(修改版)琼脂糖电泳检测LDH同工酶
电泳技术在医学中的应用
电泳技术在医学中的应用电泳技术在医学中的应用电泳技术在医学中的应用自从1946年瑞典物理化学家Tiselius教授研制的第一台商品化移界电泳系统问世以来,在近半个多世纪的时间里,电泳技术发展极其迅速。
基于电泳原理的各种仪器设备不断问世,特别是20世纪80年代后, 许多自动化电泳仪器相继为临床实验室所采用,电泳技术已成为基础医学和临床医学研究的重要工具之一。
目前,该技术已广泛用于蛋白质、多肽、氨基酸、核苷酸、有机物、无机离子等的分离和鉴定,甚至病毒与细胞的研究。
特别是电泳所用支持介质由流动相改为固相支持物后,各种各样的电泳分析装置不断推出以适应不同教学、临床和科研工作的需要。
当今,电泳技术与质谱技术联用在后基因组学研究中,正发挥者着巨大的作用,为临床检验的发展带来新的生机与活力。
一、电泳分析仪电泳分析仪可分为两大类:临床实验室常规类,如全自动荧光/可见光双系统电泳仪、全自动醋纤膜电泳仪、全自动琼脂糖电泳仪和全自动琼脂糖电泳仪;科研为主兼做临床样本类,如双向电泳及双向电泳2液相色谱2质谱联用、高效毛细管电泳及高效毛细管电泳2质谱联用、高效毛细管芯片电泳、DNA测序系统。
1. 全自动荧光/可见光双系统电泳仪:具有荧光/可见光双系统,在使用荧光试剂项目如肌酸激酶(CK) 、乳酸脱氢酶(LD)同工酶时为全自动。
只需将样品、试剂、琼脂糖凝胶电泳胶片放好后,操作人员可离机完成试验并得到结果,此为全自动电泳仪。
但是使用可见光项目如蛋白电泳,中途人员需返回,将电泳胶片由电泳槽放入染色系统中才可完成试验。
而最大优点是荧光系统全自动且灵敏度高,准确度高并且采用高压、低温系统,只需要20 min即可完成电泳分析,速度非常快。
2. 全自动醋纤膜电泳仪:为可见光单系统,使用醋纤膜电泳片。
自动化程度高,只需将样品、试剂、电泳片放好,人员可离机完成试验得到结果。
但是因为使用醋纤膜致使灵敏度低,无法分析尿蛋白/脑脊液蛋白,对同工酶分析效果也不理想,多半实验室只用于血清蛋白电泳分析。
乳酸脱氢酶
乳酸脱氢酶之吉白夕凡创作乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶。
乳酸脱氢酶存在于机体所有组织细胞的胞质内，其中以肾脏含量较高。
乳酸脱氢酶是能催化丙酮酸生成乳酸的酶，几乎存在于所有组织中。
同工酶有六种种形式，即LDH-1(H4)、LDH-2(H3M)、LDH-3(H2M2)、LDH-4(HM3)、LDH-5(M4)及LDH-C4，可用电泳方法将其分离。
LDH同功酶的分布有明显的组织特异性，所以可以根据其组织特异性来协用诊断疾病。
正凡人血清中LDH2，〉LDH1。
如有心肌酶释放入血则LDH1〉LDH2，利用此指标可以观察诊断心肌疾病。
基本信息英文名称: LDH(lactate dehydrogenase)序列信息:1 gsgcnldsar frylmg长度:16 aa{物种来源:Homo sapiens (human)}正常范围:血清135.0~215.0U/L;脑脊液含量为血清的1/10。
乳酸脱氢酶A简介乳酸脱氢酶(LDH)分子量为130~140KDa，由两种亚单位组成:H(暗示heart)和M(暗示muscle)。
它们按分歧的形式排列组合形成含4个亚基的5种同工酶，即:LDH1(H4)、LDH2(H3M1)、LDH3(H2M2)、LDH4(HM3)、LDH5(M4)。
LDH催化丙酮酸与乳酸之间还原与氧化反应，在碱性条件下促进lactic acid向pyruvic acid方向的反应，而在中性条件下促进pyruvic acid向lactic acid的转化(为逆反应)。
LDH是介入糖无氧酵解和糖异生的重要酶。
由于LDH几乎存在于所有体细胞中，而且在人体组织中的活性普遍很高，所以血清中LDH的增高对任何单一组织或器官都是非特异的。
在AMI时升高迟、达峰晚，故对早期诊断价值不大。
由于半寿期长(10~163小时)，多用于回顾性诊断，如对入院较晚的AMI病人、亚急性MI的诊断和病情监测。
LDH在组织中的分布特点是心、肾以LDH1为主，LDH2次之;肺以LDH3.LDH4为主;骨骼肌以LDH5为主;肝以LDH5为主，LDH4次之。
实验7 琼脂糖凝胶电泳法测定血清乳酸脱氢酶同工酶
（4）恶性贫血 溶血性疾病、幼红细胞贫血症LD活性极度 升高，伴有LD1明显升高，LD1＞LD2。
（5）骨骼肌损伤时LD4和LD5可发生增高。
[注意事项]
1．红细胞中LD1、LD2活性很高，因此必须避免标本溶血。 2．LD4与LD5对热很敏感，因此底物-显色液的温度不能过
6．区带观察 观察显色的区带情况（数目、深浅等）。 7．定量 将各区带切开，分别装入试管中，加入400g/L尿素
4ml，于沸水浴中加温5min，取出冷却后以 575nm波长比色。 空白管取大小相同但无同工酶区带的凝胶，用上述相同的方 法处理。比色后根据各管吸光度值计算各同工酶的百分含量。
[计算]
A总＝A1+A2+A3+A4+A5 式中，A1～A5为各同工酶区带的吸光度。 各同工酶百分率（%）为：
实验7 琼脂糖凝胶电泳法分离（测定） 血清乳酸脱氢酶同工酶
[原理]
乳酸脱氢酶（LD）广泛存在于人体各组织细胞中，以 肾、心肌、肌肉、肝、红细胞含量最多。LD是由两种不同 亚基（M和H）组成的四聚体，共有5种同工酶形式，按电 泳的快慢命名为LD1、LD2、LD3、LD4和LD5。
