分子酶工程的研究进展(1)

制了它的推广应用 " 重组 89: 技 术 的 建 立 ! 使 人 们 可 以 较 容 易 地克隆各种各样天然的酶基因 ! 并将 其 在 微 生 物 系 统 中 高 效 表 达 ! 从而在很大程度上摆脱对天然酶源的依赖 " 这一技术已成功 地应用于酶制剂的工业生产 " 世界上 最 大 的 工 业 酶 制 剂 生 产 商 丹 麦 9.0.23($! 公 司 生 产 的 酶 制 剂 ;<= 为 基 因 工 程 产 品 " 我 国 在这个领域中也取得了令世人瞩目的 研 究 成 果 " 如 广 西 大 学 黄 日波教授 采 用 重 组 89: 技 术 制 备 啤 酒 催 熟 剂 ! > 乙 酰 乳 酸 脱 羧 酶 ! 经菌种筛选和反复多次 ?@A 测试 ! 从一株克雷伯氏土壤菌中 克隆到编码 !> 乙酰乳酸脱羧酶的基因 ! 将该基因以正确读码框 形式连接到表达质粒上 ! 在强启动子 的 存 在 和 细 胞 高 密 度 培 养 两者结合的情况下 ! 该基因得以在大肠杆菌 BC ( 中高水平表达 ! 在 7D E 和 FG E 发 酵 罐 中 表 达 量 为 HG<IF ;<< J K EL 比 丹 麦
!"! ’ 和 体 外 分 子 定 向 进 化 &!" #!$%& (./$’)/*& %"&$’#$% $0./)#"., ’
对天然酶蛋白进行改造 % 三是通过基 因 和 基 因 片 段 的 融 合 构 建 融合酶 &1)!"., $,23($ ’456"
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酶的基因克隆和异源表达
天然酶在生物体中含量一般较低 ! 难以提取和大量制备 " 限
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生
物
技
术
通
讯
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代分子生物学的成就 " 使抗体的类型越来越多 % 此外用基因工程 法改造或构建全新抗体酶是很有前途 的 方 法 " 建 立 抗 体 基 因 组 合文库 " 对单抗及其相应基因的序列分析 " 对 建 立 抗 体 结 合 部 位 进行基因定位突变及置换有催化功能 的 氨 基 酸 " 是 制 备 基 因 工 程抗体酶的主要内容 % 国内也有许多学者在进行此类研究 % 廉革 )* 甲 状 腺 素 脱 碘 酶 " 制 伟 等 模 拟 生 物 体 内 一 族 重 要 的 含 硒 酶* 备催化甲状腺素脱碘的含硒抗体酶 % 他 们 用 杂 交 瘤 技 术 制 备 出 抗甲状腺素的单克隆抗体 ;*3 " 再用化学修饰法将催化基团硒代 半胱氨酸引入到抗体的抗原结合部位 " 得到含硒抗体酶 %B=;*3 ( 通过 $&G 方法测定抗体酶活力 % %B=;*3 有明显的催化甲状腺素 + 脱碘活性 " 其 &V6Y 为 9>: DV/0 Z [VLE VM\ " 催化反应速率与底物浓 度的双倒数图为一组平行线 " 对底物 甲 状 腺 素 的 特 异 性 高 于 天 然酶 "]= 丙基 =9= 硫代尿嘧啶对其活力起抑制作用 " 是二硫苏糖 醇 ’F##$ 的竞争性抑制剂 ! 他们首次制备出了有天然脱碘酶活性 的抗体酶 " 催化机制属双底物乒乓反应机制 <Q]?!
