腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染
病毒包装实验整体规程及原理(慢病毒、腺病毒)
广州英思特生物科技有限公司为您提供高效快速的病毒包装实验外包服务，病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类1.11.1.1体，一方面1.1.21）研。
? 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.21.2.1达E11.2.21）2）3）4）5）1.2.3腺病毒包装简要流程1）构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体2）采用 PacI 消化纯化的质粒。
3）消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。
4）将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。
5）分装，-80℃保存。
1.3、慢病毒和腺病毒的比较2、构建目的基因到载体2.1构建手段一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。
1）如果原始质粒与载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到载体，酶切，并测序鉴定DNA分子。
质粒在宿主细胞体内外都可复制。
通过个些特性，人们可以把一些目的DNA片断构建在质粒中，通过转化入大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而不断的复制，来得到目的产物。
3、质粒DNA在大肠杆菌里转化连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒，以下是质粒DNA在大肠杆菌里转化的三步骤。
3.1大肠杆菌感受态细胞的制备30min2）离心管放到42℃保温90s3）冰浴2min4）每管加800ulLB液体培养基，37℃培养1h（150r/min）5）取适当体积（100ul）的复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正置6）倒置平皿37℃，12~16h，出现菌落3.3质粒提取步骤1）取1~4ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000转离心1min，弃上清一次。
腺病毒疫苗制作流程
腺病毒疫苗制作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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腺病毒载体的分类及包装方法
腺病毒载体的分类及包装方法1.腺病毒载体分类第一代腺病毒载体：指E1或E3基因缺失的腺病毒载体。
特点：(1)外源基因容量为6.5-8Kb；(2)适用于大多数基因治疗，且容易获得高滴度的病毒；(3)可用于表达重组蛋白质或将外源基因导入对其他转染方法不敏感的细胞株中；(4)若未经纯化使用，容易引发机体产生强烈的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用。
第二代腺病毒载体：指E2A或E4基因缺失的腺病毒载体。
特点：(1)外源基因容量增加，可达14Kb；(2)病毒蛋白表达降低，引发机体的免疫反应比第一代弱；(3)外源基因表达时间较长；(4)病毒产量较低，且滴度降低。
第三代腺病毒载体：也称为空壳载体或辅助病毒载体，指全部或大部分腺病毒基因组缺失，仅可保留ITR和包装信号序列的腺病毒载体。
特点：(1)外源基因容量大幅度提高，可达37Kb；(2)无病毒蛋白表达，降低了机体的免疫反应，提高了安全性；(3)外源基因可长期稳定表达；(4)需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒；(5)可反复应用，无需考虑机体的抗腺病毒中和抗体的影响。
2.腺病毒载体包装方法传统的双质粒共转染法将插入了外源基因的穿梭载体质粒与携带腺病毒基因组的质粒共转染293细胞，这两种质粒在293细胞内通过随机的同源重组（同源序列的DNA分子之间或者分子之内的重新组合），形成重组腺病毒载体基因组，并包装成病毒颗粒。
局限性：(1) 操作较复杂，因其易被亲代病毒污染，需经过多次纯化和鉴定；(2) 重组效率低，耗费时间较长。
注：此方法适用于临床。
(1)Ad-Easy法将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒大部分基因组的质粒共转染RecA+细菌，在细菌RecA 重组酶的作用下，经抗性筛选获得重组腺病毒基因组质粒，将其酶切纯化后转染293细胞，包装成重组病毒颗粒。
特点：(1) 酶切和连接步骤少，操作简便；(2) 可选择的穿梭载体多；(3) 同源重组率达60%以上，效率相对较高；局限性：(1) 某些腺病毒基因容易发生突变；(2) 设备和技术要求较高。
腺病毒的包装与制备
腺病毒的包装与制备1 转染AD293第一轮:1. pAd质粒转染AD293，可使用六孔板或60mm皿。
当细胞出现明显细胞病变效应(CPE)时回收细胞，(吸去培养基用PBS洗一遍，若细胞已经悬浮则取所有培养基低速离心，细胞用PBS洗一遍)，并用0.5ml PBS重悬。
置于1.5ml microcentrifuge tube中2. 裂解细胞:进行四轮-80?/37?3. 12000g 10min 室温离心，将上清移入新的离心管中。
-80?保存。
第二轮:1. 取第一轮的病毒液50μl(或设置梯度)感染100mm皿。
(如细胞第一天就出现病变则用量太高，一般应在第一天少量病变，第二三天全部病变)。
重复第一轮方法裂解细胞并收集腺病毒，终体积1ml第三轮取第二轮的病毒感染4个150mm皿(100μl/皿或设置梯度)，并用CsCl密度梯度法纯化腺病毒。
