3第二章 基因操作的主要技术原理-3
基因工程的主要技术原理
①无带,先降,再稳定扩增
②有带,先高温稳定扩增,再降
（4）长片段PCR (long-range PCR)
①引物设计
25-30bp Tm相差不超过1℃
②扩增参数
缩短热变性时间， 94℃ 2 min 尽可能使升温、降温过程缩短 适当增加延伸时间，可到20min 二步法扩增
94℃ 2 min (预变性) 72℃ 7 min
template template
AD
3’ 5’
P1, P2, P3为特异性引物，25bp, Tm 65℃ 左右 AD为简并引物， 15-16bp, Tm 44-45℃
Liu, YG and Whittier RF (1995). Genomics 25:674-681.
五 .分子杂交 技术
1、Southern blot
4.8 kb
6.4 kb
ab
Pi36-1
Pi36-2
c
RiceGAAS预测
NBS-LRR
NBS-LRR
Northern blot的原理与Southern blot相比 有三点不同:
(1)检测的对象不同. (2) 变性方法是不同的, 它不能用碱变性,因为
碱变性会导致RNA的降解. (3)探针不同.
3、 Western blot
（3）降落PCR
配制的体系不变, PCR扩增的程序设置
上变化:
94℃ 4 min,
退火温度60℃
94℃ 30 sec,
66℃ 30 sec, 每2个循环降1-2 ℃, 20 cycles,
72℃ 2 min,
94℃ 30 sec,
56℃ 30 sec, 15 cycles,
72℃ 2 min
基因工程的主要技术原理
基因工程的主要技术原理基因工程是一种利用现代分子生物学和生物化学技术来对生物体进行基因组的修改、操作和调控的技术。
它的主要技术原理涉及到以下几个方面：1.DNA重组技术：DNA重组是基因工程的核心技术之一、它通过切割不同生物体中的DNA片段，然后重新组合、连接，将特定的基因或基因片段导入到目标组织、细胞或生物体中。
DNA重组技术包括PCR、限制酶切、DNA连接等。
2.遗传转化技术：遗传转化是将外源DNA导入目标生物细胞或组织中的过程。
常用的转化方法包括细菌的转化、植物的遗传转化以及动物细胞的转染等。
3.基因克隆技术：基因克隆是指通过复制DNA片段来得到多个完全相同的基因分子或有关基因分子的方法。
基因克隆包含了DNA提取、DNA扩增、DNA定序等技术。
5.选择标记技术：为了辅助识别和选择已经被转化的细胞或生物体，常常需要在外源基因上引入选择标记基因。
选择标记基因通常携带特定抗性或基因标记，如抗生素抗性基因或荧光蛋白基因。
6.基因表达调控技术：为了使外源基因在目标生物体中得到高效表达，常需对其进行适当调控。
基因表达调控技术包括启动子的选择、转录因子的调控、信号通路的调节等。
7. 基因测序技术：基因测序是确定DNA序列的方法，可用于分析基因组结构、功能和演化。
目前，最主要的基因测序技术是高通量测序技术，如Illumina测序技术和PacBio测序技术。
8.产生转基因生物技术：基因工程的一个重要应用是产生转基因生物。
转基因生物是指通过基因工程技术将外源基因导入到目标生物体中，使其获得新的性状或功能。
常见的转基因生物包括转基因植物、转基因微生物等。
以上是基因工程的主要技术原理。
随着科学技术的不断进步，基因工程技术将进一步发展和应用，为解决人类面临的许多生物学和医学问题提供更好的解决方案。
吴乃虎—基因工程原理
目录第一章基因与基因工程第一节基因研究的发展第二节基因的现代概念第三节基因工程的诞生及其主要的研究内容第二章基因操作的主要技术原理第一节核酸的凝胶电泳第二节核酸分子杂交第三节细菌转化1.肺炎球菌的转化2.大肠杆菌的转化3.细菌转化频率第四节DNA核苷酸序列分析第五节基因的化学合成第六节基因定点突变第七节基因扩增第八节研究DNA与蛋白质相互作用的方法第三章基因克隆的酶学基础第一节核酸内切限制酶与DNA分子的体外切割1.寄主控制的限制与修饰现象2.核酸内切限制酶的类型3.I 型和III型核酸内切限制酶的基本特性4.II型核酸内切限制酶的基本特性[1].基本特性[2].同裂酶[3].同尾酶[4].限制片段末端的连接作用5.核酸内切限制酶的命名法6.影响核酸内切限制酶活性的因素[1].DNA的纯度[2].DNA的甲基化程度[3].酶切消化反应的温度[4].DNA分子的结构[5].核酸内切限制酶的缓冲液7.核酸内切限制酶对DNA的消化作用[1].核酸内切限制酶与靶DNA识别序列的结合模式[2].核酸内切限制酶对DNA分子的局部消化作用[3].核酸内切限制酶对真核基因组DNA的消化作用第二节DNA连接酶与DNA分子的体外连接1.DNA连接酶2.