骨髓间充质干细胞的分离与培养

合集下载

兔骨髓间充质干细胞的分离、体外培养、成骨诱导与鉴定

（广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科，广西南宁５３００２１）
摘要：目的建立一种兔骨髓间充质干细（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌ１．ＭＳＣ）体外分离培养、扩增及鉴定的方法。方法采用全骨髓贴壁培养法分离
原代和传代培养的ｒＢＭＳＣｓ具有活跃的增殖能力，成骨成脂诱导后，碱性磷酸酶染色、茜素红染色、ｖｏｎＫｏｓｓａ法染色、Ｉ型胶原免疫细胞化学
检测和油红。染色均呈阳性。成骨诱导电镜检测呈阳性。结论全骨髓贴壁培养法操作相对简单，可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞，
ＭｅｔｈｏｄｓＢＭＳＣｓｆｒｏｍｒａｂｂｉｔｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄ，ｃｕｌｔｕｒｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｔｈｅｗｈｏｌｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗａｄｈｅｒｅｎｃｅｍｅｔｈｏｄ，ＴｈｅｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒＰｈｓｅａ — ｃｏｎｔｒａｓｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅａｎｄｔｈｅｇｒｏｗｔｈｃｕｖｅｒｏｆｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｗａｓｄｒａｗｎａｃｃｏｒｄｉｎｇｌｙ．ＢＭＳＣｓｗｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｏｓｔｅｏｂｌｓｔａｓａｎｄａｄｉｐｏｃｙｔｅｓａｎｄｄｅｔｅｃｔｅｄＡｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔｓｅａａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｐｏｉｎｔｓ．ＲｅｓｕｌｔｓＢＭＳＣｓｆｒｏｍｒａｂｂｉｔｓｗｅｒｅｓｐｉｎｄｌｅｃｅｌｌ — ｂａｓｅｄ，ｓｈｏｗｉｎｇｒａｄｉａｌｃｏｌ Байду номын сангаас ｎｙａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ．Ｔｈｅｒｏｇｔｈｗｃｕｒｖｅｗｅｒｅｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ￣；ｉｔｈｔｈｅｒｏｇｗｔｈｃｈａｒａｃｔｅｉｓｒｔｉｃｓａｎｄｇｏｏｄａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｎｏｒｍａｌｃｅｌｌｓ．Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ｏｉｌｒｅｄＯ

小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定

小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【摘要】目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征.方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073 g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养.进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原.结果新分离的MSCs呈小圆形,形态规整.培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形.P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型.P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期.P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性.结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs.培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究.%Objective To explore a new method for the isolation, cultivaton, purification and identification of MSCs and observe the biological features of mice MSCs in vitro. Methods Bone marrow was extracted from the tibia and thighbone of mice. The marrow liquid were isolated with 1. 073 g/ml ocrcoll. MSCs were obtained by removing the non-adherent cells. Then the MSCs were purified and expanded through passage in time. The growth curve was drawn and the morphology was observed. Cell cycle and the antigen expression of P3 MSCs were measured with FACS. Results The MSCs exhibited a small round shape after fresh separation. After cultivated and passaged,the MSCs were homogcnenously fusiform shaped. The growth curves of P1 ,P2 and P3MSCs were "S" shape. The cells of G0-G1 stage account for 75. 27%. The expression of CD 44 was positive, while the expression of CD34 was negative. Conclusion The method of density gradient centrifugation combined with adherent culture could isolate MSCs from bone marrow simplcly. DMEM-LG medium supplemented with 15% fetal bovine scrum is suitable for the culture of MSCs. The cultured MSCs lineage is stable and can be used for further research.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)001【总页数】3页(P11-13)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;鉴定;小鼠【作者】赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【作者单位】吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院普外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;中日联谊医院【正文语种】中文【中图分类】Q78骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干细胞（HSCs）外的另一类干细胞。

骨髓间充质细胞的提纯和分离、增殖

骨髓间充质干细胞分离及条件培养基在其培养扩增中的作用摘要：【目的】建立一种简便、快速、实用的大鼠骨髓间充质干细胞(mesenehymal stem cells，MSCs)体外分离、纯化和扩增的方法。

【方法】采用贴壁法分离纯化大鼠骨髓MSCs(rMSCs)，并对其形态学特征进行观察，培养时观察条件培养基对rMSCs生长的影响。

【结果】贴壁法能有效地分离rMSCs，采用条件培养液培养，细胞活力好，增殖能力强，对维持细胞正常形态有着重要作用。

【结论】贴壁分离法能成功地进行rMSCs的体外分离，采用爷件培养液建立的rMSCs培养方法有效可行。

关键词：骨髓问充质干细胞／分离和提纯；细胞培养骨髓间充质干细胞(MSCs)是一种成体干细胞，具有较强的可塑性，能被诱导分化为成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、成肌细胞等⋯1，同时发现MSCs还具有独特的免疫调节作用[2-4J。

细胞学、组织学及器官学的研究者均把目光投向MSCs，同时MSCs也受到药理研究者的关注。

MSCs除了可作为组织工程较理想的种子细胞外，也可作为药物作用的靶标或药理研究的工具，利用MSCs体内外生物学性质进行中药作用机理的研究已有众多报道I 。

但由于骨髓中的MSCs含量很低，1 个骨髓单核细胞中仅含有1～2个MSCs~11 J，加之MSCs主要存在于骨内膜_】，要获得满足药物研究所需的数量比较困难。

因此，采用合适的MSCs分离、纯化和扩增的方法是许多研究的重要前提。

1 材料与方法1．1 动物Sprague Dawley(SD)大鼠，性别不限，体质量100～120 g，本校实验动物中心提供，合格证号为SCXK (粤)2003．0001。