2 透析Transfecting AD-293 Cells以Lipofectamine? 2000说明书为本，更改了细胞密度和DNA量51. One day before transfection, plate 4x 10 cells per 6-wellofgrowth medium without antibiotics so that cells will be 50-70% confluent at the time of transfection. 2. For each transfection sample, prepare complexes as follows:a. Dilute 4μg linearized DNA in 250 μl of Opti-MEM I Reduced Serum Medium without serum (or other medium without serum). Mix gently.b. Mix Lipofectamine? 2000 gently before use, then dilute 10μl lipofectaminein250 μl of Opti-MEM I Medium. Incubate for 5 minutes at room temperature. Note:Proceed to Step c within 25 minutes.c. After the 5 minute incubation, combine the diluted DNA withdilutedLipofectamine? 2000 (total volume = 100 μl). Mix gently andincubate for 20 minutes at room temperature (solution may appear cloudy). Note:Complexes are stable for 6 hours at room temperature. 3. Add the 500 μl of complexes to each well containing cells and medium. Mix gently by rocking the plate back and forth.4. Incubate cells at 37?C in a CO2 incubator for 17-10days prior to testing for GFP. Medium may be changed after 4-6 hours.Preparing the Primary Viral Stocks1. Prepare a small dry ice-methanol bath and a small 37?C water bath and placethem in the laminar flow hood.2. Carefully remove growth medium from adenovirus-producing AD-293 plates andwash the cells once with PBS. Take care not to lose any clusters of floating andpartially attached cells during this process.Note :If the cells are already mostly detached, pipet up and down gently in the growth medium until cells become completely resuspended. Transfer cell suspension to a screw cap centrifuge tube and pellet the cells by low speed centrifugation. Aspirate medium, and wash the cells once with 0.5 ml of sterile PBS. Resuspend the cell pellet in a fresh 0.5 ml sterile PBS (per 60-mM dish) and proceed to Step 5. 3. Add 0.5 ml of PBS to each plate of cells to be harvested. Collect the cells by holding the plate at an angle and scraping the cells into the pool of PBS with a cell lifter.4. Transfer the cell suspension to a 1.7-ml screw-capmicrocentrifuge tube. If duplicate DNA samples were transfected, the cells from duplicate samples may be combined in the microcentrifuge tube at this stage.5. Subject the cell suspension to four rounds of freeze/thaw by alternating the tubes between the dry ice-methanol bath and the 37?C water bath,vortexing briefly after each thaw.Note :Each freeze and each thaw will require approximately 5 minutes’ incubationtime.6. Collect cellular debris by microcentrifugation at 12,000 × g for 10 minutes at room temperature.7. Transfer the supernatant (primary virus stock) to a fresh screw-cap microcentrifuge tube. Viral stocks can be stored for more than one year at –80?C.腺病毒扩增1. Plate 5 X 106 QBI-293A cells in a 100 mm culture dish in 10 mL DMEM 5%.2. Remove 50μl(100μl) of the viral stock of the first amplification, complete to 1 mL with DMEM 5% and mix. This dilution will give a MOI of about 5.3. Remove the medium from the 100 mm dish, delicately add the viral particle mix onto the cells taking care not to disturb the monolayer and spread by slowly rocking the dish 3 times in a cross shape. Incubate for 90 minutes at 37?C in 5% CO2.4. Add 9 mL of DMEM 5%.5. Incubate at 37?C in a CO2 incubator for 72 hours. At this point you should have between 5 x91010 and 5 x 10 VP in 10 mL of DMEM 5%. Perform a MOI test (section 5.3) to estimate the titer if desired.If this quantity of virus is