肿瘤基因治疗的基本策略和常用方法

1、基因干预技术
反义RNA技术在基因治疗中需解决的首要问题：
① 专一性转移问题 ：如何专一性的对病灶处病变的细胞进行处 理，而不影响其它正常细胞
② 反义RNA在进入靶细胞前的降解问题：反义RNA抗RNase的 能力不强
③ 安全性问题
1、基因干预技术
受体介导反义RNA转移技术
受体介导的细胞吞噬作用：细胞膜上存在一些 专一性受体是组织或器官特异的，这些受体专一性 的与相应配体结合后，所形成的受体配体复合物就 会在细胞膜上某些特定区域富集，通过细胞吞噬作 用，实现这些配体向细胞内的转移 特点：①具有细胞、组织或器官专一性，配体 只能被一些特异的细胞吞噬 ②配体进入细胞的转移效率很高
2、自杀基因治疗
基本原理：向肿瘤细胞内导入某些真核细胞中不存在的酶基因，这些基因表 达的特异性酶可以催化对真核细胞无毒或低毒的药物前提，转变为具有抑制 核酸合成效应的抗代谢药物，进而选择性的地使转染了该基因的肿瘤细胞 “自杀”。 旁观者效应：导入有自杀基因的肿瘤细胞对邻近的未导入自杀基因的肿瘤细 胞有杀伤作用。可明显扩大自杀基因对肿瘤细胞的杀伤作用
细胞在基因水平上
失去对其生长的正 常调控，导致其克
良性和恶性两大类。
01 基因治疗
指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因 基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的，肿 瘤的基因治疗是将目的基因导入靶细胞,使其在体内 表达并发挥特定的功能,杀伤或抑制肿瘤细胞从而达 到治疗的目的
02
肿瘤基因治疗的 基本策略
3、免疫性基因治疗
3.1.1细胞因子基因导入免疫效应细胞
将细胞因子基因导入肿瘤浸润淋巴细胞(TILS)或肿瘤特异性杀伤细胞 ,再将
这些转基因免疫活性细胞回输入荷瘤宿主,就能选择性聚集在肿瘤组织中,产
生细胞因子,提高局部细胞因子水平,使转基因免疫活性细胞发挥较强的抗肿 瘤效应。
3. 1 .2细胞因子基因导入肿瘤细胞
基本步骤： ⑴ 寻找具有治疗意义的目的基因
⑵ 建立向靶细胞转移目的基因的载体系统
⑶ 目的基因在靶细胞中表达，发挥生物学效应，达到治疗目的
2、自杀基因治疗
⑴、常见的自杀基因系统
① tk-GCV系统 病毒、细菌、真核细胞中都存在胸苷激酶（HSV-tk）。甘昔洛韦(GCV) 是临床上用于治疗单纯疱疹的药物。GCV在胸苷激酶的作用下生成三磷 酸GCV，能阻断DNA合成产生细胞毒作用。 ② CD-5-FC系统 胞嘧啶脱氨酶基因(CD)存在于许多细菌和真菌中，5-氟胞嘧啶(5-FC)在 微生物体内被CD代谢 成5-氟尿嘧啶，后者有明显的抗肿瘤活性。目前 应用最广泛的是大肠杆菌的CD基因。
在体外将编码细胞因子的基因导入肿瘤细胞,经γ 射线等处理使失去致癌性,而保存
分泌细胞因子能力,通过细胞因子生物学活性,诱导CTL(特异T细胞）、巨噬细胞 和NK细胞的活性及抗体产生,增强抗肿瘤免疫。
3、免疫基因治疗
3.2
抗原抗体基因治疗
3.2.1抗原基因治疗 原理：将抗原基因导入肿瘤细胞进行免疫基因治疗的设想，是鉴于许多临床研究发现 肿瘤细胞缺乏主要组织相容性复合物（MHC）Ⅰ类或Ⅱ类分子的表达，导致不能将 肿瘤抗原运输至细胞表面，也不能向T细胞提呈抗原，因而不会诱导产生特异性的 CTL，使肿瘤细胞能够逃避机体的免疫监视。 采用人MHCⅠ类基因HLA-B7进行黑色素瘤基因治疗，在肿瘤细胞中表达同种异体 HLA-B7基因，诱导特异性CTL参与的免疫效应。
3、免疫性基因治疗
基本策略： 根据免疫学的理论和技术，并结合基因
转移和基因表达调控等分子生物学方法，以激发机 体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能为目的的 一种肿瘤基因治疗方法，主要包括： 细胞因子基因 治疗和抗体抗原基因治疗
3、免疫性基因治疗
3.1 细胞因子基因治疗 原理：细胞因子基因治疗是应用分子生物学方法 ,将与免疫 有关的细胞因子编码基因转导入肿瘤或其他免疫效应细胞 ,使 其在机体表达，分泌细胞因子或利用其基因增强肿瘤细胞的 免疫原性或机体的免疫系统功能 ,进而发挥抗肿瘤作用。
肿瘤基因治疗的基本策略和常用方法