1，2 主要试剂低糖Dulbeceo改进的Eagle培养基(1ow glucose Dulbecco’s Modified Ea e Medium，LDMEM)由GIBCO 公司提供；胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)由杭州四季青生物工程材料有限公司提供；2．5 g／L胰酶(含0．2 g／L EDTA)由吉诺生物医药技术有限公司提供；HEPES为Sigma产品，广州威佳公司分装；青霉素、链霉素由华北制药有限公司提供；兔抗大鼠CD44、CD54、I 型胶原抗体，生物素化抗生蛋白链菌素复合(Streptavidin．Biotin．Complex，SABC)试剂盒，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒均由武汉博士德公司提供。

临床研究用人间充质干细胞质量评价

临床研究用人间充质干细胞质量评价一、引言人间充质干细胞（MSCs）由于其多向分化潜能、免疫调节特性以及易于体外培养等特点，被广泛用于临床研究。

在众多疾病的治疗中，MSCs 都展现出了巨大的潜力。

然而，要确保其在临床研究中的有效性，首先需要对MSCs的质量进行严格控制和评价。

本文将探讨如何评价临床研究用MSCs的质量。

二、MSCs的质量评价标准1、细胞的纯度和活性：这是MSCs质量评价的核心指标。

纯度是指MSCs中目标细胞的比例，而活性则是指MSCs的增殖能力和分化能力。

2、细胞的遗传稳定性：通过基因测序等方法，可以检测MSCs是否存在基因突变，以及是否存在潜在的致癌风险。

3、细胞的免疫调节特性：MSCs具有免疫调节特性，可以通过抑制免疫反应来降低排斥反应的风险。

因此，评价MSCs的免疫调节特性也是非常重要的。

4、细胞的来源和生产过程：MSCs的来源和生产过程也会对其质量产生影响。

例如，来自患者的自身MSCs可能比来自捐献者的MSCs更适合用于治疗。

同时，生产过程中的质量控制，如无菌操作、细胞培养基的质量等，也会影响MSCs的质量。

三、MSCs质量评价的方法1、细胞形态观察：通过观察MSCs的形态，可以初步判断其是否具有正常的形态学特征。

2、生长曲线测定：通过绘制MSCs的生长曲线，可以评估其增殖能力。

3、细胞表面标志物检测：通过检测细胞表面标志物，可以确定MSCs 的纯度和活性。

4、染色体核型分析：通过染色体核型分析，可以评估MSCs的遗传稳定性。

5、免疫调节特性检测：通过检测MSCs对免疫反应的调节作用，可以评估其免疫调节特性。

6、生产过程质量控制：通过监控生产过程中的关键控制点，可以确保MSCs的生产过程符合质量标准。

四、结论人间充质干细胞（MSCs）在临床研究中的应用前景广阔，但其质量评价是关键环节。

通过对MSCs的纯度、活性、遗传稳定性、免疫调节特性以及生产过程的质量控制等多方面的评价，可以确保其满足临床研究的需求。

骨髓间充质干细胞的分离与培养：本刊中文部

７建立大鼠骨髓间充质千细胞稳定分离培养
体系与鉴定
２密度梯度离心与贴壁筛选法体外分离培养胎儿骨髓间充质干细胞
杨丽（暨南大学药学院中药学教研室，广东省广
州市５１６３）０２
王美华（解放军军事医学科学院附属医院消化
ｄｉ０３６／ｉｎ６３８２．００６３ｏｌ９９ｓ．７ —２５１．．９：ｊｓ１２００
中图分类号：３４２文献标识码：Ｒ９Ｂ文章编号：６３８２（０００ —１３・４１７ —２５２１）６０４０１
■ｒ－ ●一
ｌｌＳ盟避Ｏ：
１３／２１５９Ｒ００年皈权归《国组织Ｉ程研究与临来索复》杂志社昕有中
湖南省科技厅科技计划资－０ｓ３２ —）￣（６ｋ０９２
ห้องสมุดไป่ตู้
骨髓间充质干细胞的分离与培养：本刊中文部
１改良小鼠骨髓问充质干细胞培养方法及长效荧光标记的可行性
异性磷脂酶Ｄ的活性与ｍＲＡ变化一致，Ｎ
其表达水平与急性白血病类型及急性髓系白
血病患者有无肝脾和，淋巴结肿大有关。或
摘要
背景：据作者查新检索，国内外有关急性白血病骨髓单个核细胞糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶Ｄ活性及ｍＲＡ表达与白血病类Ｎ型、患者肝脾淋巴结肿大关系的报道罕见。

