4 第四讲 常用分子克隆工具酶简介共47页
分子克隆工具酶及其应
1. 具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不 具有对称结构。 2. 酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位 点的一侧，1-- 20nt。 3. 酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。 4. 产生粘性末端可以是1--5个核苷酸。 5. 均为单体，分子量编为辑课E M.RE CH3
RE
RE
RE
RE
CH3
RE
RE
RE
CH3
用于cDNA的连接
RE 甲基 化酶
RE
CH3
RE
人工
接头
与载体相连
编辑课件
CH3 RE RE
分子克隆工具酶及其应用
编辑课件
分子克隆工具酶及其应用
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯
是完全重叠还是边界重叠
如：完全重叠 BclI—dam(GATC)；ScrFI—dcm(CCA/TGG)
边界重叠 ClaI--dam；
Sau96I--dcm
2）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重
叠
如：dam--BamHI，Sau3AI，BglII，PvuI； dcm--BstNI
编辑课件
该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与 DNA复制、基因转录等过程有关。
4. E．coli中依赖于甲基化的限制修饰系统
mrr（mA/A）、mcr(Am5CG)、merB（Pum5C）
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第三章 分子克隆工具酶
常用的工具酶
主 要 功 能
(续上表格)
工具 酶 名 称
碱性磷酸酶 去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基团 BAP or CIP 核酸外切酶III 降解DNA3’－OH末端的核苷酸残基 exonuclease III 降解酶S1 降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或 nuclease S1 寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子的单链 核酸酶Bal 31 降解双链DNA,RNA的5’及3’末端，高专一性单链核苷酸 nuclease Bal31 Taq DNA 聚合酶 能在高温（72℃）下的单链DNA为模板， Taq DNA polymerase 从5’→3’方向合成新生的互补链 核糖核酸酶 专一性降解RNA RNase 脱氧核糖核酸酶 内切核酸酶，水解单链或双链DNA DNase
3 分子克隆工具酶（4学时）
概述 限制性内切核酸酶 甲基化酶（Methylase） DNA聚合酶（DNA polymerase Ⅰ） 其他分子克隆工具酶
工具酶的定义
在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于 DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转 录等有关的各种酶系统称为工具酶。 基因工程的操作，是在分子水平上的操作， 是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶， DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割， 拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为 “工具酶”。
2.1.5 同尾酶
许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的， 且是对称的，即它们可产生相同的黏性突出末端。这 些酶统称为同尾酶（isocaudarner）。这些酶切割 DNA得到的产物可进行互补连接。 EcoRⅠ G↓AATTC SpeⅠ A↓CTAGT T↓CTAGA BamHⅠ G↓GATCC
基因克隆常用的工具酶
基因克隆常用的工具酶在基因克隆过程中，涉及基因的合成、切割、重组及修饰，在这些过程中，需要各种酶的参与。
可以说，基因克隆技术的建立和发展是以各种核酸酶的发现和应用为基础的。
目前，已经知道的工具酶种类繁多，功能各异，这里主要对聚合酶、内切酶、连接酶和修饰酶等几种常用的工具酶做下介绍。
1.DNA和RNA聚合酶DNA 聚合酶最早被发现于大肠杆菌中，它们具有在引物存在条件下，以DNA 为模板，沿5′到3′方向，催化合成DNA 的功能。
目前，常用的DNA 聚合酶有大肠杆菌DNA 聚合酶I（全酶）、Klenow 酶、T4 DNA 聚合酶、Taq DNA 聚合酶及反转录酶等。