临五1604 张湘钰 邹颖
CONTENTS
01 肿瘤基因治疗的基本 02 策略 基本方法 03 对未来肿瘤基因治疗 04 的展望
肿瘤和基因治疗的基 本概念
肿 瘤 基 因 治 疗 的 基 本 策 略 和 常 用 方 法
01
肿瘤和基因治疗 的基本概念
01 肿瘤 机体在各种 致癌因素作用下， 局部组织的某一个 隆性异常增生而形 成的异常病变。学 界一般将肿瘤分为
1、基因的体内递送问题 基因的体内递送问题是肿瘤基因治疗研发的热 点和重要科学问题，而如何将基因安全、高效地导 入到肿瘤治疗部位是基因治疗的重要挑战。目前， 大多数的肿瘤基因治疗缺乏靶向性，只能将表达载 体导入到体表的肿瘤部位，使得治疗只能局限于一 些头颈部肿瘤，即使有部分全身给药的基因治疗方 案进入临床试验，但由于缺乏肿瘤的靶向性或存在 安全性等问题，使得基因难以安全、高效地到达肿 瘤部位，最终导致疗效不理想，甚至会产生很大的 毒性作用
1、基因干预技术
如何高效地向肿瘤细胞或组织递送干扰RNA
RNAi理想递送系统
① 适配体——RNAi的嵌合体。适配体能与多种目标物质 高特异性、高选择性结合 ② 稳定核酸脂质复合物（SNALPs），对脂类复合物进行 聚乙二醇（PEG）修饰使得复合物获得亲水性外层，从而 增强其在血浆中的稳定性
1、基因干预治疗
2、基因治疗的安全性问题 安全性问题一直是基因治疗的热点问题。 1999年两例由于基因治疗引发的医疗事故引 起了人们对基因治疗安全性问题的担忧。目 前，逆转录病毒使用越来越少，更多基因治 疗方案使用安全性更高的腺病毒、腺相关病 毒等。为了提高基因治疗的安全性，各国科 学家和临床医生在不断改进技术和优化临床 试验方案
2、自杀基因治疗
Ⅱ、增强基因转导效率
自杀基因治疗要求转染的自杀基因要有一定的表达效率，同时能选择性的表 达于靶细胞中，从而最大限度的杀伤肿瘤细胞。目前主要的靶向方法有： ① 靶向性转导 载体携带外源基因, 在一定的反应环境中作用于靶细胞, 完成基因转移这一 过程中, 无论是载体、环境因素还是靶细胞的改变都将影响基因转导效率。 恶 性肿瘤细胞常有表面受体的异常表达或肿瘤特异性抗原表达, 将载体与肿瘤表面 特异表达、高表达受体相对应的配体或与相对应抗体相连, 将提高外源基因的转 导效率 ② 靶向性转录 基因的表达受到多层次的调控, 因此外源基因的表达调控可以通过对多个环 节进行干预来实现。在自杀基因前端接上肿瘤特异性的启动子、增强子等转录 调控元件, 可以增强外源基因 在肿瘤中的特异性表达, 以加强自杀基因对肿瘤细 胞的特异性杀伤效力, 同时可以降低它对正常细胞的毒性作用
4、提高化学治疗效果的辅助基因治疗
4.1药物增敏基因治疗：
原理：将某些药物增敏基因导入肿瘤细胞，使其对抗肿瘤药物的敏感 性大大增加。 将鸡钙调素(CaM)基因导入小鼠 乳腺癌细胞株C127后，应用较低剂量 的长春新碱或长春碱即可抑制该细胞株的生长。其原理是，CaM基因的表达 产物作为 细胞内信号转导系统的重要物质，可明显增加肿瘤细胞对长春新 碱和长春碱的吸收量而减少排泄量，从而提高了肿瘤细胞内化学治疗药物 浓度，导致肿瘤细胞死亡。
2、自杀基因治疗
⑵ 、自杀基因的转导
Ⅰ、载体技术 ① 病毒载体介导基因转移：以其高转染率和良好的靶向性成为肿瘤治疗 中应用最广泛的方法，其中包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒 ② 非病毒载体介导基因转移：常用的非病毒载体有脂质体及多聚阳离子 聚合物，具有低免疫、低毒性、无基因插片段大小限制等优势，但缺乏组 织的特异性和靶向性，转染效率低且易被网状内皮系统吞噬，基因表达时 间
3、免疫性基因治疗
3.2.2 抗体基因治疗 原理：①抗体可以诱导特异性细胞毒反应，本身具 有一定的抗肿瘤效应，可直接作用于某些癌基因异
常表达所致的肿瘤。
曾有美国学者构建了一种编码单链抗体的载体 (PGT21)，将其转染到CerB2高表达的肿瘤细胞中wk.baidu.com 结果发现其可以通过细胞内表达抗CerB2单链抗体， 抑制肿瘤的生长。
01
基因矫正
01
03
采用基因打靶技术矫正突变的抑癌基因中的突变序列
02
基因置换
将外源性的正常抑癌基因直接导入肿瘤细胞，取代突变
