拉曼光谱CHEM-2

——荧光的抑制和消除 6. 脉冲激光器。 激光照射到样品时，产生荧光和拉曼散射光的 时间不同，在10-11～10-12秒内产生拉曼散射，而 在10-7～10-9秒后荧光则才出现。这样实验上可 以利用产生拉曼散射和荧光的时间差把拉曼散 射光与荧光分离开。激光脉冲照射样品后，约 10-10秒把拉曼光谱记录下，随之关闭光谱仪的 入射狭缝或检测器的门开关，这样就把荧光“ 拒之门外”，以达到消除荧光的干扰。 7.其他方法：频率调制光谱法，交流耦合倒拉曼 光谱法，信号平均法等，亦可达到消除荧光干 扰的目的。
重水溶液 1632cm-1谱带 1谱带 0.50 0.52 0.99 0.99
1660cm-
卵清溶菌酶 核糖核酸酶
由图11.31和图11.32所得构象标志谱带相对于1 444cm-1-1 448cm-1的相对强度(见表11.9)，再由上述 方程计算，溶菌酶的-螺旋为32%，-折叠为9%，无规结构为59%。核糖核酸酶A的-螺旋结构为 14%,-折叠为35%，无规结构为51%。
激发波长（nm）
632.8 488.0，514.5 530.9，647.1 1064.0
• 半导体激光器 Ar+
• 染料激光器
Kr+
YGA 激光器
拉曼光谱的特性
• 退偏比 • 荧光的抑制和消除 • 共振 • 表面增强
－拉曼光谱的退偏比
• 液体或气体样品分子的取向是无规的。 • 自然光或线偏振的(完全偏振光) 入射光被 分子散射后产生的各个拉曼谱带则不一定 是线偏振的或非偏振的。 • 拉曼散射光的偏振性能的变化与分子构型 的对称性和简正振动模式的对称性有关。 • 为了描述拉曼谱带的偏振性能变化的程度， 引进退偏比的概念。 • 分别讨论单色入射光为自然光和线偏振光 两种不同的情况。
拉曼光谱的应用
• 拉曼光谱是研究物质结构的重要手段
• 拉曼光谱是进行分析和鉴定的优良方法 • 常用的拉曼光谱测试方法
蛋白质结构
C
C
N
N
a
b
c
C
N
C
N
d
N
e
N C
C
C
N
f
极少见到
C 酰胺平面 H N
C O C H N H 碳原子 R 侧链
C O C 酰胺平面 = 180
= 180
蛋白质各种构象的酰胺I和III谱带的位置
0.8
785 nm
FT-Raman spectra of Chocolate
0.5
0.6
0.7
top: 785 nm bottom: 1064 nm
0.2
0.3
0.4
1064 nm
3500 3000 2500 2000 1500 Wavenumber cm-1 1000 500Fra bibliotek0.1
将激发激光从可见光区移至紫外光区而 避开拉曼光谱中的荧光干扰
——荧光的抑制和消除
拉曼光谱中 荧光的抑制和消除
和荧光光谱比较
荧光光谱 拉曼跃迁
斯托克斯线 反斯托克斯线
v v v v = = = = 3 2 1 0
第一电子 激发态
电子基态
v v v v
= = = =
3 2 1 0
振动量子数
——荧光的抑制和消除
•拉曼散射光极弱，而在极端情况下荧光 的强度可以比拉曼光强106倍之多。所以 一旦样品或杂质产生荧光，拉曼光谱就 会被荧光所湮没，致使检测不到样品的 拉曼光谱信号。 •通常荧光来自样品中的杂质，但有的样 品本身也可发生荧光。
IU，IβU，IγU值 列于表11.8。
表11.8聚-L-赖氨酸的I ，IB ，IR U U U
值
构象
水溶液 1240cm-1谱带
重水溶液 1632cm-1谱带
1660cm-1谱带
螺旋 β折叠 无序结构
0.00 1.20 0.60
0.80 0.72 0.08
0.55 0.88 0.78
构象
水溶液 1240cm-1谱带 0.64 0.92
——共振拉曼散射效应
一、共振拉曼效应: 在正常的拉曼光谱实验中，使用的激发线波长远离化合物 的电子吸收光谱带。当改变激发线的波长并使之接近或者 落在化合物的电子吸收光谱带内时，某些拉曼光谱带的强 度将会大大的增强，甚至达到104－106倍。这种现象叫做 共振拉曼效应（Resonance Raman Effect）。 二、预共振拉曼散射: 它是电子态跃迁和振动态相耦合的结果。以Stocks拉曼能 级跃迁，激发线的频率（能级）和电子跃迁频率（能级） 相一致为共振拉曼散射。激发线的频率（能级）接近但还 没有超过分子的电子跃迁频率（能量）时，为预共振拉曼 散射(Preresonance Raman Scatter)。
表11.9相对Raman强度
溶菌酶(10%)水溶液和重水溶 核糖核酸酶A(5%)水溶液和重水溶 液的Raman光谱 液的Raman光谱