DNA 聚合酶具有的共同特点为：不能起始新的DNA 链的合成，需要模板和引物，它们催化脱氧核糖核苷酸加到双链DNA 引物链的3′-OH 末端上，催化脱氧核糖核苷酸的聚合，合成新的DNA链。
目前，从大肠杆菌获得三种不同类型的DNA 聚合酶，即DNA 聚合酶Ⅰ、DNA 聚合酶Ⅱ和DNA 聚合酶Ⅲ。
DNA 聚合酶Ⅰ和DNA 聚合酶Ⅱ被认为在大肠杆菌中主要是参与DNA的修复，而DNA 聚合酶Ⅲ则是与DNA 复制有关。
在基因克隆中主要使用的是DNA 聚合酶Ⅰ。
DNA 聚合酶Ⅰ是由大肠杆菌polA 基因编码的单链多肽，相对分子质量为109 kD。
它具有三种不同催化活性，即5′-3′聚合酶活性、5′-3′外切酶活性和3′-5′外切酶活性。
DNA聚合酶Ⅰ主要用途是通过DNA 端口平移制备用于核酸杂交分析的DNA 探针和对DNA 分子的3′突出末端进行标记。
Klenow 酶是大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ经枯草杆菌蛋白酶处理产生的大片段，它的相对分子质量为76 kD。
与大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ相比，Klenow 酶缺少了5′-3′外切酶活性，保留了5′-3′聚合酶活性和3′-5′外切酶活性。
在基因克隆中，Klenow酶的主要作用为：（1）补平限制性内切酶切割DNA 形成的3′末端；（2）对DNA片段3′凹端进行放射性标记；（3）合成cDNA第二链；（4）用于Sanger双脱氧末端终止法中的DNA测序；（5）用于体外诱导突变；（6）也可用于PCR反应，进行体外扩增DNA序列。
分子克隆中常用的四种工具酶及其应用
分子克隆中常用的四种工具酶及其应用分子克隆是利用分子生物学技术对目标DNA进行扩增及克隆的过程。
在分子克隆的过程中，常常需要使用许多酶类工具来完成不同的任务。
以下介绍了分子克隆过程中最常用的四种酶类工具及其应用。
1. 限制性内切酶限制性内切酶（Restriction endonuclease）又称限制酶，是一类可特异性切割DNA特定序列的酶。
它可以在DNA的特定位置切割成不同的碎片，而不会破坏DNA的结构。
因此，限制酶被广泛应用于DNA的纯化、分析和重组等领域。
在分子克隆中，限制酶通常用于切割DNA的特定序列，以获得所需的DNA片段。
同时，也可以用于制备载体DNA的端部修饰，方便插入外来DNA片段。
此外，限制酶还可以用于分析DNA序列的变异和同源性等特征。
2. DNA连接酶DNA连接酶（DNA ligase）是一种催化DNA连结软帽酶，用于连接具有互补末端的DNA片段。
连接酶广泛应用于DNA重组、引物连接、克隆和测序等领域。
在分子克隆中，DNA连接酶通常使用于将外来DNA片段连接到载体 DNA 上。
此外，为了克隆具有完整DNA序列的目标基因，连接酶还可以用于连接PCR扩增出来的目标DNA序列。
3. PCR酶聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）是一种快速、有效、敏感的DNA扩增技术。
在PCR过程中，通过PCR酶催化下的DNA扩增反应，能够在很短的时间内扩增目标DNA的数量。
在分子克隆中，PCR酶通常用于扩增目标DNA片段。
利用PCR技术，可以选择性增加目标DNA的数量并在容易处理的基本DNA片段之间产生特定的限制酶切断部位，为后续分子克隆实验提供方便。
4. 接头酶接头酶（T4 DNA ligase）是一种针对DNA单链断裂或缺口进行修复和连接的酶。
在分子克隆中，接头酶主要用于将外来DNA片段和载体DNA粘到一起。
在分子克隆的过程中，外来DNA片段和载体DNA之间通常存在一些不兼容的末端或过于短的重叠部分。
4常用分子克隆工具酶简介
3'-末端补齐 3'-末端标记
5' -ACGTTGCAA ACTG -3' 3' -TGCAACGTTTGAC…..5'
cDNA第二链合成
mRNA 3' -UGCAACGUUUGAC…..5' c DNA 5' -ACGTTGCAAACTG
GAC
5' 3' 5'
5' ~~ 5'
5' ---------~~ 5'
DNaseI 与 Pol I 的 切口移位
HO P 5' 3' 5' 3'
DNaseI Pol I
5' 3'
1.2 Klenow片段 大肠杆菌DNA聚合酶I的枯草杆菌
蛋白酶水解产物。
活性：5' ? 3' 聚合酶 3' ? 5' 外切酶
用途：
⑴ 3' -末端补平 ⑵ 3' -末端抹平 ⑶ cDNA第二链合成 ⑷ 双脱氧系统测序
1.3 DNase I
用途 1) 切口移位，制备DNA探针 2) 制备RNA样品时除去DNA分子 3) 基因突变时产生切口
ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口
聚合酶活性 dNTP
用途： ⑴补平反应 ⑵末端标记 ⑶抹平反应
1.4 Taq DNA polymerase
特点：
分离自水生栖热菌，分子量为 94,000，最适反应 温度75-80℃ 。
5' -3' 聚合酶活性 5‘-3' 外切酶活性
用途：
主要用于 DNA的体外扩增
5' 3'
分子克隆工具酶