原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法

原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛应用于组织工程、再生医学等领域。

原代骨髓间充质干细胞的分离和提取是进行相关研究的基础。

本文将详细介绍原代骨髓间充质干细胞的分离及提取方法。

一、实验材料1.骨髓样本：取自健康志愿者或实验动物（如大鼠、小鼠等）。

2.PBS缓冲液：磷酸盐缓冲液，用于细胞洗涤和分离。

3.胎牛血清：用于细胞培养。

4.抗生素：如青霉素和链霉素，用于细胞培养液中，防止细菌感染。

5.细胞分离液：如Ficoll分离液、Percoll分离液等。

6.细胞培养瓶、离心管、移液器等实验室常用器材。

二、分离方法1.骨髓样本采集：在无菌条件下，从志愿者或实验动物体内抽取骨髓，置于含有抗凝剂的离心管中。

2.骨髓细胞分离：将骨髓样本用PBS缓冲液稀释，然后缓慢加入细胞分离液，进行密度梯度离心。

离心后，收集界面层的细胞，即含有骨髓间充质干细胞的一层。

3.细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的分离液和红细胞。

4.细胞计数：用细胞计数板对洗涤后的细胞进行计数，调整细胞浓度为合适的值。

5.细胞接种：将细胞接种于含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。

三、提取方法1.原代培养：将分离得到的骨髓间充质干细胞进行原代培养，待细胞生长至80%-90%汇合时，进行传代。

2.传代培养：将原代细胞用胰蛋白酶消化，然后按照1:2或1:3的比例进行传代。

传代后的细胞继续培养至所需细胞量。

3.细胞冻存：将提取得到的骨髓间充质干细胞进行冻存，以备后续实验使用。

4.细胞复苏：将冻存的细胞在37℃水浴中快速融化，然后用细胞培养液重悬，继续培养。

四、注意事项1.在实验过程中，严格遵循无菌操作原则，防止细胞污染。

2.骨髓样本的采集和处理应在抗凝条件下进行，以保持细胞活性。

3.选择合适的细胞分离液和离心条件，以提高骨髓间充质干细胞的分离纯度。

间充质干细胞分离及培养方案

小鼠间充质干细胞原代细胞分离及培养方案
取小鼠（C57）两只，脱颈（大镊子卡住颈部）窒息而死，75%酒精在平皿中完全浸泡10分钟
无菌条件下脱皮，取出双侧股骨，胫骨，弘骨，除去肌肉和骨膜
用含1%双抗（青霉素+链霉素）的Hanks’液冲洗三次（无菌操作）
用剪刀剪去股骨，胫骨，弘骨的骨骺端，露出骨髓腔（无菌操作）
0.5毫升的重悬细胞液+4.5毫升4%的冰乙酸（对细胞液10倍稀释，分解红细胞），进行细胞计数，根据细胞数再确定稀释倍数
以1x107的浓度进行接种与培养瓶（塑料，带透气），37℃，5%CO2培养，48小时后换液，之后每两天换液一次
用不含双抗的M199培养基5毫升冲出骨髓，再吸取培养液继续冲洗，直至骨髓腔发白为止（无菌操作）
用纱布（两层纱布）在漏斗中进行细胞液的过滤，过滤到100毫小瓶子中（无菌操作）
将细胞液分到10毫升的离心管，1000转离心10分钟（无菌操作）
10毫升的M199培养基（不含双抗）对离心后的细胞进行重悬，吹打细胞时要轻（无菌操作）

骨髓间充质干细胞培养方法大全

一、四种方法简介及优缺点：骨髓间充质干细胞主要有4种体外分离方法：贴壁筛选法，密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。

贴壁筛选法是利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除的一种简单易行的培养MSCS的方法。

贴壁分离培养法分离的MSCS能在体外培养条件下生长良好、可连续传代，体外培养扩增能力较强，其缺点是细胞纯度较低。

此方法简便，冲出骨髓直接培养，然后利用骨髓MSCS 贴壁生长特性，更换培养液逐步去处漂浮生长的造血系细胞即可获得较纯化的MSCS；而且骨髓中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质，可促进MSCS 贴壁生长，因此全骨髓贴壁法更为可取。

密度梯度离心法梯度离心法的核心主要是基于密度梯度离心技术。

梯度离心法是根据骨髓中细胞成分的比重不同，使用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，再进行贴壁培养，从而达到分离、纯化MSCS的目的。

Pittenger等的研究发现通过密度梯度离心分离培养的间充质干细胞在第一代时纯度可以达到95%。

常用的分离方法免疫磁珠法，是利用免疫学的技术分离MSCS，分离细胞的纯度高。

Phinney 用一种免疫耗损技术精确地将造血细胞系和内皮细胞系从基质细胞中分离出来，提供了一种能高效的分离纯化间充质干细胞的方法，但目前仍未筛选到真正特异性的细胞表面标记;而且，这两种分离方法的操作对细胞活性都有较大影响，造成MSCS损伤，出现增殖缓慢等问题，这些技术问题很大程度上限制了这两种方法的应用。

因此，如何能简便高效地获得均质性的间充质干细胞和细胞群仍需要继续探索。

分离细疫磁珠分离和流式细胞仪筛选的方法，不仅对细胞活性影响较大，而且操作复杂，价格昂贵。

然而，这些纯化间充质干细胞的方法比较复杂，一般仅限于在各自的实验室应用。

二、具体实验流程1. 免疫磁珠法分离纯化骨髓间充质干细胞：1 实验动物Sd大鼠2 试剂和仪器BSA、荧光标记小鼠抗体x、PE磁珠试剂盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分离器及MS分离柱。

骨髓间充质干细胞分离培养鉴定方法

骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离培养鉴定方法主要包括以下步骤：**一、分离方法**1. **差速贴壁法**：利用BMSCs与骨髓中其他细胞的贴壁性能差异及酶消化敏感性差异进行分离。

这种方法快速、简单、经济，但细胞纯度可能相对较低。

2. **密度梯度离心法**：基于骨髓中不同细胞的大小和密度差异进行分选。

通过流式细胞术检测，细胞表面抗原表达CD105，CD73和CD90必须≥95%，同时表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α，或CD19和HLA － DＲ必须≤2%。

**二、培养方法**培养BMSCs的难点在于保持细胞活性。

不同种属来源的BMSCs在体外培养扩增方法基本相似，但细微的营养条件、培养环境等差异都将会对细胞性能产生影响。

**三、鉴定方法**1. **细胞形态学观察**：利用组织块贴壁法、酶消化法或其结合来分离MSC，并通过传代培养进行形态学观察。

几乎所有的MSC都是贴壁生长，具有较强的贴壁能力。

MSC多数呈纤维细胞样生长，少量呈梭形或不规则三角形。

2. **表面标志物鉴定**：采用流式细胞仪对MSC的细胞表型进行鉴定。

MSC的表面抗原具有非专一性，可以同时表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，如粘附因子、生长因子和细胞因子受体以及整合素家族等。

MSC的细胞表面标志物鉴定标准为：CD105、CD73和CD90的阳性率≥90%；而CD45、CD34、CD14、CD19和HLA-DR 呈阴性，阳性率≤5%。

综上所述，骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定是一个复杂的过程，涉及多个步骤和专业的技术操作。