5种同工酶大体可分为三大类：第一类以LD1为主，主 要存在于心肌，含量最多，可占总LD的50%左右；第二类 以 LD5 为 主 ， 以 横 纹 肌 为 代 表 ， 肝 脏 中 也 有 ； 第 三 类 以 LD3为主，存在于脾、肺。各组织LD同工酶的类型、含量 均有所差异。LD同工酶的测定相对于总活性的测定更具有 组织器官特异性，灵敏度也更高。
高（<50℃），否则易使其变性失活，不能显色。 3．LD4和LD5对冷不稳定，易发生失活，故最好采用新鲜标
自制超薄型琼脂糖凝胶板电泳分离检测血清LDH同工酶及成年人参考范围的建立
自制超薄型琼脂糖凝胶板电泳分离检测血清LDH同工酶及成年人参考范围的建立申春艳;陆桂琴;于嘉屏【摘要】目的自制超薄型琼脂糖凝胶板,建立电泳分离检测血清乳酸脱氢酶(LDH)同工酶的方法并建立成人血清的参考区间.方法用自制琼脂糖凝胶板分离检测LDH 同工酶,对方法学性能包括精密度、正确度、线性范围、参考区间进行确认和建立.结果 5种LDH同工酶图谱分离清晰,批内CV值均小于8.77％,批间CV值均小于13.12％,胶板间CV值均小于7.89％.IDH1在13.48～287.65U/L,IDH2在18.19～575.67U/L,LDH3在19.42～504.62U/L,LDH4在8.00～342.27U/L和LDH5在13.88～199.79U/L的范围内呈线性,斜率趋近于1.与Sebia配套电泳试剂盒的结果比较,5种同工酶在两方法间的差异无统计学意义(t=0.028 1～0.567 4,均P＞0.05),相关系数r=0.949 4～0.985 5.建立的成人参考区间为LDH1:15.7％～34.3％,LDH2:26.8％～38.9％,LDH3:18.8％～28.1％,LDH4:5.7％～13.7％和LDH5:2.7％～15.3％.结论自制超薄型琼脂糖凝胶板电泳分离检测血清LDH同工酶的方法性能良好,可用于临床检测.【期刊名称】《现代检验医学杂志》【年(卷),期】2019(034)004【总页数】4页(P83-86)【关键词】琼脂糖凝胶电泳;乳酸脱氢酶同工酶;分离检测【作者】申春艳;陆桂琴;于嘉屏【作者单位】上海迪安医学检验所中心实验室,上海 200433;上海迪安医学检验所中心实验室,上海 200433;上海迪安医学检验所中心实验室,上海 200433【正文语种】中文【中图分类】R446.112血清中的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)是以同工酶形式存在的，包括LDH1～5的5种同工酶[1]。
实验六.LDH同工酶的电泳分离.ppt
2. 显色：电泳终止前10 min，将凝胶缓冲液：显 色液：0.5 M 乳酸钠溶液=67:53 :20(V:V:V)的比例 配置染色液。
电泳结束后，取出载玻片，放入培养皿中。
在载玻片上滴上染色液，覆盖凝胶表面，37℃ 避光反应30 min，取出后仔细观察。
点样孔(样品端接 负极)
-
LDH 5 1.4%
量少肉眼观察不到
LDH 4 3.9%
LDH 3 18.5%
LDH 2 42.8%
LDH 1 33.4%
溴酚蓝电 泳指示剂
+
心 35~70 28~45 2~16 0~6 0~5
肝
0~8
2~10
3~33 6~27 30~8
骨骼肌 1~10 4~18
8~38 9~36 40~97
正常血清 27.1±2.8 34.7 ± 4.3 20.9 ± 2.4 11.7 ± 3.3 5.7 ± 2.9
a
2
12
b
酶活性 酶活性
3
1 4 5
乳酸脱氢酶(LDH1～ LDH5)
HH HH
LDH1 (H4)
HH HM
HH MM
HM MM
LDH2 (H3M)
LDH3 (H2M2)
LDH4 (HM3)
乳酸脱氢酶的同工酶
MM MM
LDH5 (M4)
人体心,肝和骨骼肌LDH同工酶谱
组织器官 LDH1 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5
（ 占总 LDH活性的百分比）
心肌梗死酶谱
正常酶谱 肝病酶谱
12 3 4 5
心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化
CH3
H3C
H
琼脂糖电泳法测定精浆乳酸脱氨酶同工酶
琼脂糖电泳法测定精浆乳酸脱氨酶同工酶
石玉玲;杨艺
【期刊名称】《华南国防医学杂志》
【年(卷),期】2000()1
【摘要】乳酸脱氢酶(LDH)由四个多肽单链亚单位构成，由于LDH分子中M、H、X亚基的一级结构氨基酸组成不同，其理化带外，还存在特异的LDH。
区带，LDHx区带主要存在于睾丸精母细胞及精子、精浆中。
LDH。
是精于糖代谢所必须的酶，由于LDHx对于睾丸组织和精子细胞具有组织特异性，因此测定lDHx对于探讨不育症的发病机制及临床诊断有一定意义。
本文测定31例20—22岁健康男性及2例结婚5年以上不育患者精浆中的LDH同工酶，方法与结果报告如下：【总页数】2页(P55-56)
【关键词】精浆;区带;LDH;同工酶
【作者】石玉玲;杨艺
【作者单位】驻香港部队医院检验科
【正文语种】中文
【中图分类】R
【相关文献】
1.琼脂糖电泳法测定精浆乳酸脱氢酶同工酶 [J], 石玉玲;杨艺