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和热稳定性等进行改造已有很多成功的实例 <4=>?! 但 定 点 突 变 技 术只能对天然酶蛋白中少数的氨基酸 残 基 进 行 替 换 " 酶 蛋 白 的 高级结构基本维持不变 " 因而对酶功能的 改 造 较 为 有 限 ! 同 时 " 由于已有的结构与功能相互关系的信 息 远 远 不 能 满 足 当 今 人 们 对蛋白质新功能的要求 " 因此目前采 用 体 外 分 子 定 向 进 化 的 方 法来改造酶蛋白的研究越来越多 " 并 已 在 短 短 几 年 内 取 得 了 令 人瞩目的成就 ! 易错 @A$ #BCC/C DC/EB @A$ $ 和 F’G 改组 #F’G HIJKK0LEM $ 就是其中 9 种方法 % 易错 @*$ 是一种相对简单 & 快速 & 廉价的随机突变方法 ! 它 通 过 改 变 @*$ 反 应 条 件 " 如 降 低 一 种 N’#@ 的 量 ’ 降 至 3OP Q:O $& 以 N&#@ 来 代 替 被 减 少 的 N’#@ 等 " 使 碱 基 在 一 定 程 度 上 随机错配而引入多点突变 ! GCE/0N 等通过易错 @A$ 对枯草杆菌 蛋白酶 " 进行了系列体外进化研究 " 经筛选得到几个在高浓 度 的二甲基甲酰胺 ’F5R $ 中酶活力明显提高的突变株 <S?! F’G 改组 则 是 QTT; 年 由 美 国 的 %UBVVBC 提 出 的 <T?" 这 种 方 法 不 仅 可 以 对 从随机突变文库中筛选出来的一组突 变 基 因 人 为 进 化 " 还 可 以 将具有结构同源性的几种基因进行体 外 重 组 " 共 同 进 化 出 一 种 新的蛋白质 ! 通过这种方法产生的多样性文库 " 可以有效积累有 益突变 " 排除有害突变和中性突变 " 同时 也 可 实 现 目 的 蛋 白 质 多 种特性的共进化
基因工程的问世 ! 对酶学的发 展 起 到 了 巨 大 的 推 动 和 变 革 作用 " 分子酶工程学就是采用基因工 程 和 蛋 白 质 工 程 的 方 法 和 技术 ! 研究酶基因的克隆和表达 # 酶蛋白 的 结 构 与 功 能 的 关 系 以 及对酶进行再设计和定向加工 ! 以发 展 更 优 良 的 新 酶 或 新 功 能 酶 " 当前的研究热点可以概括为三个方面 $ 一是利用基因工程大 量 生 产 酶 制 剂 % 二 是 通 过 基 因 定 点 突 变 &!"#$ %"&$’#$% ()#*+$,$-
*%0*,’$b B_"! *&#"’/$ 1.’)! ., $,23($ +$,$ ’/.,$ *,% _$#$&.+$,$!"! $^R&$!!".,L !"#$ %"&$’#$% (.%"13 *,% .&#_.+$,$!"!L 1)!"., R&.#$", *,% 1)!"., $,23($L *,% #$/.($&$b 0*,’$!L #&$,%! *,% *RR/"’*#"., .1 (./$’)/*& $,23($ $,+",$$&",+b 7’0 8)."(6 (./$’)/*& $,23($ $,+",$$&",+c +$,$ ’/.,$c (.%"13c .&#_.+$,$!"!c $,23($ ("("’!c 1)!".,c #$/.($&$
生
物
技
术
通
讯
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文章编号 U7<<V><<<HWH<<DX<F><HYG><F
综
述
分子酶工程的研究进展
严萍 ! 梁海秋 ! 杨辉 ! ຫໍສະໝຸດ Baidu河治
广西大学 食品发酵工程研究所 ! 南宁 GF<<<D 摘要 ! 随着基因工程和蛋白质工程的进展和应用 ! 酶工程在分子水平上的研究与应用也得到了迅猛发展 " 本文着重介绍了 酶基因克隆与异源表达 # 酶分子的定向改造和进 化 # 融 合 蛋 白 与 融 合 酶 # 酶 的 人 工 模 拟 $ 抗 体 酶 # 分 子 印 迹 技 术 % 和 端 粒 酶 ! 综述了分子酶工程的研究进展 # 趋势及其应用 " 关键词 ! 分子酶工程 & 基因克隆 & 改造 & 定向进化 & 人工模拟 & 融合 & 端粒酶 中图分类号 ! ZGG "ZY; 文献标识码 ! :
9.0.23($! 公司报道的数据高 D 倍 ! 现已投入工业化生产 " 随后 !
