高效液相色谱内标法测定动物饲料中盐酸克伦特罗

高效液相色谱内标法测定动物饲料中盐酸克伦特罗

邸万山

【摘要】以茶碱为内标物,建立高效液相色谱内标法测定禽畜饲料中盐酸克伦特罗的检测方法.样品经三氯乙酸溶液提取,经过OasiaHLB固相萃取小柱(3mL/60 mg)处理,再用体积分数为5％的甲醇溶液冲洗后,采用Nova-Pak C18色谱柱(3.9 mm×150 mm×5 μm)分离,以乙腈-28 g/L磷酸二氢钠缓冲溶液(25∶75,V/V)为流动相进行洗脱,流速0.8 mL/min,检测波长210nm.结果表明,茶碱在该条件下能够与盐酸克伦特罗分离完全,可以作为测定盐酸克伦特罗的内标物.盐酸克伦特罗的加标回收率为97.8％～99.2％,精密度试验结果的相对标准偏差(RSD)为0.13％,表明该方法操作简单、准确度高、精密度良好,可用于饲料中盐酸克伦特罗含量分析.【期刊名称】《中国酿造》

【年(卷),期】2016(035)006

【总页数】4页(P170-173)

【关键词】高效液相色谱法;内标法;茶碱;盐酸克伦特罗;饲料

【作者】邸万山

【作者单位】辽宁石化职业技术学院应用化学系,辽宁锦州 121001

【正文语种】中文

【中图分类】TS207.3

盐酸克伦特罗（clenbuterol hydrochloride）又称咳喘素、瘦肉精，是β-肾上腺素兴奋剂，其作用机理和肾上腺素相同。当其用于家畜饲养超过治疗剂量几倍时，

可以产生瘦肉含量更高的酮体，加快肉用家畜的生长速度。1990年欧洲发生了食用残留β-兴奋剂的牛肝引起的食物中毒事件后，欧盟颁布了法规禁止β-兴奋剂作为生长促进剂使用［1］。我国农业部已明令禁止在家畜饲料中使用盐酸克伦特罗。关于饲料中β-兴奋剂的检验方法报道较多，其中液相色谱法主要以外标法测定盐

酸克伦特罗［2-3］，而用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法内标法测定饲料中盐酸克伦特罗国内外报道较少。目前国内外对盐酸克伦特罗的有效检测方法主要集中在胶体金快速检测卡法、酶联免疫（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法、高效液相色谱（HPLC）法和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，

GC-MS）法等。其中高效液相色谱法具有检出限低、动态线性范围宽、精密度高、准确度高、基体效应小、分析速度快等优点，已广泛应用于食品成分分析［4］。本研究目的在于建立高效液相色谱内标法测定饲料中盐酸克伦特罗分析检测方法。样品经三氯乙酸、甲醇提取后，采用Nova-Pak C18色谱柱（3.9 mm×150

mm×5 μm）分离，以乙腈-磷酸二氢钠为流动相进行洗脱，紫外检测波长210 nm，以茶碱为内标物对饲料中盐酸克伦特罗进行了测定，以期为饲料的质量评价提供参考依据。

1.1 材料与试剂

饲料：市售；乙腈、甲醇（均为色谱纯），磷酸二氢钠（NaH2PO4）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）、三氯乙酸（均为分析纯）：

国药集团化学试剂有限公司；盐酸克伦特罗、茶碱对照品（纯度为99.99%）：中国药品生物制品检定所；超纯水（电阻率为18.2 MΩ·cm，0.45 μm膜过滤）：

实验室自制。

1.2 仪器与设备

810型高效液相色谱仪：美国Waters公司；KQ-700DB数控超声波清洗机：昆

山市超声仪器有限公司；Milli-Q超纯水系统：美国Millipore公司；AUW120D

电子分析天平：日本岛津公司；Oasia HLB固相萃取小柱（3 mL/60 mg）：上海禾工科学仪器有限公司；TG16B台式高速离心机：盐城市凯特实验仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱检测条件