在进行这些操作时，需要严格遵守实验规程，确保实验的准确性和安全性。

同时，对实验结果的解读也需要具备一定的专业知识和技能。

兔骨髓间充质干细胞的分离

3000rpm×30 min离心，小心吸取中间白膜层，DMEM 洗涤2次，接种于含 15%FBS的低糖完全培养基中
二、全骨髓培养法
• 制备细胞悬液同前，将所收集的细胞悬液用200 目滤网过滤, 制备成单细胞悬液,1000rpm×5min 洗涤2 次, 弃上清液, 取沉淀重新悬浮后, 接种于含 15% FBS 的培养液中
兔骨髓间充质干细胞的分离
密度梯度离心法全骨髓培养法
一、密度梯度离心法
超酒精棉球、保鲜膜、打火机、手术包、percoll分离液、培养基、培养瓶等
• 取生后21天新西兰大白兔1只（兰州大学动物房提供），重约0.3kg
水淹法处死后, 放入75% 的酒精内浸泡15 min。无菌条件下取出双侧股骨、胫骨、肱骨，去除附带组织,浸入生理盐水中清洗2次
无菌间内，超净台上，将长骨从中间剪断。此方法优点： 1.可最大量提取出干骺端干细胞（丁香园提示干细胞大量存在于干骺端） 2.操作简便，只需剪开一次
• 以10ml 注射器吸取无血清低糖DMEM 培养液反复冲洗, 以骨头发白为准,4号针头反复抽吸制备成单细胞悬液,装入两离心管中以 1000rpm×5min离心，去除上清， DMEM 重悬，轻铺于等量的密度1.073g/ml Percol 分离液上（5ml:5ml）

骨髓间充质干细胞的分离纯化与鉴定

骨髓间充质干细胞的分离纯化与鉴定骨髓间充质干细胞是一类非常重要的细胞种类，它们具有广泛的应用前景，主要用于组织工程、再生医学和免疫治疗等领域。

然而，要在这些应用中实现骨髓间充质干细胞的有效利用，就必须先进行骨髓间充质干细胞的分离纯化与鉴定，以保证获取的细胞具有较大的纯度和生物活性。

骨髓间充质干细胞的分离纯化骨髓间充质干细胞的分离纯化方法主要包括直接培养法、贴壁法、悬浮式培养法等。

其中，直接培养法是一种直接将骨髓细胞培养在培养皿中的方法，通过贴壁式培养，使不同种类的细胞在培养皿上生长，最终使骨髓间充质干细胞附着在培养皿底部，其他细胞则浮于培养液中，从而达到分离骨髓间充质干细胞的目的。

贴壁法则是利用骨髓间充质干细胞具有较好的贴壁性质，将其分离于不贴壁的其他细胞种类中，一般会在6~8小时内附着于培养皿的底部，形成典型的纤维形状。

悬浮式培养法则是将骨髓间充质干细胞分散在培养液中悬浮生长，并加入一些特定因子，使其在悬浮状态下生长和增殖，最终达到分离目的。

骨髓间充质干细胞的鉴定骨髓间充质干细胞的鉴定是指对所分离的骨髓间充质干细胞进行鉴定和确认。

其主要包括形态学、生物学、遗传学和免疫学等多个方面的检测方法。

形态学方面的检测方法主要是通过显微镜观察骨髓间充质干细胞的形态、生长状态和细胞密度等指标进行判断。

生物学方面的检测方法主要包括蛋白质组学、基因组学、代谢学等多个层面的检测指标，以确定其代谢状态、生长状态、分化能力和功能表达等信息。

骨髓间充质干细胞在临床应用中的应用前景骨髓间充质干细胞广泛应用于组织工程、再生医学和免疫治疗等领域。

其中，在组织工程领域，骨髓间充质干细胞可用于修复或重建骨组织、肌肉组织、软骨组织等，并可通过工程化的方法向特定的细胞类型分化，以进一步提高治疗效果。

在再生医学领域，骨髓间充质干细胞可以通过再生医学的手段，促进身体的再生或再生，重建病变组织或器官等。

在免疫治疗领域，骨髓间充质干细胞可以作为免疫干预剂，通过调节机体免疫状态，对肿瘤、自身免疫性疾病等疾病产生治疗效果。

小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3[导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。

林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 )( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 )( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 )【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。

方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。

结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。

传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。

传至10代仍具有良好的增殖活性。

流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。

结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。

【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。

大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)的分离、鉴定与培养

大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定材料试剂(一)主要设备和产地1.手术器械上海手术器械厂2.台式水平离心机Eppendorf，5810R德国3.Nanopure超纯水仪日本SANYO公司4.AA一200型电子天平美国Denver Instrumol/Lent公司5.低温高速离心机ThermoForma公司6.90一2型磁力搅拌器上海沪西分析仪器厂7.电动匀速垂直转轮上海沪西分析仪器厂8.微量移液枪德国Eppendorf公司9.烧杯、容量瓶上海实生公司10.全自动酶标光度仪美国Bio-Rad公司11.6cm/10cm细胞培养皿美国Conring12.2mL冻存管、细胞冷冻储存器美国Conring13.低温高速离心机ThermoForma公司产品14.YJ-875超净工作台苏州工业园区三兴净化科技有限公司15.C02培养箱3111型美国Thermo Forma公司16.CK40-F200型倒置显微镜日本Olympus公司17.10ml注射器美国BD公司(二)试剂和材料1.谷氨酰胺(L-Glutamine)美国Hyclone公司2.75%消毒酒精上海生工3.肝素美国sigma公司4.胰蛋白酶美国Amresco公司5.胎牛血清美国Gibco公司6.α-MEM培养液美国Hyclone公司7.5-6周龄SD大鼠上海斯莱克实验动物有限公司8.Percoll细胞分离液美国GE公司9.DMSO(细胞培养级)美国Sigma公司Rat BMSC的分离与培养分离颈椎脱臼法处死大鼠，75%酒精中浸泡5分钟，超级工作台内依次取下大鼠两条胫骨及两条股骨。

用手术器械将长骨上附着的肌肉组织尽量去除干净，整个过程保持无菌。

用剪刀剪去长骨两端，10ml注射器吸取加入肝素的完全培养液（10%FBSα-MEM），从长骨一端开口处注入，将骨髓腔内的细胞出入到50ml离心管内，直至长骨冲洗的发白，认为骨髓腔内的细胞都被吹入离心管内。

大鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养

４ｈ８时观察贴壁细胞以分散方式和克隆方式生长，以后克隆逐渐增大，首次传代的细胞为成纤维细胞样细胞。经过２３￣次传代培养，细胞融合生长时，呈放射状或旋涡状生长。２．２骨髓间充质干细胞的形态４ｈ８换液后，倒置显微镜观察，贴壁细胞约有６％的细胞呈梭形、０多边形、星形，这３细胞梭形细胞最多，传代１２后贴壁细胞分布种￣ｄ均匀细胞形态以梭形为主。
１．．１实验动物１
１２￣个月龄Ｓ大鼠一只，Ｄ体质量８￣０ｇ０１０，泸州医学院实验动物中
心提供。
１．．２主要试剂１ＤＭＥＭ高糖培养基（ＩＣ公司），０２％胰酶（ＩＣＧＢＯ．５ＧＢＯ公司），胎牛血清（ｙｌｅ司）。ＨＣｏ公ｎ１．．３主要仪器１
细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等中胚层细胞分化。【关键词】间充质干细胞；骨髓；培养；Ｓ大鼠Ｄ
中图分类号：Ｑ６４２
文献标识码：Ｂ源自文章编号：１７－１４（０２１０８— ２６１８２１）２— ｏ６０９
版）００４４：７ —３８，１，（）１４１５．２０６
ｐｏｉｒｔｎＪＪｉｌｈｍ，０，８（５：１ —９６ｒｌｅｉ［．Ｂｏｅ２９４１）９７９２．ｆａｏ］Ｃ０２９［】ＳａｋｅｎＭ， ’ ｅｌＬ，ｕｅａｄＫ，．ａｅｃｔｎ９ｈｃｌｔＯＲｉｙＡＳｔｒｎＤｅａＩｉｄａｔｉｏｌｈｌｔ１ｍｐｒｌａｏ

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及肝内示踪

学院动物伦理委员会的标志和规定，察１周后正观常的新西兰大白兔用于试验研究。
１２方法．
作用提供依据。但这些方法也存在一定的缺陷，如
Ｙ染色体只能应用于不同性别间细胞移植的探查，而绿色荧光蛋白（ｒｅｌｒｓｅｅｒｔｉ，ＧＦｇｅｎｆｅｃｎｅｐｏｅｎｕＰ）
养基，光共聚焦显微镜（ｅｓＳ５０ — 激Ｚｉ，ＬＭ１５ＭＥｓ
ＴＡ）下进行观察。
１２５兔急性／急性肝功能衰竭模型的建立及．．亚
ＭＳｓ的移植Ｃ
１２只新西兰成年大白兔（５只，雌雄
自体取材，体外扩增，具有良好的可塑性也不涉及伦理争议，组织工程和细胞治疗的理想种源细胞。是
ＭＳｓＣ在体外可分化为脂肪、骨、骨等中胚层的成软
踪其在肝损伤兔受体肝组织内的分布和整合，一进
７只）兔耳缘静脉注射Ｄ．基半乳糖２５ｍｍｏ／，氨．ｌｋ，造急性／ｇ建亚急性肝功能衰竭模型。２耳缘４ｈ后静脉内注射０１ｍＬＭＳＳ细胞液，度为１０／．Ｃ浓 ×１
ｍｉ￣５ｍｉ，ｎｎ待消化基本完全，轻轻利用移液管收集
生产，由中国科学院昆明动物研究所惠赠，病毒滴度
． ×ｌＵ／以不同ＭＯＩ（毒数／值病细胞Ａｌｒｈ公司）塑料培养瓶， — Ｍ＋１／为４８０ＴｍＬ）ｄｉｃ的ａＭＥ０ｍＬＬ数）添加到培养基中，ＭＳｓ培养８，新鲜培与Ｃ共ｈ换ＦＳＢ＋青链双抗（ｉｍａＡｌｒｈ公司）在３ ℃ 、Ｓｇ — ｄｉｃ，７体积分数为５Ｃ：培养箱（ｅｍｏＦｒＯＴｈｒｏｍａ公司）中培养。倒置显微镜（ｋｎＥＩＳＮｉｏＣＬＰＥ公司）每天下观察细胞生长情况并记录。１ｄ后半换液去除未贴壁细胞的同时并去除未贴壁细胞。待细胞汇合至