同尾酶(Isocaudamers）
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如 BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等。
BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
Bgl Ⅱ 5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’
Bcl I 5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’
完全同裂酶 识别位点和切点完全相同。 如Hind Ⅲ 和Hsu I。
Hind Ⅲ Hsu I
5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
不完全同裂酶
识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。
Xma I Sma I
5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
限制（Restriction）
限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA 切成小片断。
修饰（Modification）
细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修 饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别 切割。
① Dam甲基化酶 GATC腺嘌呤N6位置引入甲基。
② Dcm甲基化酶
CCAGG或CCTGG序列在第二个 C上C5位置上引入甲基。
ATP、Mg2+、 SAM GAGCC CAGCAG
距识别序列下游 24-26bp处
I型限制性内切酶
I型酶属复合功能酶，兼具限制、修饰两 种功能。核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和 DNA解旋酶4种活性。
显著特点：识别位点与切割位点不一致。 酶分子首先由M. Meselson和R. Yuan在 1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。 代表：EcoB和 EcoK。
分子克隆技术常用的工具酶
已分离到与许多Ⅱ类限制酶相对应的甲基化酶。其命名是在 对应II类限制酶名称前加一个M表示。
如M．EcoR I是能使EcoR I识别序列中(GAATTC)3’-端的A甲
基化(GAm6ATTC)的酶
识别序列中某些碱基甲基化对II类限制酶的影响至 少有3种：
①敏感的，甲基化后不能再切割；
DNA用的乙醇。
2）甲基化
识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。 限制酶识别序列内或其邻近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，会 阻碍限制酶的酶解活性。 受甲基化影响的酶在商品说明书中都会有标示。
所用符号为：m4C表示N4-甲基化胞嘧啶，m5C为C5-甲基胞嘧啶。
3）底物性状
随底物的不同而活性发生改变
仅2003年1-4月份就有150余种新的酶被登录入网，至2003年 04月19日, REBASE (The Restriction Enzyme Database) 收集的 编号已有7096种；其中Ⅱ类酶有3845种．
根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等， 一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ 三大类。
②不敏感的．甲基化后仍可切割；
③依赖于甲基化的，只有甲基化后才能切割。
一、大肠杆菌DNA聚合酶 I
1 三种酶活性 1 ）DNA聚合活性
5' A T
||| |
3' T A C G dTTTP
5'
5’ 5’
引物
2）核酸外切酶活性
5’ A G C T T C A G G A T A
(-) 放线菌素D (-)
DNA合成
RNA
DNA(前病毒)
RNA
逆转录酶的应用:
应用于基因工程
分子克隆用酶基因与蛋白质工程课件
用限制性内切酶酶切DNA
凝胶电泳分开DNA片段
把DNA片段转移到滤膜上
利用标记的探针检测特定的DNA片段 （Southern 杂交）
结果分析。
图右表示了植物A叶绿体基因 组小部分DNA的限制图以及植 物 A 和 另 外 2 个 材 料 (B 和 C). 的RFlP形式．如果植物A与祖 先种相比变化很小，那么假 定它发生了2个突变．突变1， 在 13Kb 片 段 上 出 现 一 新 的 限 制 性 位 点 ， 产 生 9Kb 和 4Kb 的 片段．突变2，在形成植物C 的过程中，一个限制性位点 消失，产生11Kb片段，6Kb和 5Kb的消失．基于这一系列变 化，就可列出系统发育图(图 左).
