(修改版)琼脂糖电泳检测LDH同工酶

LDH由两种亚基组成的四聚体，即心肌型 H型（）和骨骼肌型M型（）两种亚基，这两 种亚基以不同的比例组成五种同工酶，结构模 式图如下：
LDH1
LDH2
LDH3
wk.baidu.com
LDH4
LDH5

H亚基为酸性基团，其含量越多，此酶的等电
点越低，与缓冲溶液的pH值之差值就越大，电 泳迁移率就越快。

LDH1>LDH2>LDH3>LDH4>LDH5 根据电泳迁移率的速度不同，可分成五条区带
电泳结束后，加显色凝胶加载凝胶玻片上，
置37℃烤箱中，15分钟。
五、注意事项
1. 标本需新鲜，室温保存，PBS液浸泡。 2. 底物显色液须临用前配制，用棕色试剂瓶装， 避光保存于50 ℃水浴箱，复溶后无效。 3. LDH4、LDH5对冷热均敏感，应严格控制温 度，底物显色液如超过50℃，血清标本放置 温度过低，均容易破坏LDH4、LDH5。
实验九
琼脂糖凝胶电泳分离LDH同工酶
一、实验目的
1. 掌握琼脂糖凝胶电泳的原理 及琼脂糖凝胶板的制备； 2. 熟悉琼脂糖凝胶电泳分离LDH同工酶的方法 及组织匀浆的制备、制点样槽、点样、 显色。
二、实验原理
带电粒子在直流电场中向所带电荷相反的方 1.电泳：
向移动的现象。
能催化功能相同而酶的分子结构、理化 2.同工酶： 性质及免疫学特性不同的一组酶，称为同工酶。
点样线
LDH5
LDH4
LDH3
LDH2
LDH1
3.显色原理：
LDH活性的区带显紫兰色，颜色的深浅
与酶的活性成正比。
三、主要器材及试剂
主要仪器
匀浆器
离心机
电泳槽
电泳仪
主要试剂
1.PBS缓冲液（pH 7.5） 2.巴比妥缓冲液（pH 8.6） 3. 5g/L、8g/L琼脂糖凝胶 4.显色试剂： （1）D-L-乳酸钠 （2）1g/L吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS） （3）10g/LNAD+ （4）1g/L氯化硝基四氮唑蓝（BNT)
A．LD2> LD1> LD3> LD4> LD5
B . LD5 > LD1 > LD2 > LD3 > LD4
C． LD3 > LD1 > LD2 > LD4 > LD5
D． LD1 > LD2 > LD3 > LD4 > LD5 E． LD4 > LD1 > LD2 > LD3 > LD5

LD1 :14.8％ ～ 25.9％ LD2 :31.7％～41.4％ LD3 :18.1％～ 25.9％ LD4 :7.2％～13.6％ LD5 :5.3％～16.5％
七、方法学评价
（二）层析法
1.优点：能够准确定量，不受温度的影响。 2.缺点：操作繁琐 （三）免疫化学法 1.优点：操作简便，可以快速测出LDH1和LDH5的 活性。 2.缺点：需要制备抗H 、抗M血清。
七、方法学评价
（四）抑制剂法
1.优点：操作简便快速 2.缺点：只能直接测定LDH1的活性。 （五）热稳定法 利用M亚基较H亚基对热更敏感的特点，使LDH5在 57℃迅速失活，而LDH1在65℃短时间仍能保持活 力，可分别测出LDH1和LDH5的活力。
冷凝后，在凝胶板一端1.2~1.5cm处用小滤 纸片垂直插入，不能触到玻片。
5.点样：
取上清液10μl，垂直均匀点样。 6.电泳：
110伏，40分钟，点样端接负极，纱布搭桥， 盖于凝胶玻片两端。
7.显色：
将底物显色液与沸水浴融化的8g/L琼脂糖
按4:5的比例混合，制成显色凝胶液，置50℃
热水中备用，注意避光。
四、操作步骤
1.组织匀浆： 取兔子肝、肾、心肌、骨骼肌组织10g于烧杯中， 用PBS缓冲液冲洗2~3次，剪碎匀浆器中，然后加少量 的PBS缓冲液，匀浆研磨，使细胞破碎，LDH释放出 来。 2.离心： 用中号试管装组织匀浆液，4000转/分，离心10分 钟，取上清液1ml于1.5mlEP管。
3.制备琼脂糖凝胶胶板： 取冰箱保存的5g/l的琼脂糖凝胶，置沸水浴 中加热融化，用2ml吸量管取已融化的凝胶 1.8ml~2.0ml，均匀快速地铺盖于洁净的玻片 上。 4.制点样槽：
八、临床意义
八、临床意义
1.急性心肌梗死：LDH1、 LDH3↑
LDH1/ LDH2 ↑>1 2.肝细胞受损:LDH ↑ LDH5 ↑↑ LDH4↑
3.胃癌、结肠癌、胰腺癌:LDH3↑ 4.前列腺癌: LDH5/ LDH4↑>1 5.骨骼肌急性损伤: LDH4、 LDH5↑
思考题

正常成年人血清LD同工酶活力电泳结果为
六、实验结果
乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱
七、方法学评价
(一)电泳法
琼脂糖凝胶法
1. 优点：灵敏度高，样品取量少，无拖尾现象。 2. 缺点：点样不能过多，否则影响区带效果。 醋酸纤维薄膜法 1.优点:应用普遍、简便、快速、分离清晰
2.缺点：点样量少，LDH4和LDH5易受电热的影响而失活。
聚丙烯酰胺凝胶法 1.优点：分辨率高 2.缺点：试剂昂贵，有一定的毒性，操作繁琐