兔骨髓间充质干细胞的分离培养

Ｐｒｐｒｔｏｎｌｉａｉｎｏｂｉｎａｒｗ— ｅｉｅｅａａｉｎａｄＣｕｔｖｔｏｆＲａｂｔＢｏｅＭｒｏｄｒｖｄＭｅｅｈｍａｅＣｅｌｓｎｃｙｌＳｔｍｌｓ
ＹＡＮＹｉｇｙｎＺＡＮＧｉｇｆｎ，ａ — ＷＡＮＧｎｚｕｎｎ — ｉｇ ’ Ｈ，Ｊｎ —ａｇＨＥＸｉｏｅ，Ｘｉ—ｈａｇ＇
பைடு நூலகம்
摘要：为探讨体外分离及培养扩增兔骨髓间充质干细胞（Ｃ）ＭＳｓ的方法，菌采取兔股骨，无用含２ＦＳ的ＤＭＥ培养液冲骨髓腔，０ＢＭ采用全骨髓细胞贴壁培养法对ＭＳｓ行纯化扩增，置显Ｃ进倒微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况、制细胞生长曲线。结果显示，Ｃ绘ＭＳｓ为贴壁生长
（．ｉｌｅｉａｏｌｇ，ｒｈｓ１ＡｎｍａＭｄｃｌＣｌｅＮｏｔｗｅｔＡ＆ＦＵｎｖｒｉｙＹａｇｉｇ７１０Ｃｉａｅｉｅｓｔ，ｎｌ２，ｈｎｎ１０
２ＣｌｇｆＡｎｍａｓａｄｙａｄＶｅｅｉａｙＭｅｉｉｅＨｅａｒｕｔｒｌＵｎｖｒｉ，ｈｎｚｏ５０２Ｃｉａ．ｏｌｅｏｉｌｅＨｕｂｎｒｎｔｒｒｄｃ，ｎｎＡｇｉｌａｎｎｃｕｉｅｓｔＺｅｇｈｕ４００，ｈｎ）ｙ
Ａｂｔａｔｎｔｉｔｙ，ａｆｅｔｖｔｏｏｐｅａｅａｕｔｅｒｂｔｂｏａｒｗｅｉｅｓｒｃ：Ｉｈｓｓｕｄｎｅｆｃｉｅｍｅｈｄｔｒｐｒｎｄｃｌｕｒａｂｉｎｅｍｒｏｄｒｖｄｍｅｅｈｙｌｓｅｃｌｓ（Ｓ）ｗａｓａｌｓｄＡｆｅｈｅｓｎｃｍａｔｍｅｌＭＣｓｓｅｔｂｉｈｅ．ｔｒｔｅｆｍｕｒｒｓｅｔｄｆｏｒｂｂｔｓｗｅｅｄｉｓｃｅｒｍａｉ，ｔｒｏｗａｌｓｄＯｔｈｅｍａｒｗｓｆｕｈｅＵｔｗｉｈＤＭＥＭｄｕｕｅｓｐｔｃｃｎｄｔｏｍｅｉｍｎｄｒａｅｉｏｉｉｎ．ＴｈｅＭＳｒｎＣｓｗｅｅｅ — ｒｃｄａｄｅｐａｅｉｇｂｅｍａｒｗｄｒｎｔｃｌｕｒｉｈｅｎｘｎｄｄｂｙｕｓｎｏｎｒｏａｈｅｅｕｔｅ，ａｎｖｒｅｉｒｃｅｗａｍ — ｎｄｉｅｔｄｍｃｏｓｏｐｓｅｐｏｄｔｓｒｅｔｒｉｅａｉｎａｈｅｒｍｏｐｕｆｐｒｍａｙａｓａｅｃｌｓＴｈｅｒｓｌｌｙｅＯｏｂｅｖｈｅｐｏｌｒｔｏｎｄｔｉｒｈｏｓｏｉｒｎｄｐａｓｇｅｌ．ｆｅｕｔｓｗｓｔａＳＣｓａｅａｈｅｅｅｌｔｉｌｒｆｂｒｂｌｓｏｄｓｎｄｅｓａｄｍｏｐｈｌｙｄｕｉｇｈｏｈｔＭｒｄｒｎｔｃｌｓｗｉｈａｓｍｉａｉｏａｔｉｐｉｌ～ｈｐｅｒｏｏｇｒｎｄｉｆｒｎｐｓａｅ．Ｂｏｎｍａｒｗａｈｅｅｃｌｕｅａｂｕｓｄｏｒｄｕｃｃｒａｎｆｅｅｔａｓｇｓｅｒｏｄｒｎｔｕｔｒｃｎｅｅｔｐｏｅａｅｔｉｐｕｉｙｆｒｔｏ

骨髓间充质干细胞的分离培养和生物学鉴定

实验动物中心）。
１２方法．
１２１大鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养将．．ＳＤ大鼠处死后，菌条件下取出大鼠股骨和胫骨，无
用ＰＳ冲出骨髓，Ｂ充分混匀后，１按：２比例缓慢加在比重为１０３ｅｃｌ分离液上，０ｒｍ离心．７ｐｒｏ１２００ｐ３ｍｉ，０ｎ吸取液面交界处的单个核细胞，糖ＤＭ低ＭＥ培养液洗涤２次。将上述细胞以１ｘ１ｍｌ／密度接０种于含１％胎牛血清的ＤＭ—Ｇ培养基（ｍ谷０ＭＥＬ２Ｍ氨酰胺、Ｏｕｍ青霉素、０ｕｍｌ霉素）２ｃｌＯ／ｌ１０／链的５ｍ培养瓶中，于３ ℃ 、和湿度、％Ｃ培养箱中置７饱５Ｏ进行原代培养，培养７ｈ后首次换液，２以后每３天换
甘凤英肖丽霞，，陈彬娟叶德富，
（．１赣南医学院第一附属医院风湿免疫科；．２赣南医学院第一附属医院内分泌科，江西赣州３１０４００；３江西省莲花县人民医院，．江西莲花３７０；．３１０４福建医科大学第一附属医院风湿科，福建福州３００）５０６摘要：目的：建立体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞（Ｃ）ＭＳｓ的方法，描述ＭＳｓ的生物学特征，Ｃ探索ＭＣ作为组织工程种子细胞的可行性。方法：Ｓｓ采用密度梯度离心法结合贴壁培养法，离纯化大鼠ＭＳｓ分Ｃ。利用流式细胞仪检测细胞表面标志物ＣＩ、Ｄ９Ｃ３、Ｉ、Ｄ０Ｄ４Ｃ２、Ｄ４ＣＭ５Ｃ１５的表达率。取第４代ＭＳｓＣ进行成骨、成脂肪、成软骨诱导分化，观察细胞的形态变化情况，在诱导第１ｄ４进行茜素红染色和油红染色以检测ＭＳｓＣ是否分化成骨和脂肪细胞；在诱导第２ｄ用阿新蓝染色法检测ＭＳｓ否分化成软骨细胞。结果：骨髓分离获得的ＭＳｓ１Ｃ是从Ｃ为体积小、核浆比大、呈旋涡状生长的梭形细胞。第３代细胞表面标记物阳性率分别为Ｃ１０６％，Ｄ９Ｄ４：．７Ｃ２：９．％，Ｄ４０７％，Ｄ５０３％，Ｄ０：６３％。ＭＣ在相应的诱导条件下，化成骨、肪、４５Ｃ３：．２Ｃ４：．９Ｃ１５８．６Ｓｓ分脂软骨细胞。结论：密度梯度离心结合贴壁培养法可分离出较纯的ＭＳｓ经扩增培养后获取足够数量的ＭＳｓ能满足组织工Ｃ，Ｃ，程的需要。ＭＳｓＣ具有多向分化的潜能，可在体外诱导分化成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞，有广阔的应用前具景。关键词：骨髓问充质干细胞；软骨；；骨脂肪