粘性末端DNA片段的连接3.平末端DNA片段的连接[1].同聚物加尾法[2].衔接物连接法[3].DNA接头连接法4.热稳定的DNA连接酶[1].寡核苷酸连接测定法[2].连接酶链式反应(LCR)第三节DNA聚合酶1.DNA聚合酶I与核酸杂交探针的制备[1].DNA聚合酶I[2].DNA缺口转移[3].DNA杂交探针的制备2.大肠杆菌DNA聚合酶I 的Klenow片段与DNA末端标记3.T4 DNA聚合酶和取代合成法标记DNA片段4.依赖于RNA的DNA聚合酶与互补DNA的合成5.T7 DNA聚合酶6.修饰的T7 DNA聚合酶第四节DNA及RNA的修饰酶1.末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾2.T4多核苷酸激酶与DNA分子5’-末端的标记3.碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用第五节核酸外切酶1.核酸外切酶VII (exo VII)2.核酸外切酶III (exo III)3.λ核酸外切酶(λ exo)和T7基因6核酸外切酶第六节单链核酸内切酶1.S1核酸酶与RNA分子定位2.Bal1 核酸酶与限制位点的确定第四章基因克隆的质粒载体第一节质粒的一般生物学特性1.质粒DNA2.质粒DNA编码的表型3.质粒DNA的转移[1].质粒的类型[2].F质粒[3].质粒DNA的接合作用4.质粒DNA的迁移作用5.质粒DNA的复制类型6.质粒DNA的不亲和性[1].质粒的不亲和性现象[2].质粒不亲和性的分子基础7.第二节质粒DNA的复制与拷贝数的控制1.质粒DNA复制的多样性2.ColE 1质粒DNA复制的启动3.质粒DNA拷贝数的控制[1].天然质粒拷贝数的控制[2].杂种质粒拷贝数的控制4.质粒复制控制的分子模型[1].抑制蛋白质稀释模型[2].自体阻遏蛋白质模型5.第三节质粒DNA的分离与纯化1.氯化铯密度梯度离心2.碱变性法3.微量碱变性法4.影响质粒DNA产量的因素[1].寄主菌株的遗传背景[2].质粒的拷贝数与分子大小5.第四节质粒载体的构建与类型1.天然质粒用作克隆载体的局限性2.质粒载体必须具备的基本条件3.质粒载体的选择记号[1].高拷贝数的质粒载体[2].低拷贝数的质粒载体[3].失控的质粒载体[4].插入失活型的质粒载体[5].正选择的质粒载体[6].表达型的质粒载体4.第五节重要的大肠杆菌质粒载体1.pSC101 质粒载体[1].应用pSC101 质粒作基因克隆载体的实例一---葡萄球菌质粒基因在大肠杆菌中的表达[2].应用pSC101 质粒作基因克隆载体的实例二---在大肠杆菌中克隆非洲爪蟾2.Col 1质粒载体3.pBR322质粒载体[1].pBR322质粒载体的构建[2].pBR322质粒载体的优点[3].pBR322质粒载体的改良[4].应用pBR322质粒作为基因克隆载体的实例---水稻夜绿体光诱导基因psbA的结构分析4.pUC 质粒载体[1].pUC 质粒载体的结构[2].pUC 质粒载体的优点5.其他重要的质粒载体[1].丧失迁移功能的的质粒载体[2].能在体外转录克隆基因的质粒载体[3].穿梭质粒载体第六节质粒载体的稳定性问题1.质粒载体不稳定性的类型[1].结构的不稳定性[2].分离的不稳定性2.影响质粒载体稳定性的主要因素[1].新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应[2].拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响[3].寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应3.随机分配的分子机理[1].通过精巧的控制环路使质粒拷贝数的差度限制在最低的水平[2].通过位点特异的重组作用消除天然质粒的寡聚体[3].通过调节细胞的分裂活动阻止无质粒细胞的产生[4].大肠杆菌素的合成增进了质粒的稳定性4.主动分配的分子机理[1].分配区的结构与功能[2].预配对模型[3].二聚体的解离有助于质粒的主动分配[4].寄主致死功能对质粒稳定性的效应5.第五章噬菌体载体和柯斯载体第一节噬菌体的一般生物学特性第二节λ噬菌体载体第三节柯斯质粒载体第四节单链DNA噬菌体载体第五节噬菌体载体第六章基因的分离与鉴定第一节DNA克隆片段的产生与分离1.基因组DNA克隆片段的产生与分离2.DNA片段的大小分部3.编码目的基因的克隆片段的富集第二节重组体DNA分子的构建及导入受体细胞1.外源DNA片段同载体分子的重组[1].外源DNA片段定向插入载体分子[2].非互补粘性末端DNA分子间的连接[3].最佳连接反应2.