sufficient, you can immediately proceed to the titration step (section 5.8). In this case, collect the cells in a centrifuge tube, spin at 600 x g for 5 min, discard supernatant and resuspend the cell pellet in a minimal volume, typically 1:10 of the original volume or about 1mL. Then proceed with 3 freeze/thaw cycles (-20?C / 37?C), spin at maximum speed on a tabletop centrifuge to remove cellular debris, and collect the supernatant. Titer as described in section 5.8. 6. Perform three freeze/thaw cycles at -20?C until completely frozen/37?C until fully thawed. 7. Pellet cell debris in a sterile 15 mL conical tube. Centrifuge at maximum speed in a tabletop centrifuge for 10 minutes, remove and store the supernatant in another sterile 15 mL conical tube at -20?C or -80?C.8. Plate 3 x 107 QBI-293A cells in 3 x 175 cm2(150mm dish) culture flasks (1 X 107cells/flask).9. Mix 3 mL of cell lysate supernatant from step 7 with 12 mL DMEM 5%. Remove the mediumfrom the flask, then delicately add 5 mL of supernatant mix perflask on the cells, taking care notto disturb the monolayer, and spread by slowly rocking the dish 3 times in a cross shape. Incubate for 90 minutes at 37?C in 5% CO2. This should give a MOI of 25.10. Complete to 30 mL/flask with DMEM 5%.11. Incubate at 37?C in a CO2 incubator for 48 to 72 hours. At this point you should have between 3 x 1010 and 3 x 1011 VP in 90mL of DMEM 5%. Perform a MOI test (section 5.3) to estimate the titer if desired. Again, if this quantity of virus is sufficient, you can immediately proceed to the titration step (section 5.8). In this case, collect the cells in a centrifuge tube, spin at 600 x g for 5 min, discard supernatant and resuspend the cell pellet in a minimal volume, typically 1:10 of the original volume. Then proceed with 3 freeze/thaw cycles (-20?C / 37?C), spin at maximum speed on a tabletop centrifuge to remove cellular debris, and collect the supernatant. Titer as described in section 5.8.12. Perform three freeze/thaw cycles at -20?C/37?C.13. Pellet cell debris in a sterile 50 mL conical tube. Centrifugeat maximum speed in a tabletop centrifuge for 10 minutes. Remove and store the supernatant.14. Plate 3 x 108 QBI-293A cells in 30 x 175 cm2 culture flasks (1 X 107 cells/flask). 15. Mix 45 mL of cell lysate supernatant from step 13 with 105 mL DMEM 5%. Remove the medium from the 175 cm2 flasks, pour 5 mL of the cell lysate mix per flask on the cells, taking care not to disturb the cell monolayer, and spread by slowly rocking the flask 3 times in a cross shape. Incubate for 90 minutes at 37?C in 5% CO2. This should give a MOI of 25.16. Complete to 30 mL/flask with DMEM 5%.17. Put the cells back at 37?C in a CO2 incubator for 2-3 days. You should now have between 3 x 111210 to 3 x 10 VP. Perform a MOI test (section 5.3) to estimate the titer if desired. If you want to produce viral particles, first collect and pellet the infected cells, then resuspend in 5 mL DMEM 5%. Extract viral particles by performing three freeze/thaw cycles at -20?C/37?C; pellet cell debris by