II类限制性内切酶的切割 位点在识别序列中，有的在 对称轴处切割，产生平末端 DNA片段
有的切割位点在对称轴一侧， 产生带有单链突出末端的 DNA片段，称为粘性末端.
3、甲基化酶（Methylase） 与识别位点
原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护 宿主DNA不被相应的限制酶所切割。
2. 37℃水浴保温2-3小时，使酶切完全。 3. 每管加入2l 0.1mol/L EDTA(pH8.0), 混匀以
停止反应，置于冰箱保存备用。 4. 取5-10l酶切液进行琼脂糖凝胶电泳分析。
DNA片段和质粒载体的连接 及用酶
二、T4-DNA连接酶
带有非互补突出端的片段的连接
载体与DNA片段分别 用两种不同的限制性内 切酶进行消化可产生带 有非互补的粘性末端， 这也是最容易可克隆的 DNA片段。该种粘性末端 的连接载体DNA和外源 DNA的分子数比（浓度比 ）通常为为1:1。
6、限制性内切酶酶切实验步骤
分子克隆常用工具酶ppt课件
;.
49
RNA聚合酶
催化RNA体外合成反应 依赖 DNA 的 RNA 聚合酶 不依赖 DNA 的RNA聚合酶
;.
50
反转录酶(reverse transcriptase)
反转录酶具有5′→3′的DNA聚合酶活性，以RNA为模板聚合cDNA链,同时又具有3′ →5′和5′ →3′的 RNA 外切核酸酶活性。AMV和MLV。
DNA末端转移酶 DNA terminal transferase
降解酶 S1 nuclease S1
主要功能 在DNA分子内部的特异性的碱基序列内部进行切割
将两条以上的线性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯键连接成 一个整体 通过向 3‘ 端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链裂 口，即5’→3‘ DNA 聚合酶活性与 3'→5'及5'→3'-外切酶活性 催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的5'-OH末端上
因此，酶是 DNA 重组技术中必不可少的工具。
;.
6
核酸水解酶类
核酸内切酶核酸 外切酶
核酸合成酶类
DNA聚合酶RNA聚合 酶DNA连接酶
核酸修饰酶类
磷酸酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶
;.
7
用于核酸操作的常用工具酶
➢ 限制性核酸内切酶 ➢ DNA连接酶 ➢ DNA聚合酶 ➢ 核酸酶 ➢ 核酸修饰酶
;.
24
II 型限制性核酸内切酶酶解反应体系
;.
25
“星”活性Star activity
“星”活性：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端ppH值等，会使一些 核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性所谓的现象。
在名称右上角加一个星号(*)表示,•如EcoRⅠ*：AATT ；EcoRⅠ：GAATTC 必须采用规范的实验步骤, 应用推荐的反应条件。
分子克隆工具酶_图文(精)
第二章分子克隆工具酶DNA 重组技术中对核酸的“精雕细刻”主要用酶作为工具。
60年代末，70年代初科学家们陆续发现了DNA 连接酶、T4DNA 连接酶、Ⅱ型限制性核酸内切酶Hin fI 和Eco RI、反转录酶等，才使他们能对DNA 分子进行剪切、连接等基因操作，故称这些酶为工具酶。
到目前为止，世界上发现的工具酶种类和数量繁多，现将重组DNA 分子技术中常的工具酶简介如下。
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）在重组DNA 技术中有重要地位，在此较详细介绍。
第一节限制性核酸内切酶核酸酶可分为两类：核酸外切酶（exonuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切酶(endonuclease则从核酸链中间水解3’，5’磷酸二酯键，将核酸链切断。