重组体分子导入受体细胞的途径[1].重组体DNA分子的转化或转染[2].体外包装的λ噬菌体的转导第三节基因克隆的实验方案1.互补作用基因克隆2.cDNA基因克隆[1].cDNA文库的建立[2].不同丰度mRNA的cDNA克隆[3].全长cDNA的合成[4].cDNA克隆的优越性3.基因组DNA克隆[1].应用 噬菌体载体构建基因组文库[2].应用柯斯质粒载体构建基因组文库4.基因定位克隆[1].拟南芥菜简介[2].RFLP分子标记[3].RFLP作图的原理与步骤[4].染色体步移[5].大尺度基因组物理图谱的构建第四节克隆基因的分离1.应用核酸探针分离克隆的目的基因[1].核酸探针的来源[2].寡核酸探针的的人工合成[3].假阳性克隆的克服2.应用差别杂交或扣除杂交法分离克隆的目的基因[1].差别杂交[2].差别杂交的局限性[3].扣除杂交3.应用mRNA差别显示技术分离克隆的目的基因[1].mRNA差别显示的原理[2].mRNA差别显示的基本过程[3].mRNA差别显示的局限性4.引用表达文库分离克隆的目的基因5.酵母双杂交体系[1].酵母双杂交体系的基本原理[2].酵母双杂交体系的寄主菌株[3].酵母双杂交体系的实验程序第五节重组体分子的选择与鉴定1.遗传检测法[1].根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法[2].根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法2.物理检测法[1].凝胶电泳检测法[2].R-检测环法3.菌落或噬菌斑杂交筛选法4.免疫化学检测法[1].放射性抗体检测法[2].免疫沉淀检测法[3].表达载体产物之免疫化学检测法5.DNA蛋白筛选法6.转译筛选法[1].杂交抑制的转译[2].杂交选择的转译第七章基因的表达与调节第八章真核基因在大肠杆菌中的表达第一节真核基因的大肠杆菌表达体系第二节大肠杆菌的表达载体第三节克隆的真核基因在大肠杆菌中的表达第四节影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素第九章植物基因工程第十章哺乳动物基因工程第一节哺乳动物基因转移的遗传选择标记第二节外源DNA导入哺乳动物细胞的方法第三节SV 40病毒载体第四节反转录病毒载体第五节其他的病毒载体第十一章重组DNA与现代生物技术第十二章重组DNA与医学研究第一章基因与基因工程第一节基因研究的发展第二节基因的现代概念第三节基因工程的诞生及其主要的研究内容1.质的新组合，并使之参与到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能够持续稳定的繁殖。
基因工程的主要技术原理课件
接上人工接头
粘性末端
末端转移酶 CCC
CCC
基因工程的主要技术原理课件
基因工程%的mRNA时 所需要的克隆数目。
ln (1-p) N= ln (1- 1n)
蛋白B 转录激活domain
DNA binding domain 蛋白A
上游激活序列（UAS） 转录机 GAL4效应基因
基因工程的主要技术原理课件
不能转录
（2）如果蛋白A与蛋白B能相互结合
GAL4的DB domain与AD Domain也能 靠近，所以能启动效应基因的转录。
蛋白A
蛋白B
DNA binding domain 转录激活domain 激活转录
基因工程的主要技术原理课件
（2）载体与基因组DNA大片段的连接 直接连接、人工接头或同聚物加尾。
① 粘性末端直接连接 载体与外源DNA大片段的两个末端 都有相同的粘性末端。 如：Sau3A与BamHI的酶切末端。
②人工接头法（adapter） 人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。
基因工程的主要技术原理课件
第二章 基因工程的主要技术原理
基因工程的主要技术原理课件
五 .分子杂交技术
1、Southern blot
原理和方法:
双链DNA
限制性内切酶 消化
电泳分离
放射自显影
检测
洗膜
杂交 转膜
NaOH变性
NaOH或高温变性
标记的探针
基因工程的主要技术原理课件
应用: ➢ 基因拷贝数检测; ➢基因筛选, 获取目的基因; ➢遗传疾病诊断; ➢转基因样品检测, 等…
（3）cDNA的合成
基因操作的主要技术原理
• 核酸的凝胶电泳
• 扩增原理 • 分子杂交 • 测序
•核酸的凝胶电泳
它是一种分析鉴定重组DNA分子及 蛋白质与核酸相互作用的重要实验手 段，同时也是分子生物学研究方法的 技术基础。
• 基本原理