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同工酶实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 理解同工酶的概念及其在生物体中的生物学意义；2. 掌握同工酶电泳技术的基本原理和方法；3. 通过同工酶电泳实验，观察和分析同工酶在样品中的分布情况。
二、实验原理同工酶是指具有相同催化功能，但氨基酸序列和分子结构不同的酶。
同工酶电泳技术是一种分离和鉴定同工酶的方法，其原理是利用同工酶在电场中的迁移速率差异，将其分离。
三、实验材料1. 实验样品：植物叶片、动物组织等；2. 电泳试剂：琼脂糖、溴酚蓝、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等；3. 电泳仪器：电泳槽、电泳仪、凝胶成像系统等；4. 其他：移液器、吸管、剪刀、镊子等。
四、实验方法1. 样品制备：将实验样品研磨，加入适量提取液（如Tris-HCl缓冲液），在冰浴中匀浆，离心取上清液；2. 电泳凝胶制备：按照电泳试剂的配方，制备琼脂糖凝胶；3. 电泳样品制备：将提取液加入适量的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，混合均匀后，加入适量的样品，制成样品胶；4. 电泳：将制备好的样品胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，接通电源，进行电泳；5. 成像与分析：电泳结束后，取出凝胶，用凝胶成像系统拍照，分析同工酶的分布情况。
五、实验结果1. 通过电泳实验，观察到样品中存在多种同工酶；2. 不同样品的同工酶分布情况存在差异，说明同工酶在生物体中具有特异性；3. 同工酶的迁移速率与酶的分子量有关，分子量较小的酶迁移速率较快。
六、实验结论1. 同工酶在生物体中具有重要作用，其生物学意义包括催化、调控、信号传递等；2. 同工酶电泳技术是一种有效的分离和鉴定同工酶的方法；3. 本实验成功分离和鉴定了样品中的同工酶，为后续研究提供了基础。
七、实验讨论1. 实验过程中，样品制备和电泳操作应注意无菌操作，以避免污染；2. 电泳条件的选择对同工酶的分离效果有较大影响，应根据实验目的和样品特点进行优化；3. 同工酶的研究有助于揭示生物体的遗传、变异和进化规律。
八、实验总结本实验通过同工酶电泳技术，成功分离和鉴定了样品中的同工酶，验证了同工酶在生物体中的生物学意义。
血清LDH及同工酶检测
血清LDH及同工酶检测LDH作用乳酸脱氢酶lactate dehydrogenase LD或LDH在辅酶INAD为氢受体时催化L-乳酸为丙酮酸 L-乳酸丙酮酸NAD NADHH1 方法 1 分光光度法 1利用顺向反应pH 88-98340nm处连续观察NADH的产生速度 2利用逆向反应pH 74-78340nm处连续观察NADH的消失速度分光光度法能利用顺逆双相反应线性范围较广但要求保持测定体系于最适温度下否则会影响测定的准确性 2 比色法测定LD总活性1 原理乳酸脱氢酶LD 乳酸丙酮酸丙酮酸 24-二硝基苯肼丙酮酸-二硝基苯腙碱性溶液中呈棕红色颜色的深浅与丙酮酸的浓度呈正比 2 试剂基质缓冲液pH 88 NAD溶液113mmolL 丙酮酸标准液05mmolL 24-二硝基苯肼溶液1mmolL 氢氧化钠溶液04mmolL 单位定义以100ml血清37℃与基质作用15min生成1umol丙酮酸为一个金氏单位参考值血清LD190-437金氏单位 3 操作步骤1 LD活性测定加入物对照管测定管血清- 005 基质缓冲液05 05 混匀放37°C水浴5min NAD溶液 - 01 混匀放37°C水浴15min 24-二硝基苯肼溶液 05 05NAD溶液 01 - 混匀放37°C水浴15min 04molLNaOH 50 50 ※室温放置5min进行比色波长440nm 2 LD校正曲线制作加入物ml B 1 2 34 丙酮酸标准液 0 005 01 015 020 基质缓冲液 05 045040 035 030 蒸馏水 015 015 015 015 015 24二硝基苯肼05 05 05 05 05 混匀放37°C水浴15min 04molLNaOH50 50 50 50 50 LD活性单位 0 250 500 750 1000临床意义①心肌损害心肌梗塞充血性心衰心肌炎②肝脏疾病病毒性肝炎肝硬化原发性肝癌③其它骨骼肌的损伤恶性肿瘤白血病淋巴瘤等肺梗塞等注意事项①标本不能溶血也不能用草酸盐抗凝血②由于LD4LD5对冷不稳定不宜冰箱存放血清标本在室温下可稳定2-3天 LD同工酶的测定人体某些组织中LDH同工酶电泳图谱二测定方法柱层析法免疫化学法热稳定性和抑制法电泳法原理根据LD同工酶一级结构和等电点的差异在一定电泳条件下使LD在支持物上被分离乳酸脱氢酶LD 乳酸丙酮酸 NADH 氧化型PMS 还原型PMS NAD 还原型PMS 四氮唑盐类氧化型PMS 甲臢当有LD活性的区带存在即显紫红色颜色深浅与酶活性成正比借助于扫描仪或光密度仪可进一步求出相对含量试剂巴比妥缓冲液pH 86 巴比妥盐酸缓冲液0082molL pH 82 EDTA-Na2溶液10mmolL 缓冲琼脂糖凝胶8gL和 5gL 底物显色液和固定漂洗液 3操作①凝胶板制备②加样③电泳④显色⑤固定和漂洗 4计算A总吸光度总和 A1 A2 A3 A4 A5 A1A5 相应为LD同工酶LD1LD5的吸光度 