (pH)
M：蛋白分子量标准 ； con：对照；
(A)：SDS-PAGE； (B)：Dot blot
34
(B)
动物抗体鉴定
M：蛋白分子量标准；(A)：SDS-PAGE； (B)：Western-blotting (兔抗拟穴青蟹AK 抗体 1：4000) 1、3：纯化克氏原螯虾AK；
2、4：纯化的拟穴青蟹AK
PN
IgE结合活性检测 P：甲壳类过敏患者血清； N：健康人血清池 (阴性对照)。
纯化目的蛋白的质谱鉴定
流行病学调查结果
食品过敏原
食品过敏是IgE介导的速发型过敏反应，能够诱 发机体产生IgE，进一步诱导肥大细胞和嗜碱性粒细 胞释放介质从而引起过敏反应的食品成分就是过敏原
已报道的食品过敏原大部分是糖基化且具有酸性 等电点的蛋白质，分子量一般在10-90 kDa，具有较好 的热稳定性和消化耐受性
2. 过敏原的检测与鉴定
240
Purified protein
Scylla paramamosain
300
Purified protein
Scylla paramamosain
357
与Scylla paramamosain AK 的序列相似性分别为100 %。
过敏原的性质分析
AK的理化性质分析
糖蛋白鉴定 (PAS染色)
(kDa) 1 2 3
构象表位：在空间结构上相互临近的氨基酸或多糖组成，约由4~6 个氨基酸残基或者糖基组成，一般存在于天然抗原分子表面，不经 加工处理即可直接被识别
过敏原抗原表位的定位分析
线性表位
过敏原抗原表位的定位分析
表位预测
表位定位
基于蛋白质的氨基酸序列
化学切割/酶解 基因工程 重叠肽
噬菌体展示
构象表位
基于蛋白质三维构象
肽指纹图谱分析
肽段匹配结果
Purified protein
Scylla paramamosain
60
Purified protein
Scylla paramamosain
120
Purified protein
Scylla paramamosain
180
Purified protein
Scylla paramamosain
数据分析
构象表位的定位
定点突变：用基因工程方法在抗原特定位点引入突变，根据突 变产物的免疫活性检测结果定位抗原表位和表位中关键氨基酸
Ile253-Arg256、Arg294-Glu298、Arg309-Glu317、Ile325-Arg330和Ile352-Gln357
AK的构象表位预测
AK的7个预测构象抗原表位分布示意图 7个构象型表位：1：（91-92，94-98，101-102，263）；2：（106）；3：（115116）；4：（172-180，183）；5：（295，299）；6：（315）；7：（320-321）
抗原性方案 ：通过计算氨基酸残基在抗原表位中出现的频率找 出表位中最常出现的氨基酸残基
AK的线性表位预测
AK的亲水性、可塑性、抗原性及表面可及性分析
AK的9个预测线性抗原表位分布示意图 9个线性表位：Leu39-Thr44、Glu87-Asp103、Lys146-Lys151、Thr174-Leu181、
5. 水产品过敏原的抗原表位
过敏原
线性表位
构象表位
11~16；20~32；36~42；55~60；
TM
69~77；97~107；119~126；132~140 ；146~150；157~165；177~186；
210~225；244~257；261~270
43~44,
SCP
141~145；149~156；175~179
水产食品过敏原及其 抗原表位的研究
集美大学 刘光明
目录
1. 食品过敏与食品过敏原 2. 过敏原的检测与鉴定 3. 水产品的过敏原 4. 过敏原的抗原表位 5. 水产品过敏原的抗原表位 6. 问题与展望
1. 食品过敏与食品过敏原
食品过敏是指由免疫系统介导的不良反应 全世界约有3-4%的成年人和6-8%的儿童对食品产生过 敏反应，食品过敏已成为全球关注的公共卫生问题
116.0
4.0
66.2
45.0
0.3
3.0
35.0
25.0
0.2
2.0
18.4
14.4
0.1
1.0
0
0.0 0
20
40
60
80
100
120
140
160
Fraction No. (3mL/tube)
纯化目的蛋白的结合活性检测
(kDa) M 1 2
116.0 66.2 45.0 35.0
25.0
18.4 14.4
消化稳定性分析
A (kDa) M 0 1 2 5 10 15 30 60 con (min)
B (kDa) M 0 1 15 30 60 120 180 240 con (min)
116.0 66.2
116.0 66.2
45.0
45.0
AK
AK
35.0
35.0
25.0
25.0
18.4
18.4
14.4
A：肌浆蛋白过敏组分鉴定；B：肌原纤维过敏组分鉴定 M：标准蛋白；MS：肌浆蛋白；MF：肌原纤维蛋白；1-14：甲壳类过敏患者血清；
N：健康人混合血清池
过敏组分的纯化与鉴定
过敏蛋白 离心 纯化
硫酸铵盐析
柱层析
纯化蛋白
质谱鉴定
克氏原螯虾肌浆蛋白中40 kDa过敏组分的纯化鉴定
肌浆蛋白样品前处理
40 kDa目的蛋白纯化前处理
180°
N
N
C PC-TIM-1
PC-TIM-2
3
4 C
2 1
180°
N
N
C
65
抗原表位的定位
线性表位的定位