centrifugation. At this point you should have between 3 x 1011 to 3 x 1012 recombinant virus particles in 5 mL DMEM 5%, for a final VP/mL of 6 X 1010 to 6 x 1011. Your viral particle pre-stock will now be ready to be titrated directly, asdescribed in section 5.8, or purified, using standard cesiumchloride gradients (section 5.7). Further amplifying your recombinant virus on 109 cells will result in the production of a viral stock, while amplification on 1 x 1010 cells is technically a viral production. You should never use the virus from a production stock to infect additional cells because you will at the same time significantly increase the amount of RCA generated. Instead, use virus from an earlieramplification steps such as the stock, pre-stock or pre-amplification in order to produce more virus particles. You can eventually go back to the purified eluted plaque in order to minimize RCAproduction as much as possible. If a purified eluted plaque is no longer available, you will have to perform a plaque assay of your recombinant virus and start the amplification step again from a purified eluted plaque, after analysis of your clone. If more material than produced in the first 4 passages(see Table 5) is needed, remember to always return to the previous passage as your source for virus. For example, use virus from passage 2 in order to generate passage 3. Note that once you have depleted all of your viruses from passage 2, you must use virus from the first amplification in order to create a new passage 2. Proceeding in this fashion will keep the level of RCA as low as possible. If you want to overexpress a protein, pellet the cells and extract the protein according to its characteristics. Typically, about 1-5 mg of a well-expressed protein can beretrieved from the pellet. It is recommended to first determine the best time pi to extract the protein on a smallscale, then to proceed with large-scale protein production.CsCl密度梯度法纯化腺病毒1 Add either purified Ad or unpurified Ad (medium) to monolayer culture cells (50-100pfu/cell)2 If using one T150 flask total 10-12 ml medium is used to cover the cells and allow cells to culture for one day3 Cells should look swollen and part of the cells may be floating. Another 10ml of complete medium is added into cells and allow another day culture (36-40hrs infection period )4 All of the cells should be floating. Collect all the cells and resuspend them in 0.5-1ml of complete medium . Also save the culture medium and store at -70?.5 Freeze in methanol/dry ice bath and thaw at 37?. Repeat for 3-4times6 Spin at high speed for 5min.7 Make 40% and 15% CsCl in TBS, PH8.1(50ml each and keep at 4?)8 Make CsCl gradient solution(5ml of 15% and 4.5ml of 40%) in Beckman centrifuge tube (14*89mm, which frist sw41 rotor)9 Load the supernatant from step 6 on the top of gradient10 Centrifuge at 4? 30000rpm for 16hr11 Two bands can be seen: the faint top band (mainly defective Ad) and the lower Ad band. Only the lower band is collected.12 the Ad is dialyzed in TBS PH8.1 for 1hr and then in TBS containing 10% glycol twice (1hr each time)13 Determine the Ad concentration, aliquot into microfuge tube(50μl each )and store at -70?TBS: tris 10mM, NaCl 0.9%, PH8.115% CsCl(50ml): 9.085g CsCl+47.69ml TBS40% CsCl(50ml): 28.45g CsCl+42.7ml TBSDialyze:1 透析袋: MW 8000-144002 透析缓冲液: TBS PH8.1 灭菌甘油步骤:1冲洗透析袋，如果是蛋白则需NaHCO-NaEDTA煮沸处理后用蒸馏水洗。
腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染
腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染一、包装1.包装细胞详情见AD-293 Cells.pdf，AdEasy? Adenoviral Vector System.pdf（P31-P32）2.细胞转染方法一、详情见Adeno-X Expression System 1 User Manual.pdf（P28-P29）C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒.pdf3.病毒收集详情见AdEasy? Adenoviral Vector System.pdf（P34）二、扩增详情见Adeno-X Expression System 1 User Manual.pdf（P29-P30）三、纯化(i) 病毒上清（接一、包装3.病毒收集）.(ii) Add 51 ml of a 50% PEG 6000 solution.(iii) Add 21.7 ml of a 4 M NaCl stock solution.(iv) Add 23.3 ml of PBS. This will result in a final volume of 300 ml. The final PEG 6000 concentration will be 8.5% and the final NaCl concentration will be B0.3 M.(v) Distribute the sample as 150-ml aliquots in two 250-ml polypropylenewide-mouthed bottles.(vi) Store the bottles at 4 1C for 1.5 h. Mix contents every 20–30 min.(vii) Centrifuge bottles at 7,000g for 10 min at 4 1C using a Beckman fixed-angel JLA-10.500 rotor.(viii) After centrifugation, a white pellet should be visible.(ix) Carefully decant the supernatant and add 1.2 ml of 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, perbottle. Resuspend the pellets byvigorously pipetting liquid up and down.(x) Vortex the bottles vigorously for 20–30 s to further resuspend the pellets.(xi) Transfer the vector suspension into screw-cap microfuge tubes in aliquots of 100 ml.(xii) Snap-freeze the tubes in crushed dry ice and store at -80 。
腺病毒包装操作手册
汉恒重组腺病毒操作手册目录腺病毒安全使用和注意事项腺病毒储存与稀释的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、腺病毒包装和浓缩四、重组腺病毒滴度（PFU）的测定五、重组腺病毒感染目的细胞六、重组腺病毒用于动物实验附1：汉恒生物腺病毒载体附2：腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索（表达荧光的病毒） 附3：汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较腺病毒安全使用和注意事项➢腺病毒安全使用注意事项（*非常重要*）1) 腺病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2) 操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3) 操作病毒时需要特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加 1%的SDS溶液擦拭干净。
4) 接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。
5) 如实验过程中需要离心，应使用密封性好的离心管，必要时请用封口膜封口后离心。
6) 病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌后处理。
7) 实验完毕后请用香皂清洗双手。
➢腺病毒储存与稀释的注意事项1）腺病毒的储存收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于 4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期保存请分装后放置于 -80 ℃ 。
注：a.反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%），因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。
汉恒生物对病毒已进行分装（200 μl/tube），收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。
b.若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度（参见附表2-慢病毒滴度测定方法）。
2）腺病毒的稀释需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于 4℃保存(一周内使用完最佳)。
重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。
腺病毒包装纯化及感染实验操作步骤