LD同工酶的百分比为 LD1 A 1 A总× 100 LD2 A 2 A总× 100 LD3A 3 A总× 100 LD4 A 4 A总× 100 LD5 A5 A总× 100 临床意义①心脏疾病心肌梗塞 LD1 ＞ LD2 充血性心衰心肌炎 LD1 ＞ LD2 ②肝脏疾病病毒性肝炎 LD5 ＞LD4 肝硬化原发性肝癌 LD5↑↑LD5＞LD4 ③恶性肿瘤白血病结肠癌等 LD3↑LD3＞LD1 ④肌肉疾病肌肉损伤肌萎缩 LD5↑注意事项①不宜用溶血标本②严格控制温度LD4和LD5特别是LD5对热敏感如底物显色液温度超过50℃LD5易失活③底物显色液需避光保存因PMS对光敏感否则显色后的凝胶板背景颜色深而影响结果④LD同工酶对冷的敏感性不同尤其是LD5对冷不稳定因此血清标本应该放室温保存分布骨骼肌心肌脑组织平滑肌胃肠道子宫在肝及红细胞中测不到CK的活性ADP 磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶丙酮酸 ATP 丙酮酸-24-二硝基苯腙实验操作加入物B S U 血清- - 01 标准- 01 - 1mmolL200UL H2O 01 - - 酶试剂 05 05 05 37℃ 15min DNP O5 05 05 37℃ 15min NaOH 4 4 4 室温 5min 440nm比色临床意义 1引起血清CK活性升高的疾病 1心脏疾病急性心肌梗塞病毒性心肌炎心外膜炎 2肌性疾病进行性肌营养不良多发性肌炎皮肌炎肌萎缩 3中枢神经系统疾病脑血管意外脑膜炎颅脑外伤 4肺疾病肺栓塞等 2引起血清CK活性降低的疾病较少甲状腺功能亢进全身性红斑狼疮严重感染败血症等 7注意事项1本实验的许多试剂都易失效故最好在每次实验前临时配制 2肌酸呈色不稳定振荡充分与否直接影响呈色的深浅及过程用旋涡混合器充分振荡15s37℃水浴5min后颜色可达最高点并持续30min以上 1 电泳法测定CK-MB• 琼脂糖介质醋酸纤维素薄膜酶定位 CK-BB —白蛋白区 CK-MB —α2 ～β区CK-MM —γ区 CK-Mt —γ后参考值 CK-BB 0CK-MB 0 ～ 3CK-MM 97 ～ 100CK-Mt 0CK-MB 阳性决定水平为5试剂 150mmolL Tis-巴比妥缓冲液pH 80 230mmolL Tis-巴比妥缓冲液pH 8635gL 琼脂糖 4400mmolL Bis-Tis缓冲液pH 70 5辅酶溶液 6底物显色液 7混合底物显色液操作 1制备凝胶玻片 2加样 3电泳 4显色 5固定和漂洗 6观察结果参考值 1CK-BB 0 2CK-MB 0 3 3CK-MM 97 100 4CK-Mt 0 引起CK-BB升高的疾病急性颅脑外伤脑血管疾病急性细菌性脑膜炎引起CK-BM升高的疾病急性心肌梗塞心肌炎进行性肌营养不良注意事项1电泳需较高的pH值酶反应需较低pH 2CK不稳定对光热及高pH敏感最好将及时分出的血清充CO2后塞紧管口置冰室或-30℃保存至少可稳定半个月及时测定效果更好 3血清CK活性随温度升高而升高直至45℃更高温度时CK活性迅速下降56℃很快失活琼脂糖电泳法测CK同工酶时决不能像作LD同工酶用温度较高的琼脂糖底物显色液否则CK活性丧失而非脱氢酶NDH反应显著心肌梗死诊断的实验室指标的特性－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－实验室分子量生理半衰期升高时间峰值时间恢复正常时间指标 KD h h h d －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－CK 86 17 312 1224 34 CK-MB活性86 13 312 122423 CK-MB质量 86 13 26 12243 早期急性心肌梗死的诊断灵敏度－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－胸痛后时间 h 指标原理CK分子是由M和B两种亚单位组成的二聚体在细胞质内存在三种CK同工酶CK-BB 脑型CK-MM 肌型CK-BM 混合型CK-Mt线粒体内。
LDH
1
一、目的要求
学习和掌握琼脂糖凝胶电泳分离乳酸脱氢酶 同工酶的原理和方法
2
二、实验原理
琼脂糖凝胶分离各组分后，用活性染色鉴定 琼脂糖凝胶分离各组分后，
3
1、关于乳酸脱氢酶 、
1959年Markert等用电泳的方法将纯化的心肌乳酸脱 年 等用电泳的方法将纯化的心肌乳酸脱 氢酶(LDH)分离出 条区带，由阳极到阴极依次命名为 分离出5条区带 氢酶 分离出 条区带，由阳极到阴极依次命名为LDH1、 LDH2、LDH3、LDH4、LDH5，它们均具有 它们均具有LDH催化活性， 催化活性， 催化活性 同工酶的概念 同工酶是由H 从而首先提出了同工酶的概念。目前已知LDH同工酶是由 同工酶是由 从而首先提出了同工酶的概念。目前已知 亚基按不同比例组成的四聚体。 和M亚基按不同比例组成的四聚体。 亚基按不同比例组成的四聚体
14
4
1、关于乳酸脱氢酶 、
LDH升高而且 升高而且LDH1>LDH2，可见于心肌损 升高而且 ， 急性心肌梗塞、心肌病、溶血性贫血、 伤、急性心肌梗塞、心肌病、溶血性贫血、 恶性贫血、肺栓塞等。 恶性贫血、肺栓塞等。 LDH5升高而且 升高而且LDH5>LDH4，可见于肝硬化、 升高而且 ，可见于肝硬化、 肝癌、急性肝炎、肌炎、骨骼肌损伤。 肝癌、急性肝炎、肌炎、骨骼肌损伤。 LDH5>LDH4都升高以 都升高以LDH4更明显，可见于 更明显， 都升高以 更明显 阻塞性黄疸。 阻塞性黄疸。