很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并将其分解，1962年发现这是因为细菌中含有特异的核酸内切酶，能识别特定的核酸序列而将核酸切断;同时又伴随有特定的核酸修饰酶，最常见的是甲基化酶，能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基化，从而避免受内切酶水解，外来核酸没有这种特异的甲基化修饰，就会被细胞的核酸酶所水解.这样细胞就构成了限制一修饰体系，其功能就是保护自身的DNA，分解外来的DNA，以保护和维持自身遗传信息的稳定，这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。
这就是限制性核酸内切酶名称中“限制”二字概念的由来。
1.1 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease1.1.1 限制性核酸内切酶的概念是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸水解酶。
它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。
到目前为止，已经分离出可识别230种不同DNA 序列的Ⅱ型限制性核酸内切酶达2300种以上。
在限制性核酸内切酶作用下，侵入细菌的“外源”DNA分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 碱基甲基化，在此修饰酶的保护下，则可免受限制性核酸内切酶的降解。
分子克隆工具酶
5、同尾酶(isocaudarner) 不同的 限制酶切割DNA产生的末端是相同的， 且是对称的，即它们可产生相同的黏性末端。
BamH I : G ↓ GATCC Bgl II : A ↓ GATCT
6、归位内切酶(homing endonuclease) 内含子编码的内切酶。
四、DNA末端长度对限制酶切割的影响
H in d I Haemophilus influenzae
REBASE(The Restriction Enzyme Database) New England Biolabs
3.限制与修饰系统的种类
酶分子 识别位点 切割位点
II（93%） 内切酶与甲基化酶 分子不在一起
3、非对称突出末端
许多限制酶切割DNA产生非对称突出端。当识别 序列为非对称序列时，切割的DNA产物的末端
是 不 同 的 ， 如 BbvCⅠ ， 它 的 识 别 切 割 位 点
CC↓TCAGC GGAGT↑CG
有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几
种是非对称的。如AccⅠ，它的识别切割位点如
下，GT↓AT/CGAC CATA/GC↑TG
4-6位点
限制反应与 分开的反应 甲基化反应
限制反应是 否 否需要ATP
I（1%） 三亚基双功 能酶 二分非对称
无特异性， 在识别位点 外1000bp 互斥
是
III（1%） 二亚基双功 能酶
5-7bp非对 称
在识别位点 下游2426bp 同时竞争
是
5‘内切酶 3‘内切酶
AAC(N)6GTGC和GCAC(N)6GTT序列中A的N6 位置。
4、Sss I甲基化酶，来源于原核螺原体，可使CG
序列中的C在C5位置上甲基化。
分子克隆中常用的酶
下进行。
3〕应尽量采用最佳的反应条件，包括特定的pH值、温度及离子浓
度。
2
（一）DNA聚合酶
最常用的依赖于DNA的DNA聚合酶有：
大肠杆菌DNA聚合酶 I（全酶〕(E.coli DNA polymerase I ) 大肠杆菌DNA聚合酶 I大片段 (Klenow fragment of E.coli DNA
3
Substrates required for DNA synthesis
4
Diagram of the mechanism of DNA synthesis
5
Three-dimensional structure of DNA polymerase resembles a right hand
主要用途－可用于对DNA进行测序，及通过聚合酶链式反
应对DNA分子的特定序列进行体外扩增
21
热稳定DNA聚合酶的特点
酶
厂家
最佳温度 外切核酸
/℃
酶活性
错误率 10-6
稳定性(在特定 温度的时间）
Taq
BM, Pro
7580
5’→3’
20100 97.5℃ 9min
Strat, P-E
rTth
BM, P-E 7580
RNase H (5’ →3’ and 3’ →5’ exoribonuclease)
26 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.