带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链， 依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖 凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在 电场中以一定的迁移率从负极移向正极。 根据核酸分子大小不同、构型或形状的 差异，以及所带电荷的不同，可以通过 电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。
杂种核酸分子： 彼此退火的核酸来自不同的生物有机体， 而形成的双链分子。 DNA/DNA的杂交作用 检测特定生物有 机体之间的亲源关系 DND/D种特定基因的位置。
核酸杂交常用几种膜的 性能比较
硝酸纤维素膜 不能滞留小于150bp的DNA片断，不能同 RNA结合。 应用1mol/L醋酸铵和0.2mol/L的NaOH 缓冲液代替SSC缓冲液可改善对小片断 DNA的滞留能力。 RNA变性后也能十分容易的结合到膜上。
温度（℃）
94
循环1
94℃变性 （1min）
循环2
循环3
72 60 60 ℃退火 （1min）
72 ℃延伸 （1.5min）
时间（min）
PCR反应的温度循环周期
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引 物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反 应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃ 延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增 产物的数量满足实验需求为止。
PolyAcrylamide Gels
• 脉冲电场凝胶电泳（PFGE） • 1984年，D.R.Cantor发明的。分离超大 分子量的DNA分子。
第二章.基因工程主要技术原理-电泳、杂交
24
基因工程
第二章 基因工程技术原理
DIG标记/检测举例
探针标记 6Nt随机寡核苷酸序列引物，Klenow标记
检测 漂洗 blocking 免疫反应 labeled Anti-DiG-Ab-Ap 洗涤 显色反应 化学发光检测 NBT-BCIP 形成棕黄色沉淀
返回第二节 25
基因工程
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基因工程
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第二章 基因工程技术原理
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“电泳”思考题
❖电泳的原理是什么
❖请说出以下电泳用胶的区别：普通DNA分离、测序胶、
Southern 杂交
❖比较分子量相同的三种不同构型的DNA（直链线形、闭合
环形、开链环形）在同一电场中的电泳迁移率
❖比较溴化乙锭染色和银染的区别
❖说明电泳技术在基因工程中的作用
方法：加入凝胶中，凝胶浸泡 重要的特性：荧光强度同DNA片段的 大小或数量成正比。在包含有数种 DNA片段的电泳谱带中，每一条带的 荧光强度是随着从最大的DNA片段到 最小的DNA片段方向逐渐降低的。
10
基因工程
第二章 基因工程技术原理
电泳照片
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基因工程
第二章 基因工程技术原理
银染
银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合 物，然后用还原剂如甲醛 使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电 泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色. 也用于 琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA 不宜回收
DEPC H2O ✓ 制胶
甲醇（MW 30.03）通常为37%水溶液，12.3M(pH>4.0)
终浓度，1×buf + 2.2M甲醇
基因工程原理与技术-3
pBV221
rrnB
制备RNA探针的载体
两条链RNA 探针的制备程序
简化外源蛋白纯化的载体(标签载体) pBAD/His
常用的标签： 多聚组氨酸残基、 结合麦芽糖蛋白、 谷胱甘肽-s-转移 酶。
亲和层析法纯 化外源蛋白。
pBAD/His的三种变体(3种读码框)
BglII site of the MCS.