LDH同工酶广泛存在于动植物及微生物中，动物各组织中LDH 同工酶广泛存在于动植物及微生物中，动物各组织中 同工酶广泛存在于动植物及微生物中 同工酶各组分含量不同。临床上对LDH及同工酶的检测可作 同工酶各组分含量不同。临床上对 及同工酶的检测可作 为某些疾病诊断的依据之一。 为某些疾病诊断的依据之一。
血清LDH同工酶测定
同工酶的应用
是否人种间在差异呢？这个答案不 得而知，但有一点是明确的，那就是LDH同
工酶在人体不同器官和组织间是有差异的，
从医学角度来讲，利用这种特异性临床上对
LDH同工酶的检测可作为某些疾病诊断的依据
之一。
南昌大学医学院
同工酶的应用
在临床检验方面，通过观测病人血清中LDH同
工酶的电泳图谱，辅助诊断哪些器官组织发生病变 ，远较单纯测定血清LDH总活性的方法敏感。例 如，心肌受损病人血清LDH1含量上升，肝细胞受 损者血清LDH5含量增高。
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6、图谱分析-1
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6、图谱分析-1
正常： LDH2>LDH1>LDH3>LDH4>LDH5
参考值(琼脂糖电泳法)：
LDH1（28.4〒5.3）%； LDH2（41.0〒5.0）%； LDH3（19.0〒4.0）%； LDH4（6.6〒3.5）%； LDH5（4.6〒3.0）%。
LDH4活性极高时，常示预后不良；原发性肝癌以血清LDH4＞LDH5较为常见
，阻塞性黄疸时LDH4 与LDH5 均增高，但以LDH4 尤为明显。
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6、图谱分析-3
文献：血清乳酸脱氢酶同工酶在肝脏疾病中的检测及意义 摘要:目的 探讨血清乳酸脱氢酶同工酶检测在肝脏疾病中的临床意义。方法 LDH 同工酶测定采用琼脂糖电泳法，统计学处理采用t检验。结果 LDH1在急性肝炎
LDH同工酶广泛存在于动植物及微生物中，动物
各组织中LDH同工酶各组分含量不同，具有明显
的物种间差异可作为动物分类的生化依据。
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同工酶的应用
文献：鲿科四种鱼LDH同工酶谱的研究 【摘要】：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对鲿科四种 鱼血清中LDH同工酶进行电泳分析,结果表明:四种鱼 血清LDH同工酶图谱的区带分布具有种的特异性;四 种鱼血清LDH同工酶A、B亚基比例关系反映的各品种 间亲缘的关系与形态学特征分析结果吻合,为鲿科四 种鱼分类提供进一步的理论依据.
实验23 琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶 - 副本
4. 胃癌、结肠癌和胰腺癌患者血清中五种LD同工酶均可升 高，但以LD3增高最为显著。骨骼肌损伤时LD4和LD5增 高。
注意事项
1．严禁溶血。
2．LD4与LD5（尤其是LD5）对热很敏感，因此底 物-显色液的温度不能超过50℃，否则易使LD5等 变性失活。
2．光密度计扫描 用光密度计在570nm波长下扫 描，求出各同工酶区带吸光度所占百分比。
结果观察
3．在不具备光密度仪扫描条件下，如果需要进行定量， 可将各区带切开，分别装入试管中，加入400 g/L尿 素 4ml，于沸水浴中加温5 min～10min，取出冷却后 以570nm波长比色。 空白管则取大小相同但无同工酶区带的凝胶，用 上述相同的方法处理。
操作步骤
1．制备琼脂糖凝胶玻片 2．加样 用微量加样器加约40μl血清于槽内。 3．电泳 电压75V～100V，电泳30min～40min。 4．显色 5．固定和漂洗
结果观察
1．目视观察 在碱性介质中，LD同工酶电泳条带 由正极到负极依次为：LD1、LD2、LD3、LD4 和LD5。按各区带呈色的深浅，比较LD各同工酶 区带呈色强度的关系。
3．LD同工酶琼脂糖电泳测定的原理是什么？在电 泳中应注意哪些事项？
3．LD4和LD5对冷不稳定，容易失活，应采用新鲜 标本测定。如果需要，血清应放置于25℃条件下 保存，一般可保存2d～3d。
4．PMS对光敏感，故底物显色液需避光保存，否则 显色后凝胶板背景颜色较深。
思考题
1．LD同工酶测定时为什么要严禁溶血？为何测定 LD的血清标本不能冰冻或冷藏？
2．LD同工酶测定对疾病诊断的临床意义为何优于 LD总活性测定？
淀粉酶同工酶琼脂糖电泳测定法
淀粉酶同工酶琼脂糖电泳测定法
淀粉酶是一种催化淀粉分解为小分子糖的酶类。
同工酶是指在同一物种中，某种酶的同源蛋白由于基因突变后结构变化，而使得酶的催化能力和电泳迁移率发生变化，从而在电泳时出现不同的带型。
琼脂糖电泳是一种典型的酶法，通过在琼脂糖凝胶上的电泳分离不同的酶同工酶带，可以对不同的酶同工酶进行检测和测定。
淀粉酶同工酶琼脂糖电泳测定法是利用琼脂糖电泳技术，根据淀粉酶的同工酶在琼脂糖凝胶上的迁移率的异同来检测和测定淀粉酶的同工酶，从而分析淀粉酶同工酶的差异性和分布情况。