黄日波教授研究小组从广西象州温泉 中 分 离 到 一 株 硫 矿 硫 化 叶 菌 ! 并根据基因序列库 C$,M*,N 中提供的 麦 芽 寡 糖 基 海 藻 糖 合 酶 &OBP*!$’ 和 麦 芽 寡 糖 基 海 藻 糖 水 解 酶 &OBQ*!$ ’ 的 89: 基 因 序 列 ! 利 用 ?@A 技 术 从 中 克 隆 到 OBP*!$ 和 OBQ*!$ ! 分 别 构 建 了含 OBP*!$#OBQ*!$ 基因的表达载体 RQ">SN",# ! 将其分别整合 到汉斯多形酵母染色体中 ! 成功地构建了 生 产 海 藻 糖 工 程 菌 ! 其 表达量 达 T< 万 J K E OBP*!$ 和 F 万 J K E OBQ*!$ " 经 这 H 个 酶 的联合作用 ! 使木薯淀粉中葡萄糖以 ;<= 的转化率 转 化 为 海 藻 糖 ! 现已投入工业化生产 4H6" 反之 ! 也可以通过转基因手段 将 微 生 物 的 酶 基 因 或 酶 的 抑 制剂基因转入动植物细胞中 ! 使之产生抗 病 菌 # 抗 虫 等 能 力 " 总 之 !酶 异 源 表 达 的 应 用 范 围 非 常 广 泛 !已 遍 及 工 业 #医 药 #农 药 # 化学分析 # 环境保护 # 能源开发和生命研究等各个领域 "
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收稿日期 !H<<F>77><F 作者简介 ! 严萍 &7VYT> ’! 女 ! 硕士研究生 通讯作者 ! 周河治 ! 电话 $<YY7>FHY<YFG
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酶分子的定向改造和进化
酶分子本身蕴藏着很大的进化潜力 L 许多功能有待于开发 "
分子酶工程设计可以采用定点突变和 体 外 分 子 定 向 进 化 两 种 方 式对天然酶分子进行改造 " 定点突变 需 要 知 道 酶 蛋 白 的 一 级 结 构及编码序列 ! 并根据蛋白质空间结构知识来设计突变位点 " 体 外定向进化是近几年新兴的一种蛋白 质 改 造 策 略 ! 可 以 在 尚 不 知道蛋白质的空间结构 ! 或者根据现 有 的 蛋 白 质 结 构 知 识 尚 不 能进行有效的定点突变时 ! 借鉴实验 室 手 段 在 体 外 模 拟 自 然 进 化 的 过 程 & 随 机 突 变 # 重 组 和 选 择 ’! 使 基 因 发 生 大 量 变 异 ! 并 定 向选择出所需性质或功能 ! 从而使几 百 万 年 的 自 然 进 化 过 程 在 短期内得以实现 " 利用定点突变技术对天然酶蛋 白 的 催 化 性 质 # 底 物 特 异 性
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分子印迹技术 ’V/0B^J06C LVDCLEULEM $<Q>? 在 RLHIBC 的 酶 与 底 物 相 互 作 用 的 , 锁 和 钥 匙 - 模 型 &@6J0LEM
的 抗 原 与 抗 体 作 用 学 说 以 及 FL^_7 的 , 专 一 性 吸 附 - 理 论 的 启 发 下 "‘J0KK 和 5/Ha6^I 等提出并发展了分子印迹技术 <QS=9:?% 分子印 迹技术以其简便 & 通用和高效等特点 " 具 有 重 要 的 理 论 研 究 意 义 和实际应用价值 % 分子印迹技术是将待分离的目标分 子 ’ 模 板 分 子 $ 与 交 联 剂 在聚合物单体溶液中进行聚合制备得 到 固 体 物 质 " 然 后 通 过 物 理 或 化 学 手 段 除 去 介 质 中 的 目 标 分 子 "便 得 到 ,印 迹 -有 目 标 分 子空间结构和结合位点的分子印迹聚合物 ’V/0B^J06C07 LVDCLEUBN D/07VBC "5&@$<9Q?% 目前 " 分子印迹技术 已 被 应 用 于 手 性 物 质 拆 分 ’^ILC60 HBD6C6UL/E $& 仿 生 传 感 器 ’aL/=VLVBUL^ HBEH/C $& 固 相 萃 取 ’H/0LN=DI6HB BYUC6^UL/E $& 抗 体 模 拟 ’6EULa/N7 VLVL^H$& 酶 催 化 模 拟 ’BEb7VB VLVL^H $ 以 及 控 释 药 物 ’^/EUC/00BN CB0B6HB NCJMH $ 等 领 域中 % 清华大学隋洪艳等利用分子印 迹 技 术 的 共 价 法 制 备 了 对