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

骨髓间充质干细胞的分离与培养艾国平,粟永萍,闫国和,冉新泽,刘晓宏,罗成基,程天民(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所,重庆400038)提要:目的摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,并观察其部分生物学活性。

方法采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响,并观察培养细胞的部分生物学特性。

结果以选用4～24ｈ贴壁的有核细胞,加入5%～10%胎牛血清、种植密度(4～8)×104个/ｍｌ的培养条件为最适宜细胞生长;在此条件下,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性;其形态呈梭状,具有快速增殖的能力;培养细胞在3～4ｄ进入对数生长期,随后进入平台期,分裂相细胞明显减少;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2～10代的细胞呈均质状;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。

结论建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。

关键词:骨髓间充质干细胞;组织工程学干细胞是近年来研究的热点,骨髓中除造血干细胞以外,还含有另一类干细胞—间充质干细胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ,ＭＳＣ),在不同的诱导条件下,具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力,如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力[1,2]。

随着细胞工程学和组织工程学的发展,利用干细胞的多向分化性,选择合适的生物材料和有靶向性目的基因,已有报道ＭＳＣ在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的作用[3,4],国内在这方面的工作尚处于起步阶段。

本实验旨在摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,为进一步研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。

1材料与方法1.1骨髓ＭＳＣ的分离从胸骨无菌抽取约1～2ｍｌ的骨髓,肝素化后,加入红细胞裂解液5ｍｌ,混匀,1200ｒ/ｍｉｎ,离心10ｍｉｎ;弃上清,用0.01ｍｏｌ/Ｌ的ＰＢＳ(ｐＨ7.2)洗2～3次,1200ｒ/ｍｉｎ,各离心10ｍｉｎ;计数,以2×109/ｍｌ种入10%ＦＢＳα ＭＥＭ培养基,青霉素100Ｕ/ｍｌ、链霉素100μｇ/ｍｌ,37℃,5%ＣＯ2孵箱中培养;不同时相点弃悬浮细胞,用0.01ｍｏｌ/ＬＰＢＳ(ｐＨ7.2)尽量轻轻洗去未贴壁的细胞,加入含10%ＦＢＳα ＭＥＭ培养基。

1.2不同贴壁时间对ＭＳＣ增殖的影响选用贴壁后1、2、3、4、6、8、12、24、48、72ｈ的细胞进行传代培养,观察不同时间贴壁的细胞传代、增殖能力及形态学的变化。

1.3不同浓度胎牛血清(ＦＢＳ)对ＭＳＣ生长的影响细胞按4×104/ｍｌ种入96孔培养板中,分别加入以下ＦＢＳ浓度的α ＭＥＭ培养基:0%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%,每个浓度6孔;培养48ｈ后,加入20μｌＭＴＴ(5ｍｇ/ｍｌ二苯基四氮唑溴盐),37℃避光培养4ｈ;尽量吸掉上清液,加入150μｌ二甲基亚砜,室温振荡10ｍｉｎ,ＨＴ7000ｐｌｕｓ多孔读数仪490ｎｍ处读取Ｄ490值,以培养液作空白对照。

1.4比较不同种植密度对ＭＳＣ生长的影响用含10%ＦＢＳ的α ＭＥＭ培养基;细胞按以下密度(×104/ｍｌ):0.3、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0种入96孔培养板中,每一密度6孔;培养48ｈ后,按上述方法测其Ｄ490值。

1.5培养细胞生长曲线细胞按0.5×104/ｍｌ种入24孔培养板,每孔培养液为1ｍｌ,每天取3孔测其Ｄ490值,连续测8ｄ,绘出培养细胞生长曲线。

1.6培养细胞分裂指数曲线按检测细胞生长曲线的细胞密度接种于放有小盖玻片的24孔培养板中,每24ｈ取出3块小玻片,连续8ｄ;用95%酒精固定,ＨＥ染色、封片。

对每一时间组细胞进行计数,算出1000个细胞中分裂相细胞的百分比。

1.7ＭＳＣ的形态学观察在倒置显微镜下,直接观察第2、4、8代ＭＳＣ的活体形态;并分别用光镜及透射电镜观察其形态结构。

1.8统计学分析用哈佛统计软件,进行单因素方差分析及均数间的显著性差异检验,用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ作图。

讨论间充质干细胞来源于中胚层,具有很强的自我复制能力,能产生具有各种表型的子代细胞,在不同的诱导条件下可形成骨、软骨组织、脂肪、肌肉、肌腱以及骨髓基质结缔组织细胞等,分布在全身各结缔组织中,以骨髓和脐血中含量最为丰富。

随着组织细胞工程学和基因工程学的发展,利用ＭＳＣ的多向分化潜能,在组织工程、细胞因子替代治疗、基因治疗中以及器官移植等方面的应用研究已成为研究热点[5,6]。

由于间充质干细胞的数量少,成人骨髓平均10万个有核细胞中含有1个,并随着年龄的增加,细胞数量逐渐减少[7];生理状态下20%为静止期细胞[8]。

因此,如何摸索一个体外适宜ＭＳＣ生长扩增而又不分化的培养条件,对进一步研究ＭＳＣ生物学特性和诱导分化尤其重要。

我们利用人源性胸骨骨髓,通过离心去除抗凝骨髓血的血浆成份,经饱和ＮＨ4Ｃｌ溶液裂解红细胞,利用造血细胞悬浮生长特点,比较了不同时间贴壁细胞的生长增殖和形态的变化,认为以选用早期贴壁———4～24ｈ贴壁细胞进行培养最合适。