各种蛋白质是由20种 氨基酸中的若干组成 的分子，其中只有几 种氨基酸的某些基团 可以在拉曼光谱中出 现特征谱带。另外含 有S-S桥键的蛋白质 将出现S-S和C-S谱带。 某些蛋白质还出现SH谱带，通常把这些 谱带称为边链振动谱 带(表11.10)，这些边 链振动谱带往往是结 构灵敏的，所以研究 它们可以得到蛋白质 的结构信息。
•
用拉曼光谱测定蛋白质二级结构的定量研究工作始于1976年，Lippert[16]等由已 知二级结构的蛋白质(聚-L-赖氨酸)的拉曼光谱得到一组强度参数，然后用蛋白质 拉曼光谱的酰胺Ⅲ和酰胺I’谱带强度建立一组联立方程，从而求解蛋白质的二级 结构。调节聚-L-赖氨酸溶液的pH值和温度可得到-螺旋、-折叠和无序结构三种 构象。测得其拉曼光谱的酰胺I’和酰胺III谱带。选取水溶液拉曼光谱酰胺III谱带 在1240cm-1处的强度为-折叠和无序结构的特征。重水溶液拉曼光谱酰胺I’谱带 在1632cm-1处的强度为-螺旋，1660cm-1处的强度为-折叠和无序结构的特征。 假定蛋白质拉曼光谱的酰胺I’谱带和酰胺Ⅲ是三种构象相应谱带强度的线性叠加， 其二级结构则满足下列方程组：
抑制或消除荧光干扰的方法有以下几种 ——荧光的抑制和消除
1. 纯化样品。 在拉曼光谱测试中发现荧光干扰时，首先要 做的是纯化样品，有时要反复纯化多次方能 奏效。 2. 强激光长时间照射样品。 很多情况下用这种方法确实能达到消除荧光 干扰的效果（无法解释为什么用强激光长时 间照射样品能够有效地消除荧光干扰）。照 射样品所用的激光功率有时可达数瓦，照射 时间由几分钟到数小时。选用激光功率的大 小和照射时间的长短因样品的不同而不同。
CpIp1240=ƒI1240+ƒβIβ1240+ƒγIγ1240 CpIP1632=ƒI1632+ƒβIβ1632+ƒγIγ1632 CpIP1660=ƒI1660+ƒβIβ1660+ƒγIγ1660 ƒ+ƒβ+ƒγ=1 式中IP1240是蛋白质水溶液拉曼光谱酰胺Ⅲ谱带在1 240cm-1 处的强度除以1448cm-1处CH2变形振动谱带强度的值。 I1240是聚-L-赖氨酸呈现纯-螺旋时拉曼谱酰胺III谱带在 1240cm-1的相应值，其它强度量具有相似的意义。ƒ,ƒ,ƒγ 分别是蛋白质中-螺旋、-折叠和无序结构的含量，Cp是比 例常数。
——荧光的抑制和消除 NIR FT-Raman Spectroscopy
Raman spectra of highly purified Thioindigo excited at 488nm (yellow) and 1064nm (red)
——荧光的抑制和消除
Negligible Fluorescence with 1064 nm Excitation
激光的特性
• 能量在空间高度集中：这主要体现在谐 振腔对光束方向的选择使激光的发散角 很小，即光束的方向性很强 • 时间相干性高即谱线宽度很窄，单色性 好 • 光束具有空间相干性：激光束在传播场 空间中，波前上的各点是相干的
激光器的类型与激发波长
• 气体激光器
• 固体激光器 激光器类型 He-Ne激光器 激光器 激光器
——荧光的抑制和消除 拉曼光谱测试常用的激发波长
515nm 454nm 785nm 1064nm
488nm
——荧光的抑制和消除
Fluorescence - a problem of visible excitation
VIS-Raman
Fluorescence
NIR-Raman
Why Near-Infrared Excited Raman Spectroscopy?
——荧光的抑制和消除
3. 改变激发线的波长。 对于不同的激发光波长，拉曼谱带的相对位移是不变 的。对于不同的激发光波长，荧光的相对位置是不同 的。选择适当的激发光波长，可使记录拉曼光谱时避 开荧光的干扰。 4. 加荧光淬灭剂。 有时在样品中加入少量荧光淬灭剂，例如l ％的硝基 苯，可以有效地淬灭荧光干扰。 5. 利用反斯托克斯技术：反斯托克斯拉曼谱带位于瑞利 线的高频一侧，而荧光则位于瑞利线的低频一侧。记 录反斯托克斯拉曼光谱可完全避免荧光的干扰。
UV Raman
Excitation line
Visible Raman
Excitation line
Intensity
×106 ×106
UV
Wavelength /nm
解决了长期以来拉曼 光谱的荧光干扰难题
共振拉曼光谱
——共振拉曼散射效应
• 通常拉曼散射是非常弱的－只有入射光的10-6 ， 甚至更低。因此通常在研究振动光谱时主要采用 IR 。 • 然而拉曼光谱在许多方面是红外光谱无法替代的， 如水溶液体系的研究。由于光谱的选择定则，高 对称性的分子的振动主要出现在拉曼光谱中。 • 完整的研究应该同时测量红外和拉曼光谱。即 使一些没有对称性的分子，某些振动在红外和拉 曼光谱中的强度也是不同的。同时测量两者的光 谱可以得到尽可能多的信息。