表达载体
(根据受体细胞)
原核细胞表达载体 真核细胞表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的转运)
分泌型表达载体 非分泌型表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的组成)
融合型表达载体 非融合型表达载体
大肠杆菌表达载体的特征(与克隆载体相比)：①强启动
子；如Lac、Trp、Tac、PL、PR、T7启动子。②SD序列； ③强终止子。如rrnB。
大多数)、双链线形 DNA、RNA(酵母的 杀伤质粒)。
提取的质粒有三 种构型：①闭合环形 DNA(超螺旋构型)， ②开环形DNA，③线 形DNA。
2、质粒的复制类型 严紧型：严格受宿主控制，1~3拷贝
松弛型：不严格受宿主控制，10~200拷贝
质粒的复制类型与宿主有关，如R1质粒在大肠杆菌中 是严紧型，而在奇异变形杆菌是松弛型；ColE1-K30质粒与 R1质粒正好相反。
起点和选择标记、可在两种不同的宿主细胞中存活和复制 的质粒载体。
如：大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体(植物转化载 体)、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体(见下图)、大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体(pHV14、pEB10)、大肠杆菌-动 物细胞穿梭质粒载体(pBPV-BV1)，但还没有大肠杆菌-植物 细胞穿梭质粒载体。
例如，将λ噬菌体在EcoRI限制-修饰的宿主和EcoRI限制-修 饰缺陷型宿主之间反复地循环生长，筛选到完全失去了 EcoRI酶切位点的λ噬菌体。然后将突变体同野生型λ噬菌体 在体内进行重组，选择得到仅在非必需区段具有1~2个 EcoRI酶切位点的重组体噬菌体。
基因操作主要技术原理
➢ ③ 电转化（电穿孔法): 其原理是用高压脉冲电流击破细胞 膜或形成小孔，使得DNA大分子进入细胞。当电场强度、脉 冲强度以一定的组合造成细胞50-75%的死亡率时，转化水 平最高，转化率是人工制备感受态细胞转化率的10-20倍。
▪ 基因扩增的定义 ▪ PCR技术的基本原理和特点 ▪ 影响因素 ▪ PCR技术的研究应用 ▪ PCR扩增效率的指标：
有效性、特异性、忠实性
The Nobel Prize in Chemistry 1993 "for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry" "for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method"
➢ ④ Biolistic(基因枪)转化 : 将包裹有DNA的钨粒象子弹一样 高压射入细胞或细胞器。
Thank you for your attention
基因操作主要技术原理
basic principles of gene manipulation
目的基因的表达
▪ 制备大量目的基因片段
PCR
▪ 重组DNA
鉴定目的基因 (凝胶电泳、测序、核酸杂交)
转化
▪ 宿主细胞
抗生素筛选，或蓝白斑筛选
▪ 重组子的筛选
▪ 表达蛋白的收集，纯化
1.基因扩增gene amplification
Kary B. Mullis La Jolla, CA, USA B:1944
2.核酸凝胶电泳
基因操作的主要技术原理
提取核酸的一般程序:
破碎细胞 及多糖等 去除与核酸结合的蛋白质 去除其它核酸分子 沉
淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质 纯化核酸 核酸的质量评估（电泳、
D260/OD280、酶切）
二、质粒载体的分离与纯化
关键：如何使质ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱDNA与宿主染色体 DNA分开 依据：质粒DNA比染色体DNA小得多， 在DNA提取过程中，染色体DNA断裂 成片段 ( 线状 ) ，而质粒 DNA 仍保持超 螺旋构型
Preparation of highmolecular-weight DNA for analysis by PFGE
第三节 DNA序列分析
1. 双脱氧核苷酸链终止法
Dideoxy-termination sequencing Sanger法
基本原理：
双脱氧（2'，3'）-核苷酸可以象2'脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的 DNA 链中，但因 3’ 端不具 OH 基， DNA 链合 成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个 DNA 分子中掺入的位置不同，故可根据 不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列
See movie part 2
3. Maxam-Gilbert化学法 原理：DNA链上的不同碱基可以和碱 基修饰剂发生反应，然后发生1~2个碱 基的脱落或取代，最后发生链断裂，不 同位置断裂的DNA分子经凝胶电泳就可 确定其核苷酸序列
反应 R1 R2 R3 R4
断裂位置 G G+A C+T C
哺乳动物细胞染色体DNA的制备
细胞或组织（研磨） 加入裂解液（ 10mMTris-HCl, 0.1mM EDTA, 0.5%SDS，RNaseA）, 37℃ 1h 加入蛋白酶K，50℃水浴3h 苯酚抽提去除蛋白质
基因操作的主要技术原理