选用贴壁过早的细胞,因细胞数量太少,细胞生长困难;选用贴壁过长的细胞(超过48ｈ),在倒置显微镜下可见大量造血细胞粘附在贴壁细胞上面,并呈集落生长,随着培养时间的延长,贴壁细胞形态出现多样性,细胞增殖周期延长,这可能与造血细胞分泌的细胞因子促进细胞分化有关。

体外培养细胞还受培养血清的浓度、种植细胞的密度、培养的温度、培养基的ｐＨ值等等。

在选用早期贴壁细胞的基础上,比较了不同浓度的血清和不同细胞种植密度对细胞生长增殖的影响,结果显示并非血清浓度越高就能促进细胞生长,高浓度血清中由于含有大量促进细胞生长增殖分化的因子,易引起细胞增殖分化,使细胞过早出现老化,反而不利于干细胞的生长;细胞生长还受细胞与细胞之间相互作用的影响,细胞种植密度过密,会引起细胞之间的接触抑制,过稀会导致细胞之间分泌的细胞因子不足影响细胞的生长,骨髓间充质干细胞能分泌ＩＬ6、ＩＬ7、ＩＬ8、ＩＬ11、ＧＣＳＦ、ＤＳＦ、ＳＣＦ等[8]多种细胞因子,对支持造血和维持细胞生长分化十分重要。

利用本实验条件培养细胞已培养14代,原代细胞生长增殖较慢需8～10ｄ,3～10代的细胞生长周期为3～4ｄ,10代以后细胞生长速度开始减慢,细胞形态呈梭状,各代之间形态较均一;培养细胞传代后1～3ｄ进入生长滞留期,4ｄ达到对数生长期,以后进入平台期;经光镜观察细胞形态为类成纤维状,超微结构显示培养的第2、4、8代细胞,细胞核大、形状不规则呈多形性,染色质分布稀疏、电子密度较低,胞浆细胞器少,表现为早期幼稚细胞发育的特点。

我们利用此条件培养的ＭＳＣ细胞,与骨髓成纤维细胞、内皮细胞和造血干细胞比较在表型上有着明显的区别,ＭＳＣ不表达成纤维细胞、内皮细胞和造血干细胞特有的抗原如Ⅰ型胶原、Ⅷ因子和ＣＤ34+等,并在一定条件下成功地诱导ＭＳＣ向成骨细胞和成软骨细胞分化,表明ＭＳＣ仍然保持着干细胞多向分化的特点,见另文报道。

因此,作者认为利用此培养条件能达到ＭＳＣ体外扩增而又不分化的目的,为进一步研究骨髓间充质干细胞的特点和应用打下了基础。

参考文献:[1]ＰｅｒｅｉｒａＲＦ,ＨａｌｆｏｒｄＫＷ,Ｏ’ＨａｒａＭＤ,ｅｔａｌ.Ｃｕｌｔｕｒｅｄａｄｈｅｒｅｎｔｃｅｌｌｓｆｒｏｍｍａｒｒｏｗｃａｎｓｅｒｖｅａｓｌｏｎｇｌａｓｔｉｎｇｐｒｅｃｕｒｓｏｒｃｅｌｌｓｆｏｒｂｏｎｅ,ｃａｒｔｉｌａｇｅ,ａｎｄｌｕｎｇｉｎｉｒｒａｄｉａｔｅｄｍｉｃｅ[Ｊ].ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ,1995,92(11):4857-4861.[2]ＰｒｏｃｋｏｐＤＪ.Ｍａｒｒｏｗｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓａｓｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｏｒｎｏｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｔｉｓｓｕｅｓ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅ,1997,276(5309):71-74.[3]ＰｉｔｔｅｎｇｅｒＭＦ,ＭａｃｋａｙＡＭ,ＢｅｃｋＳＣ,ｅｔａｌ.Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆａｄｕｌｔｈｕｍａｎｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅ,1999,284(5411):143-147.[4]ＲｉｃｈａｒｄｓＭ,ＨｕｉｂｅｒｇｔｓｅＢＡ,ＣａｐｌａｎＡＩ,ｅｔａｌ.Ｍａｒｒｏｗｄｅｒｉｖｅｓｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｅｎｃｈａｎｃｅｎｅｗｂｏｎｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｄｉｓｔｒａｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＪＯｒｔｈｏｐＲｅｓ,1999,17:900-908.[5]ＡｗａｄＨＡ,ＢｕｔｌｅｒＤＬ,ＢｏｉｖｉｎＧＰ,ｅｔａｌ.Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｍｅｄｉａｔｅｄｒｅｐａｉｒｏｆｔｅｎｄｏｎ[Ｊ].ＴｉｓｓｕｅＥｎｇ,1999,5(3):267-277.[6]ＫｏｐｅｎＧＣ,ＰｒｏｃｋｏｐＤＪ,ＰｈｉｎｎｅｙＤＧ.Ｍａｒｒｏｗｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓｍｉｇｒａｔｅｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔｆｏｒｅｂｒａｉｎａｎｄｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ,ａｎｄｔｈｅｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏａｓｔｒｏｃｙｔｅｓａｆｔｅｒｉｎｊｅｃｔｉｏｎｎｅｏｎａｔａｌｍｏｕｓｅｂｒａｉｎｓ[Ｊ].ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ,1999,96(19):10711-10716.[7]ＯｈｇｕｓｈｉＨ,ＣａｐｌａｎＡＩ.Ｓｔｅｍｃｅｌｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄｂｉｏｃｒａｍｉｃｓ:ｆｒｏｍｃｅｌｌｔｏｇｅｎｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ[Ｊ].ＪＢｉｏｍｅｄＭａｔｅｒＲｅｓ,1999,48:913-927.[8]ＣｏｎｇｅｔＰＡ,ＭｉｎｇｕｅｌｌＪＪ.Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｈｕｍａｎｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＪＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ,1999,181(1):67-73.。