色谱柱：Nova-Pak C18（3.9 mm×150 mm×5 μm）；流动相：乙腈-28 g/L磷酸二氢钠缓冲溶液（25∶75，V/V）；流速：0.8 mL/min；进样体积：10 μL；

灵敏度：0.2 AUFS；柱温：30℃；检测波长：210 nm。

1.3.2 溶液的配制

缓冲溶液的配制：称取2.8 g NaH2PO4，加水定容至100 mL；称取2.1 g柠檬酸，加水定容至100 mL；向NaH2PO4溶液中加入柠檬酸溶液，并调节溶液

pH=4.0，再将6.1 gEDTA加入上述缓冲溶液中至完全溶解。

流动相缓冲溶液的配制：称取1.6 g NaH2PO4加水溶解至1 000 mL，加入磷酸调节至溶液pH=2.5，再加入0.4 g EDTA，溶解后过0.45 μm滤膜过滤。

1.000 0 mg/mL茶碱、盐酸克伦特罗混合标准储备溶液的配制：准确称取茶碱、盐酸克伦特罗对照品各0.100 00 g，加适量甲醇溶解，转移至100 mL容量瓶中

加甲醇定容，摇匀，超声波脱气。

10 μg/mL茶碱、盐酸克伦特罗混合标准使用溶液的配制：用移液管准确移取

1.00 mL标准储备溶液于100 mL容量瓶中，加甲醇定容，超声波脱气。

1.3.3 试样的处理

准确称取5.000 0 g试样，粉碎后置于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入25 mL 缓冲溶液，2 mL 50%三氯乙酸溶液，混匀后，7 500 r/min离心10 min，上清

液用滤纸过滤，向残渣中加入10 mL缓冲溶液，经超声波振荡提取10 min，7 500 r/min离心10 min，过滤，重复一次，合并滤液。将滤液通过预先处理好的

OasiaHLB固相萃取小柱（3 mL/60 mg），再用20 mL 5%甲醇溶液冲洗，最后用5 mL甲醇洗脱，收集解析液加入0.001 0 mg茶碱，定容至100 mL。经0.45 μm滤膜过滤，超声波脱气后供HPLC分析。

1.3.4 盐酸克伦特罗的定性分析

将茶碱、盐酸克伦特罗混合标准使用溶液及试样处理液10 μL在相同的色谱条件下分别注入高效液相色谱仪进行分析，以标准溶液色谱峰的保留时间为依据对试样处理液中的成分进行定性分析。

1.3.5 试样中盐酸克伦特罗的定量分析［5-6］

取茶碱、盐酸克伦特罗混合标准使用溶液10 μL注入高效液相色谱仪进行分析，得到茶碱、盐酸克伦特罗的峰面积，计算盐酸克伦特罗对茶碱的相应对响应值。盐酸克伦特罗对茶碱的相对响应值计算公式如下：

式中：Sa1表示盐酸克伦特罗对茶碱的相对响应值；Aa1、As分别为混合标准使用溶液中盐酸克伦特罗、茶碱的峰面积；Wa1、Ws分别为混合标准使用溶液中盐酸克伦特罗、茶碱的质量，g。

取试样处理液10 μL，注入高效液相色谱仪进行分析，得到盐酸克伦特罗、茶碱的峰面积，根据相对响应值计算试样中盐酸克伦特罗的质量。试样中盐酸克伦特罗含量的计算公式如下：

式中：W样.盐酸克伦特罗表示试样中盐酸克伦特罗的质量，g；A样.盐酸克伦特罗表示试样中盐酸克伦特罗的峰面积；W样.茶碱表示试样中茶碱的质量，g；A 样.茶碱表示试样中茶碱的峰面积；Sa1表示盐酸克伦特罗对茶碱的相对响应值；W样表示试样的质量，g；10-3表示单位换算系数。

2.1 检测波长的确定

根据参考文献［7-10］，茶碱、盐酸克伦特罗分别在波长204 nm、210 nm处有较大紫外吸收，在此基础上，在波长200～400 nm进行紫外光谱扫描，结果如图