化学切割/酶解：将蛋白质切割成较小的片段，再通过抗体筛选出活 性片段并用一定的方法分离和鉴定这些片段的氨基酸序列
过敏原蛋白
切割/酶解成肽段
HPLC分离纯化
免疫活性检测
质谱鉴定
基因工程技术：利用微生物对过敏原进行分段表达，这种方法需 要设计特定的引物克隆过敏原特定片段，借助于表达宿主对基因 片段进行表达，再对表达产物进行免疫活性检测
鱼类主要过敏原，是一种钙离子结合蛋白，分子量12 kDa， 存在5个IgE结合位点，对热和pH均稳定
次要过敏原
肌钙结合蛋白 （sarcoplasmic calcium-binding protein，SCP）
甲壳类动物中的新型过敏原，分子量20 kDa，具有多态性，亚型存在不 同的IgE结合活性
磷酸丙糖异构酶 （triosephosphate isomerase，TIM）
14.4
C
100
Inhibition rate (%)
80
60
胃蛋白酶 (1 h)
40
胰液 (4 h)
20
对照
0 0 0.02 1 0.2 2 2 3 20 4 40 5
Inhibitor concentration (μg/mL)
M：蛋白分子量标准； (A)：模拟胃液消化； (B)：模拟肠液消化； (C)：消化产物抑制性ELISA。
M：标准蛋白；1：肌肉组织 捣碎液；2：离心后上清；3： 70 %盐析上清；4：70 %盐析 沉淀溶解液；5：90 %盐析上 清；6：90 %盐析沉淀溶解液
Q-Sepharose阴离子交换柱层析
Absorbance at 280 nm NaCl Conc. (moL/L)
(kDa) M 39
5.0
A (kDa) M 30 40 42 44 46 48 50 55 60 70 80 90 100 con (ºC)
116.0 66.2
45.0
AK
35.0
25.0
18.4 14.4
(kDa) M 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 con ( pH)
克氏原螯虾、褐虾、鲭鱼等新型过敏原，分子量28 kDa，TIM具有Hale Waihona Puke Baidu个构 象表位和5个线性表位
细丝蛋白C （Filamin C，FLN c） 是克氏原螯虾新型过敏原，分子量90 kDa，具有8个构象表位和9个线性 表位，FLN c与TIM因存在相同抗原表位区域而能够结合相同的抗体
肌球蛋白轻链 （myosin light chain，MLC）
胃肠道
皮肤系统
严重时可导致过敏性休克甚至危及生命
呼吸道
八大类过敏食物 - FAO/WHO (1995)
花生
蛋
鱼 大豆
奶
坚果
小麦
甲壳类
4
在我国，婴幼儿对奶和鸡蛋类过敏较为常见，而成年 人中甲壳类水产品过敏患者的比例最高
3.0
2.5
2.0
1.5
Children
1.0
Adults
0.5
0.0
(%) Milk Egg TrePeeannutust Fish Shellfish
ELISA
包被待测抗原
抗体
Western blot
酶标二抗
显色
Dot blot
过敏原的鉴定——肌肉蛋白的血清学分析
A
B
(kDa) M MF
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 N
116.0
66.2
45.0
46.0
35.0 30.0
25.0
18.4 14.4
36 kDa
克氏原螯虾肌原纤维蛋白过敏组分的鉴定
核磁共振 氢氘交换-质谱串联
定点突变 噬菌体展示
抗原表位的预测
线性表位预测：
亲水性方案：抗原表位一般暴露于抗原分子表面，而通常蛋白
质中构亲象水表性位氨预基测酸：残基位于蛋白质表面，疏水性氨基酸残基包
埋于分子内部，因此氨基酸残基的亲水性在一定程度上决定了 它是基否于能蛋够白构质成三抗维原构表象位的预测 ：根据蛋白质的空间结构特
4. 过敏原的抗原表位
过敏原
致敏阶段
过敏阶段
APC
Y
TCR
B
Y
Th2
Y
IL-4, IL-13 …
Y YY
Y YY
效应细胞
炎症反应 介质释放
临床 症状
食物过敏与抗原表位
抗原表位，又称为抗原决定簇，是指抗 原结构表面存在的可促使机体产生抗体 或与免疫细胞结构中抗原受体发生结合 的免疫活性区
线性表位：约10~20个氨基酸左右的小分子多肽，这些表位由序列 上相连的氨基酸组成，须由抗原呈递细胞将抗原加工处理为小分子 多肽才能被识别
分子量18~20 kDa，MLC分为18 kDa的基本轻链（MLC1）和20 kDa的调 节性轻链（MLC2）
肌钙蛋白C （troponin C，TnC）
褐虾和北极虾中发现的17 kDa次要过敏原，Ca2+对其致敏性的影响等有待 进一步研究
血蓝蛋白 (hemocyanin, HMC)
存在于血淋巴中，由六个氨基酸数为630~660、分子量70~80 kDa的异源 亚基构成的六聚体，被证实是罗氏沼虾、克氏原螯虾的新型过敏原
3. 水产品的过敏原
主要过敏原
原肌球蛋白（tropomyosin，TM）
TM是一种甲壳类及软体类动物的泛过敏原，分子量38 kDa， 结构稳定且耐高温
精氨酸激酶（Arginine kinase，AK）
甲壳类动物过敏原，分子量40 kDa，等电点6.5，热加工和酸 碱处理能够降低其免疫反应性
小清蛋白（Parvalbumin，PV）