这种测定法可以在较短时间内，同时测定多个样品的淀粉酶同工酶，具有简便、快速、可重复性好等优点，被广泛应用于淀粉酶同工酶的分析与研究中。
实验八 乳酸脱氢酶
实验八乳酸脱氢酶（LDH）同工酶的琼脂糖凝胶电泳一、实验目的了解琼脂糖凝胶电泳的方法和原理，学会分离LDH同工酶的方法。
二、原理同工酶是指能够催化相同的化学反应，但酶分子的结构理化特性乃至免疫学性质不同的一组酶，同工酶这种差异是由于酶蛋白的编码基因不同或基因相同但转录、翻译或后加工有别所造成的。
同工酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织，甚至同一组织或细胞的不同亚细胞结构中。
人们已发现几百种同工酶。
乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase LDH）是人们认识的第一个同工酶。
LDH是糖酉孝解中的一个酶，它催化的反应如下。
COOH COOHHO—C—H+NAD＋C＝O＋NADH＋H+CH3 CH3LDH有五种同工酶，分子量在13万～15万之间，由四个亚基组成。
LDH的亚基有两种类型，一种是心肌型亚基（H型）（B基因），另一种是骨骼肌型亚基（M型）（A基因）。
两类亚基以不同比例可组成五种四聚体。
即LDH1(H4)、LDH2(H3M1)、LDH3(H2M2)、LDH4(H1M3)、LDH5(M4)。
H型亚基与M型亚基的氨基酸组成有差异，前者含酸性氨基酸残基多，故LDH可用电泳的方法进行分离。
本实验用pH8.6的缓冲液，在此条件下电泳，LDH的五种同工酶均净带负电荷，向正极泳动，但LDH1最快，依次减慢，LDH5最慢。
在哺乳动物体内，一般厌氧性组织中，如骨骼肌、肝脏中，LDH5含量高；在非厌氧性组织中，如心、脑中，LDH1含量高。
本实验用琼脂糖凝胶，LDH的五种同工酶在琼脂糖凝胶板上分离后，进行酶促反应，使乳酸脱氢生成NADH，NADH将人工递氢体PMS还原，还原型PMS 最终将NBT还原。
NADH++H++PMS=====NAD++PMSH2PMSH2＋NBT======PMS＋NBTH2NBTH2为蓝色化合物。
三、实验器材（一）、仪器1、电泳仪1、水平电泳槽2、离心机3、玻璃匀浆器5、恒温箱6、微量移液器7、吸量管四、材料与试剂1、小白鼠（成年）2、白瓷盘3、剪子4、镊子5、载玻片6、滤纸7、生理盐水8、0.01mol/l pH7.4磷酸钠缓冲液：取0.01mol/L NaH2PO419ml和0.01mol/L Na2HPO481ml混合即可。
宫颈粘液中乳酸脱氢酶同工酶的测定及意义
宫颈粘液中乳酸脱氢酶同工酶的测定及意义汤洁;张宁;郑玲;鲁海鸥;唐轶【期刊名称】《沈阳医学》【年(卷),期】2000(020)002【摘要】目的：确定宫颈粘液中乳酸脱氢酶(LDH)同工酶的测定方法，考查其在正常月经周期期间的变化、意义；方法：采用琼脂糖凝胶电泳法分离LDH同工酶，对分离区带在570nm处进行扫描，从而计算出各组分的百分含量的方法；结果：整个月经周期中M-LDH于17天左右出现最高峰，平均值为57．57％±6．58％；H-LDH于11天左右出现最高峰，均值为18．06％±3．40％；结论：琼脂糖凝胶电泳分离宫颈粘液中LDH同工酶具有好的重复性。
该方法简便、重复性好，适用于实验室中宫颈粘液LDH同工酶的测定。
且月经周期期间宫颈粘液LDH同工酶变化具有一定意义。
【总页数】3页(P55-57)【作者】汤洁;张宁;郑玲;鲁海鸥;唐轶【作者单位】沈阳军区202医院110003【正文语种】中文【中图分类】R711【相关文献】1.乳酸脱氢酶同工酶LD1/LD2比值测定在急性心肌梗塞诊断中的意义 [J], 王志2.正常月经周期和早孕期间宫颈粘液中乳酸脱氢酶同工酶的变化规律及其意义 [J],汤洁;张宁;郑玲;王大军;鲁海鸥;张敏;王梦醒3.婴幼儿急性支气管肺炎患儿血清乳酸脱氢酶同工酶测定及其临床意义 [J], 王弘;赵诗萌;白雪梅;刘春峰;蒋英姿4.中枢神经系统疾病脑脊液中乳酸脱氢酶同工酶测定的临床意义 [J], 段志玲;范秀芹5.宫颈粘液中乳酸脱氢酶同工酶在月经周期和早孕期的变化及意义 [J], 汤洁;张宁;郑玲;王梦醒;鲁海鸥;张敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
改良琼脂糖凝胶电泳法测定血清LDH同工酶的应用
改良琼脂糖凝胶电泳法测定血清LDH同工酶的应用
王守训;黄焕生;孙凤祥;李桂芝
【期刊名称】《潍坊医学院学报》
【年(卷),期】2001(23)3
【摘要】目的寻求更加准确、简便、快速、实用的乳酸脱氢酶同工酶 (LDH)测定方法。
方法据LDH同工酶等电点不同 ,选择琼脂糖凝胶作支持物 ,对以往LDH 同工酶测定方法进行改进 ,将五型LDH同工酶进行分离并定量测定。
结果改进后的LDH同工酶测定方法稳定 ,区带清晰 ,重复性好 ,结果可靠 ,试剂可长期保存。
结论改良琼脂糖凝胶电泳法测定血清LDH同工酶应用前景良好。
【总页数】2页(P177-178)
【关键词】乳酸脱氢酶同工酶;琼脂糖凝胶电泳;应用
【作者】王守训;黄焕生;孙凤祥;李桂芝
【作者单位】潍坊医学院生化教研室;潍坊医学院化学分析实验室
【正文语种】中文
【中图分类】R446.112
【相关文献】