基因操作的主要技术原理1．核酸的凝胶电泳(Agarose & Polyacrylamide)将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。
某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。
在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。
将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。
在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。
DNA的脉冲电泳技术 :PFGE-Pulse-field gel electrophoresis2．核酸的分子杂交技术在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地"吸印" 转移到滤膜上的。
常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）等。
核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹(nucleic acid blotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)；将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。
所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。
3．细菌的转化所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。
这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。
第二章基因操作的主要技术原理2
22
nothernblot
Gene engineering
四、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交
斑点印迹杂交（dot blotting）和狭线印迹杂 交（slot blotting ）是在Southern印迹杂交的基 础上发展的量种类式的快速检测特定核酸 （DNA和RNA）分子的核酸杂交技术。由于在 实验的加样过程中使用了特殊设计的加样装置， 使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜 上，并有规律地排列成点阵或线阵。这两项技 术更适应与核酸样品的定量检测。
10
Gene engineering
尼龙膜
很强的抗张性，易于操作，与核酸分子 的结合能力大。 DNA以天然的形式从凝胶上转移到膜上， 在尼龙膜上进行原位碱变性。
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Gene engineering
尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤
1)核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体 支持膜上(毛细管作用)
2)印迹杂交： 将具有核酸印迹的滤膜同带 有标记的DNA/RNA进行杂交。
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Gene engineering
DNA + DMS
+ Saturating [Protein] Gel Shift
44
Gene engineering
4、甲基化干扰实验（methyltion interference assay）
根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡 啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理，设计出了另一 种研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰 实验。这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化 对而后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细 地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。
3第二章 基因操作的主要技术原理-3
限制酶部分消化
除去中间片段
R cos 右臂
~20 Kb DNA 片段
外源DNA与载体DNA混合
cos L ~20 Kb 外源 DNA 片段 R cos
连接反应
体外包装转录酶 cDNA
AAAA
逆转录酶
AAAA TTTT
用二氯乙酸或三氯乙酸处理，脱去核苷酸1的5’-OH基团偶联的保护基团 DMT
2、偶联反应
通过弱碱-四唑的催化反应，使第二个核苷酸同已附在固相载体上的核苷 酸1的暴露5’-OH缩合。
3、封端反应
加入乙酸酐激发的乙酰化作用，把所有没有参与偶联反应的5’-OH基团全 部封闭起来
4、氧化作用
利用碘液催化作用，把核苷酸1和2间的3’-5’亚磷酸三酯键氧化为稳定的3’5’ 磷酸三酯键
4、氧化作用
利用碘液催化作用，把核苷酸1和2间的3’-5’亚磷酸三酯键氧化为稳定的3’5’ 磷酸三酯键
反复重复以上步骤
DNA固相合成法
DNA 固相 合成 法
4,4'-二甲氧基三苯基
亚磷酰胺
二异丙基胺