主要用途—用于将mRNA转录成双链cDNA。在此反应
中可用3种引物： a. 寡脱氧胸苷12～18聚体[oligo (dT)12 ～18]。
分子生物学实验技术基因操作工具酶
4.4 S1核酸酶
来源：来源于稻谷曲霉（Aspergillus oryzae） 功能：特异单链核酸内切酶 注意：对双链DNA、双链RNA和DNA-RNA杂交体
不敏感。
第四十九页，共49页
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第八页，共49页
1.2 命 名
命名原则：
• 第一个字母（大写, 斜体）： 该酶来源的微生物属名； • 第二、三个字母（小写、斜体）：微生物种名； • 若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个字母（
大写）
• 若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先后顺序 用罗马字母表示。
识别DNA特定序列，切割DNA分子
连接两个DNA分子或片段
1 制作DNA探针；2 合成cDNA第二链； 3 填补双链DNA 3`凹端；4 DNA测序。
聚合酶链式反应（PCR）
多核苷酸5`-OH磷酸化，制末端标记探针
使3`-末端加同聚物尾
降解单链DNA或RNA
在双链DNA上产生随机切口
降解RNA
补平反应，合成cDNA或制探针
高浓度dNTP 环竟下前者活性更强。
应用：标记DNA平末端或隐蔽3`末端
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3.6 T7 DNA聚合酶
活性：5`→3`聚合酶活性；有单链及双链的3`→5`外 切酶活性，但无5`→3`外切酶活性；
特点：极佳的连续合成能力 应用： （1）用于长模板DNA的引物延伸反应； （2）通过单纯延伸或取代合成途径标记DNA 3`末端； （3）使双链DNA 5`或3`突出末端变平末端。
1.3.3 Ⅲ 型限制性内切酶
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1.3.1 Ⅰ型限制性内切酶
功能：限制、修饰 特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助
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常用工具酶简介
2 DNA ligase简介 2.1 T4 DNA ligase
连接类型： DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA dsDNA的黏性末端和平末端
2.2 大肠杆菌 DNA ligase
dsDNA的黏性末端和平末端
3 DNA ligase 催化连接反应的特点 3.1 需要3-OH 和5-P 3.2 需要ATP或NAD+和Mg2+为辅助因子和激活
4 第四讲 常用分子克隆工具酶简介
11、获得的成功越大，就越令人高兴 。野心 是使人 勤奋的 原因， 节制使 人枯萎 。 12、不问收获，只问耕耘。如同种树 ，先有 根茎， 再有枝 叶，尔 后花实 ，好好 劳动， 不要想 太多， 那样只 会使人 胆孝懒 惰，因 为不实 践，甚 至不接 触社会 ，难道 你是野 人。(名 言网) 13、不怕，不悔(虽然只有四个字，但 常看常 新。 14、我在心里默默地为每一个人祝福 。我爱 自己， 我用清 洁与节 制来珍 惜我的 身体， 我用智 慧和知 识充实 我的头 脑。 15、这世上的一切都借希望而完成。 农夫不 会播下 一粒玉 米，如 果他不 曾希望 它长成 种籽； 单身汉 不会娶 妻，如 果他不 曾希望 有小孩 ；商人 或手艺 人不会 工作， 如果他 不曾希 望因此 而有收 益。-- 马钉路 德。
1.1 Ecoli DNA polymerase I 分类：
DNA pol I DNA pol Ⅱ DNA pol Ⅲ
DNA pol I特性： ⑴ 5‘-3’DNA聚合酶活性 ⑵ 3‘-5’外切酶活性 ⑶ 5‘-3’外切酶活性 （切口平移）
DNase I 作用特点
Mn2+存在时
Mg2+存在时
DNaseI与 HO P Pol I 的 切口移位
按照酶对底物二级结构的专一性，分为： 作用于单链的外切核酸酶 作用于双链的外切核酸酶
第五节 单链内切核酸酶
1.1 S1核酸酶
特点： ss-DNA; ss-RNA; 双螺旋变性区 用途