1.血清α-醋酸萘酯酶同工酶琼脂糖凝胶电泳法及临床应用 [J], 黄志华
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华
5.琼脂糖凝胶电泳法测定王杂鸽血清乳酸脱氢酶同工酶的研究 [J], 沈秋姑;田向荣;王兴金;龙学燃
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电泳法检测肝和血清中醇脱氢酶同工酶
电泳法检测肝和血清中醇脱氢酶同工酶宓庆梅;曹鲁宁;高春芳【期刊名称】《世界华人消化杂志》【年(卷),期】2003(11)8【摘要】目的:建立琼脂糖凝胶电泳法检测人血清醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase isoenzymes ADH EC 1.1.1.1)同工酶。
方法:采用自制琼脂糖凝胶板,摸索实验条件,在pH8.6,74mmol/L巴比妥电泳缓冲系统中进行20mA、20min电泳,可清晰地分离出ADH同工酶三条区带。
结果:检测了67例患者血清ADH总活性0.013-0.021Kat/L,同工酶ADHⅠ占ADH总活性0.0l-0.30,ADHⅡ占ADH总活性0.12-0.31,ADHⅢ占ADH总活性0.39-0.80。
检测了10例人健康肝组织匀浆的ADH总活性为0.136-0.196Kat/L,同工酶ADHⅠ占总活性的0.07-0.25,同工酶ADHⅡ占总活性的0.19-0.27和同工酶ADHⅢ占总活性0.56-0.73。
结论:正常人血清中ADH酶活性很低,为0-1.8×10^(-3)Kat/L,其同工酶不易被检测出。
而肝脏组织中含有大量ADH酶活性,当肝脏受到严重损伤时,ADH即从肝细胞内逸出,进入血液,使血清中ADH酶活性明显升高,同时通过琼脂糖电泳对其同工酶的检测可测出三条区带,帮助临床进一步了解肝细胞损伤程度,对患者预后和病程的监测具有一定的临床意义。
【总页数】3页(P1175-1177)【关键词】电泳法;检测;肝醇脱氢酶同工酶;血清醇脱氢酶同工酶;肝细胞损伤【作者】宓庆梅;曹鲁宁;高春芳【作者单位】中国人民解放军第二军医大学附属长征医院【正文语种】中文【中图分类】R575【相关文献】1.聚丙烯酰胺浓度梯度凝胶电泳法分离血清乳酸脱氢酶同工酶 [J], 孔力;2.毛细管电泳法分离血清中乳酸脱氢酶同工酶 [J], 丛辉;王惠民;王跃国;贾春平;金庆辉;鞠少卿;王忠慧3.琼脂糖电泳法分离血清碱性肝型和骨型同工酶方法的改进 [J], 肖晓光4.disc—PAGE检测大鼠肝组织血清乳酸脱氢酶同工酶实验... [J], 汤平涛;王翔朴5.琼脂糖凝胶电泳法测定王杂鸽血清乳酸脱氢酶同工酶的研究 [J], 沈秋姑;田向荣;王兴金;龙学燃因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
超薄琼脂糖凝胶电泳快速检测LDH同工酶
超薄琼脂糖凝胶电泳快速检测LDH同工酶
吴惠毅
【期刊名称】《临床检验杂志》
【年(卷),期】1994(000)001
【摘要】超薄琼脂糖凝胶电泳快速检测ＬＤＨ同工酶吴惠毅，陈晋，沈来龙（连云港市第一人民医院，江苏２２２００２）邱国强（常州市第一人民医院中心实验室）琼脂糖凝胶电泳可同时检测ＬＤＨ（１～５）五种同工酶及异常同工酶区带，但国内目前采用的电泳法操作麻烦、耗时长、灵敏...
【总页数】1页(P13)
【作者】吴惠毅
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】R446.112
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正常月经周期和早孕期间宫颈粘液中乳酸脱氢酶同工酶的变化规律及其意义
正常月经周期和早孕期间宫颈粘液中乳酸脱氢酶同工酶的变化规律及其意义汤洁;张宁;郑玲;王大军;鲁海鸥;张敏;王梦醒【期刊名称】《沈阳部队医药》【年(卷),期】2000(000)004【摘要】为研究宫颈粘液中乳酸脱氢酶(LDH)同工酶在月经周期及早孕期间的变化规律,分别对正常月经周期期间和早孕妇女宫颈粘液标本60个和40个,采用琼脂糖凝胶电泳法分离 LDH,以乳酸为底物的酶显色反应后,570nm 处对电泳区带进行扫描,计算出各组分的百分含量。
结果:M-LDH 在整个月经周期中约17天出现高峰,而 H-LDH 在整个月经周期中约11天出现高峰。
在月经周期中 M-LDH 及早孕35～71天 M-LDH 的平均值分别为57.57±6.58%和49.14±7.47%,两者差异有非常显著意义(P<0.01);月经周期中 H-LDH 及早孕35～71天 H-LDH 的平均值分别为18.06±3.40%和21.65±4.63%,两者差异也有非常显著意义(P<0.01)。
结论:早孕期间宫颈粘液 LDH 同工酶谱的变化有利于囊胚获得更多能量,达到植入和生长的目的。