DNA固相合成的原理如下：全部反应是按一个不大的固相柱子中进行的。首
先要将待活化的核苷酸上的某些游离基团保护（封闭）起来，使反应按设 计的方向进行。5‘-OH用二对甲氧三苯甲基 (DMT)保护，碱基上的氨基用
3 磷酸三酯法
改进的办法之一是采用适当的保护基把磷酸上的OH基团也保 护起来，再进行连接反应。即如图4 所表示的那样，用甲核苷 3′-磷酸二酯（用R5保护磷酸上的OH基团）同乙核苷的5′-羟基 反应生成磷酸三酯型的产物，这个方法称为磷酸三酯法。
4 亚磷酸三酯法
以保护的亚磷酰胺单体为原料，经1H-四氮唑活化后与羟基组分连接， 先生成亚磷酸三酯，再氧化得到磷 酸三酯，称为亚磷酰胺法或亚磷酸 三酯法。
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生物化学法
• 即在体外以目的DNA片段为模扳，利用酶学 反应(Klenow酶或Taq酶)，在特异引物的引 导下，合成特异的DNA片段。 • 目前最常用的方法是PCR法。
生物化学法优缺点
优点：合成基因效率高、速度快、特异性好。随着 PCR技术的发展，现在已能合成长达几十kb的DNA 片段。
缺点：产物中可能有1／l0000-l／1000的错配率， 也就是说，PCR产物中可能存在突变体，因此，通 过PCR克隆的基因，必须通过DNA序列测定才能确 认。
复制 双链cDNA
载体 重组DNA分子 受体菌 cDNA碱水解TTTTDNA聚合酶Ⅰ
SI核酸酶
4. 聚合酶链反应（PCR）
是一种在体外利用酶促反应大量获
得特异序列的基因组DNA或cDNA的专
门技术，又称为无细胞的分子克隆。
PCR反应的基本原理
第六节 基因定点诱变
基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行 改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。 根据其特点，可将基因突变分为两大类：位点特异性突变和随 机突变。 位点特异性突变又可大体分为三种类型：一类是通过寡核苷酸 介导的基因突变；第二类是盒式突变或片段取代突变；第三类 是利用聚合酶链反应(PCR)，以双链DNA为模板进行的基因突 变。 PCR技术的出现为基因的突变，基因的剪接开辟了一条极其有 效、极其快捷的道路。当然无论哪种方法都可以在为蛋白质编 码的基因序列上产生插入、缺失、取代等突变。
一系列多肽和蛋白质基因，如胰岛素、干扰素和生长激素等 的基因相继被合成，并得到了很好的表达，使得这些原来只 能从动物组织中得到的含量不多的蛋白质能以细菌发酵的办 法大量生产。
核酸的人工合成
概念： 以核苷或单核苷酸为原料并且不依靠任何天然模板或引物，采用有机合成 反应或酶促合成反应进行的寡核苷酸或核酸大分子的合成。
全基因合成
生化合成法的基本战略
化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：
1、小片段粘接法：
根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段
混合退火
T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体
全基因合成
2、补钉延长法：
根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基
（1）作为合成基因的元件
通过寡核苷酸的合成，能构建出长达2000bp的基因的全序列
（2）作为核苷酸序列分析的引物
寡核苷酸链可以同DNA互补链杂交，因此可作为合成DNA互补链的引物
（3）作为核酸分子杂交的探针
根据蛋白质的氨基酸顺序，反推出基因编码区的可能的DNA核苷酸序列， 并据此合成出寡核苷酸混合物作探针，用以筛选特定基因
cos L 左臂
限制酶部分消化
除去中间片段
R cos 右臂
~20 Kb DNA 片段
外源DNA与载体DNA混合
cos L ~20 Kb 外源 DNA 片段 R cos
连接反应
体外包装转录酶 cDNA
AAAA
逆转录酶
AAAA TTTT
反复重复以上步骤
化学合成法优缺点
优点：准确性极高，合成速度较快 缺点：合成的寡核苷酸链长度短(不大于80个 碱基)
一般用于PCR引物、寡核苷酸探针、人工接头、 较小基因的合成。 对于超过该法合成范围的寡核苷酸链的合成， 可采用分段合成法。
5. 用寡核苷酸片段组装基因的方法
目前，化学合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150-200bp， 而绝大多数基因的大小超过了这个范围，因此，需要将寡核苷 酸适当连接组装成完整的基因 用的基因组装方法主要有两种： 第一种方法是将寡聚核苷酸激活，带上必要的5’-磷酸基 团，然后与相应的互补寡核苷酸片段退火，形成带有粘性末 端的双链寡核苷酸片段，再用个大片段。 第二种方法是将两条具有互补3’末端的长的寡核苷酸片段 彼此退火，所产生的单链DNA作为模板在大肠杆菌DNA聚合 酶Klenow片段作用下，合成出相应的互补链，所形成的双链 DNA片段，可经处理插入适当的载体上。
长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段
混合退火
Klenow酶聚合
克隆入合适的载体 T4-DNA连接酶连接
全基因合成
3、大片段酶促法：
根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段：
混合退火
Klenow酶聚合 克隆入合适的载体
T4-DNA连接酶连接
全基因合成
上述三种方法各有利弊：
