姜黄素对酿酒酵母抗衰老性能影响

生物工程技术姜黄素对酿酒酵母抗衰老性能影响

学院（系）：生命科学学院

专业：生物工程

学生姓名：张馨予徐瑶

学号： 20161102137 20161102131 指导教师：崔京春老师

完成日期：2016年12月22日

大连民族大学

摘要：姜黄素衍生物对酵母抗衰老性能影响。在分别添加0.5g/L 4 种外源抗氧化物质的条件下培养酿酒酵母，测定不同培养时期酵母形态，絮凝速率及抗氧化酶活性。结果表明，四种姜黄素衍生物能不同程度地改善因酵母衰老而表现出的细胞变瘪和表面褶皱，并有效降低酵母絮凝速率，提高酵母胞内抗氧化酶活性，以减少胞内 O2-.含量。四种姜黄素衍生物均能降低活性氧氧化损伤，增强酵母抗衰老能力。腺嘌呤姜黄素衍生物增强酵母抗衰老能力较强，而鸟嘌呤姜黄素衍生物相对较弱。

关键词：酿酒酵母；姜黄素衍生物；抗衰老；抗氧化酶

一．背景

1.1抗氧化剂

抗氧化剂是指具有还原性，可抑制启动自由基链反应，阻止自由基反应传播并终止自由基反应的一类化合物，主要包括多酚、黄酮类化合物等。它们在机体不同的微环境和代谢调节中起到抗氧化作用，并以此广泛参与、介导机体代谢，细胞分裂，基因表达等过程，在生命活动中起着十分重要的桥梁作用。姜黄素是一种相对分子量较低的多酚类化合物，是含有多种功能基团的独特抗氧化剂，其酚基团是清除活性氧自由基所必须的，而甲氧基的存在进一步增加其抗氧化活性。姜黄素是一个自由基清除剂和氢供体,具有亲氧化剂和抗氧化剂的双重活性，是未来最具潜力的抗癌药物之一，但因其水不溶性限制了它的研究与应用，刘巨涛等人对其进行了衍生化修饰，大大改善了其水溶性。

1.2酿酒酵母

1.2.1酿酒酵母

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种常用的工业微生物生产菌，在其发酵生产中细胞衰老、絮凝、沉降，失去活力。 Harman提出的自由基学说认为，需氧生物体内不断产生超氧阴离子自由基(Super oxygen anion，O2-.)、羟基自由基、脂氧自由基等活性氧自由基，同时体内的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)和过氧化物酶(peroxidase，POD)等抗氧化酶类不断地清除上述自由基，以免除机体活性氧损伤。机体衰老时，清除自由基能力减弱，内源性自由基损伤生物分子，特别是 DNA、生物膜与蛋白质。

因此，抗氧化酶类活性及自由基水平对酵母生长及衰老有很大影响。酵母作为研究真核生物的模式生物，其抗衰老研究可进一步为真核生物的抗癌、抗衰老研究提供一定的理论参考。

1.2.2酿酒酵母衰老模式及影响因素

机体老化时，清除自由基能力下降，内源性自由基加重损伤生物分子。因此，抗氧化酶类活性及自由基水平对酵母生长及老化有很大影响。酵母中已确立的衰老模式有两种:复制型衰老和时序型衰老，分别用复制寿命和时序寿命衡量。复制寿命定义为单个母细胞在其死亡前能进行有丝分裂的次数，可以用来模拟多细胞生物的细胞衰老，测定方法是用显微操作仪将酵母细胞所出的芽移走，计算母细胞在死亡之前的出芽次数; 时序寿命则表示一定数量不分裂的酵母细胞在其稳定期的存活时间，可以模拟有丝分裂后的细胞衰老，一般是通过单菌落数的统计来确定。酿酒酵母复制衰老和时序衰老同样存在许多不同点。比如两种衰老模型所用的培养基、细胞的表型、细胞的细胞骨架、细胞壁结构和代谢都不相同。除此之外，两者的分子机制也有诸多差异。

物种最高寿期不同的决定因素，都认为基因是内在的决定因素，而有氧代谢所产生的氧自由基所造成的氧化应激是主要的外在因素。因此，笔者在酿酒酵母发酵过程中分别添加四种姜黄素衍生物：腺嘌呤、鸟嘌呤、二氯腺嘌呤、2，6-二氨基腺嘌呤姜黄素衍生物。发现它们可不同程度地提高酵母抗氧化能力，进而增强酵母抗衰老性能。

随着培养时间增加，醇母沉降逐渐加快。酵母絮凝速度加快的因素可能是由于酵母在衰老过程中由于细胞壁權皱程度增加，导致了细胞间表面粘附力增强，从而促进了细胞的聚集引起絮凝速率加快，也有可能是由于菌体在衰老过程中胞内活性氧积累，脂质过氧化加剧，导致细胞或组织损伤，从而导致细胞絮凝速率加快。所以酿酒酵母的衰老可以用絮凝速率来表达，即600nm处的吸光值。二．实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌种

酿酒酵母，大连民族大学微生物实验室提供。

2.1.2实验试剂

试剂：Tris、牛血清白蛋白、腺嘌呤、鸟嘌呤、二氯腺嘌呤、2，6-二氨基腺嘌呤；以上试剂均为分析纯。

培养基：强化 YPD 培养基：6 %葡糖糖、2 %蛋白胨、1 %酵母浸粉；四种姜黄素衍生物分别经 0.22 μm 无菌滤膜除菌后添加到 YPD 发酵培养基中。

仪器与设备：高速冷冻离心机、冷冻干燥机紫外可见分光光度计、手持糖度计、立式高压蒸汽灭菌锅、全温落地式摇床。

2.2实验方法

2.2.1培养基

固体培养基：YPD固体培养基，高温灭菌20min；

液体培养基：6%葡糖糖、2%蛋白胳、1%酵母浸粉，121℃灭菌20min

2.2.2酵母细胞培养

实验以斜面保藏的酵母经液体培养活化后，在对数生长期时按照5.0X104cfu ／mL的接种浓度分别接入到两种发酵培养基中，培养条件为28.5℃、160r／min。定时取样检测OD值及残糖，当发酵残糖低于5.0k／L时，终止发酵。

2.2.3残糖含量测定

利用手持糖度计，在每日固定时间测定发酵液的糖浓度并做好记录。

2.2.4醇母絮凝能力的测定

取经无菌水洗涤2次的酵母菌体，用生理盐水稀释至1.0-3.0X104／mL，摇匀，分装，每管20mL，室温静置，每隔30min从管中取样3ml，检测其600nm 处吸光值。悬浮细胞浓度以600nm处吸光度表示。

2.2.5抗氧化酶活性及 O2-含量的测定

SOD 酶活性的测定：邻苯三酚自氧化法。

CAT 酶活性的测定：钼酸铵比色法。

POD 酶活性的测定：愈创木酚法。

O2-.含量的测定：羟胺氧化法。

三．实验结果与讨论

3.1酿酒酵母的降糖能力及外加抗氧化物质浓度的确定

已知酿酒酵母经12h进入对数期，24h进入稳定期，216h后到达发酵终点。故本实验选取24h、72h、120h、168h、216h酵母为研究对象进行后续试验。前