的抑癌基因而发挥作用，以改变肿瘤细胞的恶性表型
03
基因失活
利用基因干扰技术等抑制异常表达的癌基因或肿瘤相 关基因，降低其表达活性或使其不表达
04
基因修饰
02
04
又称基因转移，是指将外源性目的基因导入癌变细胞， 通过目的基因表达产物修饰缺陷细胞，使其恢复功能或 原有功能得到加强基因型修饰是应用最广泛的一个策略。
4、提高化学治疗效果的辅助基因治疗
4.2耐药基因治疗 ①肿瘤细胞耐药性的产生与多种糖蛋白有关，包括多药耐药基因编码的P糖蛋白，多药耐药相关蛋白等。为了降低肿瘤细胞的耐药性，可以开发争 对肿瘤细胞耐药性产生机制的拮抗剂，如阻断P-糖蛋白所引发多药耐药的 戊脉安。还可以采用基因干扰技术，在基因水平阻断耐药基因的表达，使 肿瘤的多药耐药性消失。
②针对化学治疗所致的骨髓细胞造血功能受到抑制的问题，通过向肿瘤患 者的骨髓细胞导入某种耐药基因，如mdr-1等基因，以增强骨髓细胞的抗 药性，以便能耐受大剂量的化学治疗药物，以达到彻底杀灭肿瘤细胞的目 的。
04
对未来肿瘤基因 治疗的展望
04 对未来肿瘤基因治疗的展望
经过近30年的发展,基因治疗相关技术趋于成熟,若干关 键技术获得突破。因此,未来几年将是全球基因治疗产 品上市的重点时期,但基因治疗应用于恶性肿瘤等重大 疾病的治疗还面临一些挑战,展望未来基因治疗的热点 和亟待解决的科学问题还有以下几个方面
1、基因干预技术
RNAi 作用机制 ①病毒基因、转座子、人工转入基因等外源 基因随机整合到宿主细胞基因组内,并利用宿 主细胞进行转录时常产生一些dsRNA 。 ② siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链 成正义链和反义链,然后由反义链与胞内一些 酶( 包括内切酶、外切酶、解旋酶等) 结合形 成RNA诱导的沉默复合物 （RISC） ③此时RISC具有核酸酶的功能,能在结合部 位切割mRNA,切割位点是与siRNA中反义链 互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随 即降解,进而诱发宿主细胞针对这些mRNA 的降解反应
03
常用方法
1、基因干预技术
2、自杀基因治疗
04 02
3、肿瘤的免疫基因治疗 4、提高化学治疗效果的辅 助基因治疗
03
1、基因干预技术
（1）反义RNA技术
如何获得反义RNA： ① 体外构建反义RNA表达载体，将其导入肿瘤 细胞并表达反义RNA ② 体外合成反义RNA，将其导入靶细胞，对表 达异常的癌细胞产生抑制效应。
如何解决RNAi存在的安全问题
1、克服siRNA的脱靶问题 siRNA可引起一些非靶基因的特异性沉默或表达上调，引起细胞凋亡或生长抑制， 这种现象叫做脱靶效应 解决脱靶效应的潜在方法： ⑴ 最新发现的siRNA领域转移优化策略 ⑵ 改变siRNA浓度 ⑶ siRNA设计 2、克服RNAi引起的免疫反应 siRNAs是哺乳动物固有免疫系统的有力激活剂，能诱导产生高水平的炎性细胞因 子和Ⅰ型干扰素。 解决方法： ⑴ 用免疫刺激的siRNA来避免诱发的相关免疫反应，通过选择免疫缺 乏刺激基序的序列，设计出无免疫刺激活性的siRNA ⑵通过化学修饰来稳定siRNA
脱唾液酸血清类黏蛋白（ASGP） 受体介导反义RNA转移
1、基因干预技术
反义DNA技术治疗肿瘤的三个设想：
① 封闭异常表达的癌基因
② 癌基因的异位和重排部位是反义RNA治疗的理想目标
③ 抑制肿瘤细胞耐药性，从而提高化学治疗效果
1、基因干预技术
⑵、RNA干扰技术
RNA干扰( RNA interference,RNAi ) 是指在进化过程中高度 保守的,由双链RNA ( dsRNA) 诱发、同源mRNA高效特异性 降解的现象。RNAi使特定基因沉默,是真核细胞中的一种转录 调节机制,这种由21 ~ 23 个核苷酸长度介导的小RNA常被称 为小干扰RNA( siRNA) ,其序列在真核生物进化中高度保守。 将长dsRNA或短siRNA递送进入生物体细胞内均可引发RNA i， 进而使特定基因表达沉默 基于RNAi的肿瘤治疗应用于临床,有两个关键问题亟需解决: 首先,如何高效向肿瘤细胞或组织递送干扰RNA; 其次,如何减 少外源性siRNA引起的不良反应。