生化合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于生化合 成的份额较大，成本较高； 在大片段酶促法合成目的基因时，虽然生化合成的份额 相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如， 每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单
链大片段的总收率只有7.7%
6. 寡核苷酸化学合成的实际用途
4、氧化作用
利用碘液催化作用，把核苷酸1和2间的3’-5’亚磷酸三酯键氧化为稳定的3’5’ 磷酸三酯键
反复重复以上步骤
DNA固相合成法
DNA 固相 合成 法
4,4'-二甲氧基三苯基
亚磷酰胺
二异丙基胺
DNA固相合成的原理如下：全部反应是按一个不大的固相柱子中进行的。首
先要将待活化的核苷酸上的某些游离基团保护（封闭）起来，使反应按设 计的方向进行。5‘-OH用二对甲氧三苯甲基 (DMT)保护，碱基上的氨基用
用二氯乙酸或三氯乙酸处理，脱去核苷酸1的5’-OH基团偶联的保护基团 DMT
2、偶联反应
通过弱碱-四唑的催化反应，使第二个核苷酸同已附在固相载体上的核苷 酸1的暴露5’-OH缩合。
3、封端反应
加入乙酸酐激发的乙酰化作用，把所有没有参与偶联反应的5’-OH基团全 部封闭起来
4、氧化作用
利用碘液催化作用，把核苷酸1和2间的3’-5’亚磷酸三酯键氧化为稳定的3’5’ 磷酸三酯键
第五节 基因的化学合成
1 基因化学合成的概况
随着基因工程的发展，需要定向地修改、设计生物基因组，
快速合成DNA片段的方法显得十分重要。
1957～1965年H.G.科拉纳等人设计并合成了由一种、两种 或 3种脱氧核苷酸组成的重复顺序的脱氧寡核苷酸片段， 并以此为模板用DNA聚合酶和RNA聚合酶进一步复制和转 录，得到了具有对应的互补顺序的长链人工信使核糖核酸 (mRNA)，再用这种人工mRNA在无细胞体系中进行蛋白 质合成。通过分析这样得到的多肽产物的氨基酸顺序和与 模板中核苷酸顺序的对应关系破译了遗传密码。
3 磷酸三酯法
改进的办法之一是采用适当的保护基把磷酸上的OH基团也保 护起来，再进行连接反应。即如图4 所表示的那样，用甲核苷 3′-磷酸二酯（用R5保护磷酸上的OH基团）同乙核苷的5′-羟基 反应生成磷酸三酯型的产物，这个方法称为磷酸三酯法。
4 亚磷酸三酯法
以保护的亚磷酰胺单体为原料，经1H-四氮唑活化后与羟基组分连接， 先生成亚磷酸三酯，再氧化得到磷 酸三酯，称为亚磷酰胺法或亚磷酸 三酯法。
2 磷酸二酯法
基本原理是将一个5’端带有适当保护基的脱氧单核苷酸与 另一个3’端带有适当保护基的脱氧单核苷酸偶联起来，形成 一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸分子。
由于以上反应是通过磷酸单酯和羟基缩合生成3′-5′磷酸二酯， 故称为磷酸二酯（合成）法。
能合成长达200bp的寡核苷酸片段 但在磷酸二酯法中，由于产物为磷酸二酯，磷酸上所剩下的 OH基团，虽然化学活性较小,但也能发生反应,因此,当合成的 寡核苷酸链逐渐增长时,由这个磷酸OH基团所带来的副反应也 愈益严重，使合成产率急剧下降，目前这个方法已基本上被 淘汰。
化学合成 以核苷或单核苷酸为原料，完全用有机化学方 法来合成核酸。由于核苷酸是一个多官能团的化合物，因 此,在化学合成中,必须将不希望发生反应的基团保护起来。
酶促合成 通过酶促反应可以把化学合成的小片段连接成 为大片段，或是从已经合成的单链制成双链，它可以加快 合成工作的进展，使人工合成核酸大分子的目标得以顺利 地实现。 大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶是两种经 常使用的DNA连接酶。
（4）用于基因定点诱变研究
体外化学合成一段带有预定突变序列的寡核苷酸片段
（5）作为PCR扩增反应的引物
20个核苷酸左右的PCR寡核苷酸引物
（6）作为重组DNA连接构件
制备重组DNA过程中常用到的连接构件衔接物和接头
DNA合成仪
设计用于合成结构上类似DNA或RNA的寡核苷酸的自动化仪器。 一般应用于固相合成法，每次将一个核苷酸加到所接长的寡核苷酸链上， 加入每一个核苷酸都利用相同的化学反应与相应的嘌呤或嘧啶碱基衍生物 作用。 所用化学反应和操作细节随不同的仪器而改变，最广泛应用的方法是DNA 合成的磷酸酰胺法。
在基因的化学合成中，首先要合成出有一定长度的、具有特定序列 结构的寡核苷酸片段，然后再通过DNA连接酶的作用，使他们按 照一定的顺序共价连接起来。 干扰素基因就采用此方法合成。
磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法，及在后二者基础上发展 起来的固相合成法和自动化法。
核酸合成包括化学合成和酶促合成两个方面
4 固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸
在磷酸三酯法和亚磷酸三酯法基础上发展起来的固相合成法,其 基本原理是将要合成的寡核苷酸链的3′末端核苷先固定在一个不 溶性的高分子上面，然后再从此末端核苷开始，逐步接长，接 长的链始终被固定在载体上，过量的未反应物和分解产物则通 过过滤或洗涤除去，每接长一个经历一次循环。当整个链的增 长达到所需要的长度后，再将寡核苷酸链从固相载体上切落下 来并脱去保护基，经过分离纯化得到所需要的最后产物。 固相合成不仅可以缩短合成的时间,提高总产率,并且由于每一个 缩合循环都经过同样的操作步骤，因此可以采用自动控制手段。 目前已经设计出多种型号的全自动或半自动的合成机器，其每 一次的连接产率达到97～99％，最快的每轮循环不到10分钟， 最长的合成片段可到100核苷酸以上。