1) 基因突变--缺失，常与外切酶，如ExoIII、 λ外切酶、Bal31连用
2) DNA定序分析 3) S1作图法 4) 基因结构分析 5) tRNA结构分析
因子
3.3 被连接的是dsDNA 3.4 只能封闭缺口
4 影响DNA ligase 连接反应的因素
4.1 温度
黏性末端 4-15℃
平末端
10-20℃
4.2 连接酶浓度
平末端
1-2个单位
黏性末端 0.1个单位
4.3 ATP浓度 4.4 DNA片段末端
第二节 DNA 聚合酶和反转录酶
DNA 聚合酶：在引物和模板的存在下，
1.2 T4 多聚核苷酸激酶 催化反应： 正向反应 催化5‘-OH末端的磷酸化
交换反应
5’ P 3’HO
OH 3’
[γ-32P]ATP
P 5’
5’ 32P 3’ HO
OH 3’
ATP
32P 5’
1.2 T4 多聚核苷酸激酶
用途： 1) DNA或RNA的5’末端标记 2) 分子克隆过程中以获得5’-磷酸基末端，
把脱氧核糖单核苷酸连续地加到双链 DNA分子引物链的3′-OH 末端，催化 核苷酸的聚合作用。
1 DNA polymerase分类
依赖于DNA的DNA聚合酶:
Ecoli DNA polymerase I
klenow片段
T4 phage DNA ploymerase
T7 phage DNA ploymerase 耐热DNA聚合酶(Taq 酶) 依赖于RNA的DNA聚合酶: 反转录酶(reverse transcriptase)
5'
S1核酸酶活性
5' 5'
ExoIII 5' S1
S1Байду номын сангаас
Poly(A) S1
Poly(A) S1 5'
S1
S1 5'
1.2 Bal 31 核酸酶
对单链DNA具有特异的内切酶活性，可 从3‘OH端降解DNA。对于L-DNA，它表现 3’-5‘的外切酶活性和5’-3‘的外切酶活性，可 又有控制地从3’端和5‘端逐个水解除去单核 苷酸，产生缩短了的DNA分子。
-32PdNTP
Klenow 酶
3’ 3’
5’ 5’~~-------
1.3 T4 DNA polymerase
特点：
5’→3’聚合酶活性 3’→5’外切酶活性
外切酶活性 无dNTP
聚合酶活性 dNTP
用途： ⑴补平反应 ⑵末端标记 ⑶抹平反应
1.4 Taq DNA polymerase
特点：
1.5 反转录酶(reverse transcripase) 用途：
⑴ cDNA第一链的合成 ⑵补平反应 ⑶用于DNA测序
第三节 DNA修饰酶
1.1 末端转移酶（TdT）
⑴ 反应特点
在酶的催化下将dNTP加到DNA分子的3‘OH末 端，催化作用不需要模板。
⑵ 用途
3’-加尾，便于两DNA分子重组 3’-末端标记
便于连接酶反应
1.3 碱性磷酸酶
用途
1) 载体DNA的去磷酸化，防止自我连接，以增加 重组频率
2) 5’端 核酸末端标记
碱性磷酸酶与T4 多聚核苷酸激酶活性
5’ P 3’HO
OH3’
I
P 5’
5’HO 3’HO
OH3’ OH5’
5’ P
II
3’HO
OH 3’ P 5’
第四节 外切核酸酶
1 外切核酸酶概念 2 分类
分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应 温度75-80℃ 。
5’-3’聚合酶活性 5‘-3’外切酶活性
用途：
主要用于DNA的体外扩增
5’ 3’
5’
5’ 3’ 3’
Taq Pol 和PCR
3’ 变性 5’
5’
3’
3’
5’
3’ 5’ 引物 3’
延伸 5’
5’
3’
3’ 引物 5’ 复性
3’ 5’ 3’ 5’
cDNA第二链合成
mRNA 3’-UGCAACGUUUGAC…..5’ c DNA 5’-ACGTTGCAAACTG
GAC
5’ 3’ 5’
5’ ~~ 5’
5’ ---------~~ 5’
3’ 5’
热变性
3’ 3’
5’
随机引物 ~~~~~~ ~~~~~~ ~~~~~~ ~~~~~~
退火
3’ 3’
5’~~ 5’
5’ 3’ 5’ 3’
DNaseI Pol I
5’ 3’
1.2 Klenow片段 大肠杆菌DNA聚合酶I的枯草杆菌
蛋白酶水解产物。
活性：5’ 3’聚合酶 3’ 5’外切酶
用途：
⑴ 3’-末端补平 ⑵ 3’-末端抹平 ⑶ cDNA第二链合成 ⑷ 双脱氧系统测序
3’-末端补齐 3’-末端标记
5’-ACGTTGCAAACTG-3’ 3’-TGCAACGTTTGAC…..5’