【总页数】2页(P)【作者】汤洁;张宁;郑玲;王大军;鲁海鸥;张敏;王梦醒【作者单位】第202医院全军优生优育研究中心;110003【正文语种】中文【中图分类】R714.1【相关文献】1.宫颈粘液中乳酸脱氢酶同工酶的测定及意义 [J], 汤洁;张宁;郑玲;鲁海鸥;唐轶2.月经周期中宫颈粘液乳酸脱氢酶的变化及影响因素 [J], 晓霄;刘嘉茵3.宫颈粘液超氧化物歧化酶活性及其在月经周期中的变化规律 [J], 王瑜;翁其亮4.宫颈粘液白细胞介素-1β在正常月经周期及体外授精-胚胎移植周期的变化规律[J], 晓霄;顾晓梅;刘嘉茵5.宫颈粘液中乳酸脱氢酶同工酶在月经周期和早孕期的变化及意义 [J], 汤洁;张宁;郑玲;王梦醒;鲁海鸥;张敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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一、实验目的
1. 掌握琼脂糖凝胶电泳的原理 及琼脂糖凝胶板的制备； 2. 熟悉琼脂糖凝胶电泳分离LDH同工酶的方法 及组织匀浆的制备、制点样槽、点样、 显色。
二、实验原理
带电粒子在直流电场中向所带电荷相反的方 1.电泳：
向移动的现象。
能催化功能相同而酶的分子结构、理化 2.同工酶： 性质及免疫学特性不同的一组酶，称为同工酶。
六、实验结果
乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱
七、方法学评价
(一)电泳法
琼脂糖凝胶法
1. 优点：灵敏度高，样品取量少，无拖尾现象。 2. 缺点：点样不能过多，否则影响区带效果。 醋酸纤维薄膜法 1.优点:应用普遍、简便、快速、分离清晰
2.缺点：点样量少，LDH4和LDH5易受电热的影响而失活。
聚丙烯酰胺凝胶法 1.优点：分辨率高 2.缺点：试剂昂贵，有一定的毒性，操作繁琐
八、临床意义
八、临床意义
1.急性心肌梗死：LDH1、 LDH3↑
LDH1/ LDH2 ↑>1 2.肝细胞受损:LDH ↑ LDH5 ↑↑ LDH4↑
3.胃癌、结肠癌、胰腺癌:LDH3↑ 4.前列腺癌: LDH5/ LDH4↑>1 5.骨骼肌急性损伤: LDH4、 LDH5↑
思考题
正常成年人血清LD同工酶活力电泳结果为
电泳结束后，加显色凝胶加载凝胶玻片上，
置37℃烤箱中，15分钟。
五、注意事项
1. 标本需新鲜，室温保存，PBS液浸泡。 2. 底物显色液须临用前配制，用棕色试剂瓶装， 避光保存于50 ℃水浴箱，复溶后无效。 3. LDH4、LDH5对冷热均敏感，应严格控制温 度，底物显色液如超过50℃，血清标本放置 温度过低，均容易破坏LDH4、LDH5。
A．LD2> LD1> LD3> LD4> LD5
B . LD5 > LD1 > LD2 > LD3 > LD4
C． LD3 > LD1 > LD2 > LD4 > LD5
D． LD1 > LD2 > LD3 > LD4 > LD5 E． LD4 > LD1 > LD2 > LD3 > LD5
LD1 :14.8％ ～ 25.9％ LD2 :31.7％～41.4％ LD3 :18.1％～ 25.9％ LD4 :7.2％～13.6％ LD5 :5.3％～16.5％
冷凝后，在凝胶板一端1.2~1.5cm处用小滤 纸片垂直插入，不能触到玻片。
5.点样：
取上清液10μl，垂直均匀点样。 6.电泳：
110伏，40分钟，点样端接负极，纱布搭桥， 盖于凝胶玻片两端。
7.显色：
将底物显色液与沸水浴融化的8g/L琼脂糖
按4:5的比例混合，制成显色凝胶液，置50℃
热水中备用，注意避光。
LDH由两种亚基组成的四聚体，即心肌型 H型（）和骨骼肌型M型（）两种亚基，这两 种亚基以不同的比例组成五种同工酶，结构模 式图如下：
LDH1
LDH2
LDH3
LDH4
LDH5
H亚基为酸性基团，其含量越多，此酶的等电
点越低，与缓冲溶液的pH值之差值就越大，电 泳迁移率就越快。
LDH1>LDH2>LDH3>LDH4>LDH5 根据电泳迁移率的速度不同，可分成五条区带
七、方法学评价
（二）层析法
1.优点：能够准确定量，不受温度的影响。 2.缺点：操作繁琐 （三）免疫化学法 1.优点：操作简便，可以快速测出LDH1和LDH5的 活性。 2.缺点：需要制备抗H 、抗M血清。
七、方法学评价
（四）抑制剂法
1.优点：操作简便快速 2.缺点：只能直接测定LDH1的活性。 （五）热稳定法 利用M亚基较H亚基对热更敏感的特点，使LDH5在 57℃迅速失活，而LDH1在65℃短时间仍能保持活 力，可分别测出LDH1和LDH5的活力。
四、操作步骤
1.组织匀浆： 取兔子肝、肾、心肌、骨骼肌组织10g于烧杯中， 用PBS缓冲液冲洗2~3次，剪碎匀浆器中，然后加少量 的PBS缓冲液，匀浆研磨，使细胞破碎，LDH释放出 来。 2.离心： 用中号试管装组织匀浆液，4000转/分，离心10分 钟，取上清液1ml于1.5mlEP管。
3.制备琼脂糖凝胶胶板： 取冰箱保存的5g/l的琼脂糖凝胶，置沸水浴 中加热融化，用2ml吸量管取已融化的凝胶 1.8ml~2.0ml，均匀快速地铺盖于洁净的玻片 上。 4.制点样槽：
点样线
LDH5
LDH4
LDH3
LDH2
LDH1
3.显色原理：
LDH活性的区带显紫兰色，颜色的深浅
与酶的活性成正比。
三、主要器材及试剂
主要仪器
匀浆器
离心机
电泳槽
电泳仪
主要试剂
1.PBS缓冲液（pH 7.5） 2.巴比妥缓冲液（pH 8.6） 3. 5g/L、8g/L琼脂糖凝胶 4.显色试剂： （1）D-L-乳酸钠 （2）1g/L吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS） （3）10g/LNAD+ （4）1g/L氯化硝基四氮唑蓝（BNT)