腺病毒包装纯化及感染实验操作步骤技术背景Adeasy 系统利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度浓缩等优点，并破坏了腺病毒基因组中的早期基因E1，使之成为较为安全、高效的病毒载体。
利用带有E1 基因的293 细胞作为包装细胞，通过倍比扩增，富集病毒颗粒，并通过CsCl 梯度离心，透析进行分离纯化。
对绝大多数的细胞株可以达到近乎100％的感染效率。
但需要指出的是Adeasy 同样具有所有病毒载体或转染试剂都不可避免的细胞毒性问题。
所需试剂1.293 细胞；2. 重组好的腺病毒质粒；3. Pac I 限制性内切酶；4. 质粒回收相关试剂；5. 细胞培养、转染相关试剂；6. TBS：10mM Tris, 0.9% NaCl，pH8.1；7. 40% CsCl：28.45 g CsCl 溶于42.7 ml 的TBS 中，4 度保存；8. 15% CsCl：9.085 g CsCl 溶于47.69 ml 的TBS 中，4 度保存；9. Beckman 离心管：14*89 mm，SW41 转头；10. Polybrene (sigma)，10 mg/ml；11. 透析袋：Spectrum Co. （成卷供应，带少量甘油，硫化物与重金属），MW=8000~14400；12. 灭菌甘油。
操作流程1.293 细胞（E1-transformed human embryonic kidney cells 在转染前24 小时接种于1 或2 个60 mm 培养盘中，使之在转染时细胞汇合率为50-70%；2. 在转染前，用Pac I 处理目的质粒（一般一个60 mm 细胞盘需要6μg DNA）。
处理后质粒用乙醇沉淀并重悬于20 μl 无菌水中；3. 用PEI 或其他转染试剂将6 μg Pac I 处理过的质粒转染细胞；4. 8 个小时后移去混合液，加入4 ml DMEM 完全培养液（10% CBS，1%Pen/Strep）；5. 在转染后7 到10 天用细胞刮（而不是胰酶）将细胞从瓶中刮下并移入50ml锥形管。
腺病毒包装的原理和具体步骤及方法
腺病毒包装的原理和具体步骤及方法
腺病毒包装
1 特点：
1.1 几乎可以感染所有类型的细胞。
1.2 可以获得复制缺陷型（E1和E3缺失）的腺病毒。
1.3 病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效地进行增殖。
1.4 腺病毒载体感染宿主的范围比较广。
1.5 感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。
2原理：
腺病毒（Adenovirus，Ad）是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
3 腺病毒包装简要流程
3.1 含有目的基因的腺病毒穿梭载体的构建和质粒纯化提取。
注：客户也可以提供构建好的重组腺病毒穿梭载体。
3.2 穿梭载体与腺病毒骨架质粒重组及鉴定。
3.3 重组腺病毒质粒的酶切线性化。
3.3 线性化的重组腺病毒质粒转染包装细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。
3.4 腺病毒扩增并纯化。
3.5 分装，- 80 oC保存。
3.6 滴度测定及无菌检测。
(整理)腺病毒载体操作手册1407-R2
腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。
连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。
二、实验材料（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP, pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。
其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。
pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。
1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：2）骨架质粒信息如下：2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。
三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。
该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。
若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。
若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。
随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
腺病毒中文操作手册
腺病毒中⽂操作⼿册腺病毒载体操作⼿册中⽂版腺病毒重组系统AdEasyTM操作⼿册⽬录第⼀章简介13.2AdEasyTM系统中产⽣重组腺病毒的时程3第四章主要流程2 4第⼆章应⽤重组腺病毒的优点4.1技术3 将基因克隆⼊AdEasyTM转移载体4 第三章AdEasyTM4.1.13 3.1技术概况缩写英⽂全称中⽂全称AdAdenovirus腺病毒LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite5Ad5Adenovirusserotype5⾎清型腺病毒多克隆位点分钟腺病毒载体MinMinuteAdV AdenoviralVector AmpAmpicillin氨苄青霉素感染复数MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell) -半乳糖苷酶β-Galβ-GalactosidaseβRNA mRNAMessengerRNA信使MWCOMOIecularWeightCut-offbpBasePair碱基对PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresisBSABovineSerumAlbumin⼩⽜⾎清⽩蛋⽩聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液互补cDNAComplementaryDNADNADNA 闭环螺旋空斑形成单位PFUPlaqueFormingUnitcccDNAClosedCircularCoiledDNA CPECytopathicEffect细胞病理效应感染后piPostInfection CsClCesiumChloride氯化铯RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒培养基DMEMDulbecco'sModifiedEagleMediumDMEM RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复DMSODimethylSulfoxide⼆甲基亚砜SDSSodiumDodecylSulfate⼗⼆烷基硫酸钠⼄⼆胺四/⼆硫苏糖醇DTTDithiothreitol TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid⼄⼆胺四⼄酸⼄酸组织培养感染剂TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%溴化⼄锭EtBrEthidiumBromide量FBSFetalBovineSerum胎⽜⾎清TCPTotalCellularProtein细胞总蛋⽩⼩时HrHourITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复溶液TETris/EDTA TE 卡那霉素KanKanamycin wtWildType野⽣型溴千碱基对X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-kbKilobases半乳糖苷-3--4-氯吲哚-千道尔顿KDaKiloDaltons β-D-第⼀章简介当今基因输送技术的发展⽇趋复杂，⼀些治疗药物（⽣长激素、⼲扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋⽩（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更⾼效的基因输送⼯具。
腺病毒包装注意事项
细胞中大量扩增腺病毒293在细胞中进行大量扩增。
本手册提供了递增培养规模和腺一旦重组病毒已被纯化和鉴定，即可在293由于一个细胞中按这一方法最终得到的病毒量约为病毒感染周期的基本方法，3×1011～3×1012。
病毒颗粒。
如果要把病毒用所含的病毒颗粒为1000～10000，因此10125×1L 培养细胞可得到约的细胞，这样才能正确分辨出病毒带。
对于蛋白表达，则氯化铯梯度离心纯化，则必须至少×1083根据蛋根据需要可在任何一步扩增步骤中停止，离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提(。
为优化时间进程，每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同白类型的不同抽提上清或细胞沉淀)步。
如果由于各种原因不能同步，则必须将病毒冻存，直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。
注意每次扩增都将会剩下一些病毒，这些病毒先不必丢弃，以便下一步扩增失败时备用。
每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒，这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。
操作步骤：细胞。
51 在100 培养皿或752培养瓶中加入10 5%培养×106293。
取2 0.5 首次扩增的病毒保存液，加入5%至1，混匀，这样稀释得到的5值约为孵箱中培3 3 移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动次，37℃2分钟。
养90。
4 加入9 5%测定以估计病毒个病毒颗粒，进行××这时在5 再培养72 小时，10 溶液中大约有5109～51010颗粒。
分钟沉离心5 600注：如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定。
收集细胞，×g-200C /370C 1)病毒保存溶液重悬细胞。
即一般为原始体积的去上清后加入最小体积淀细胞，(1/10次，台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清，然后进行病毒滴定。
3 冻融次。
/37℃℃冻融3 1 -20℃。
-20 ℃或-80 转入215 无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心10 分钟，收集上清冻存于细胞进行培养。
腺相关病毒包装操作手册
hCHETA-EYFP pHBAAV-hSyneNpHR3.0-EYFP pHBAAV-hSynhChR2(H134R)-mcherry
启动子及其特点
CAG（人巨细胞病毒 启动子 CMV 和鸡 beta-actin 嵌合型启 动子），广谱，强
CMV（人巨细胞病毒启动 子），广谱，强
4) 汉恒生物 AAV-mRFP-GFP-LC3 自噬流监测工具（表 4）
载体 类型 双标 单标
载体名称
pHBAAV-mRFP-GFP-LC3 pHBAAV-GFP-LC3
启动子及其特点
CMV，广谱，强 CMV，广谱，强
标记基因
mRFP/GFP GFP
是否 Cre 依赖 否 否
五、整体实验流程（图 2）
图 1、 AAV2 基因组结构示意图。 四、汉恒生物 AAV 产品服务及载体信息与现货列表 1. 汉恒 AAV 产品分类：
常规基因的过表达和干扰定制（载体列表见“七、载体构建”部分）； 组织特异性启动子过表达定制（载体列表见“七、载体构建”部分）； 常规启动子和组织特异性启动子驱动的 AAV-Cas9 定制； AAV 介导的光遗传、化学遗传载体现货及改造服务等（见表 1）； 双标、单标 LC3 自噬流监测工具（见表 2）； 组织特异性 AAV-DIO 载体的定制（原理见附件 2）。 2. 汉恒 AAV 产品特点：
hChR2(H134R)-mcherry
mcherry
否
pHBAAV-GFAP-ArchT-
抑制
EYFP
否
EYFP
GFAP（星形胶质细胞特异
红光 激活
pHBAAV-GFAPC1V1 (t/t)-TS-mcherry
病毒包装实验整体流程及原理
病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难以转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、腺病毒1.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
1.2.2特点1）几乎可以感染所有类型的细胞2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。
重组腺病毒构建_扩增及纯化基本技术操作——永诺生物
重组腺病毒构建，扩增及纯化基本技术操作——永诺生物一目的基因的克隆（以pshuttle-CMV质粒为例）1. 选择适当酶切位点，进行酶切连接，将目的片段插入pshuttl-CMV质粒多克隆位点。
2. 重组质粒鉴定：酶切鉴定或测序。
3. 重组质粒扩增，纯化并准备适量含目的基因的穿梭质粒。
4. 用PmeI单酶切线性化重组穿梭质粒，电泳鉴定质粒完全被切开。
5. 胶回收线性化质粒，以备共转化使用。
二共转化1 大肠杆菌BJ5183电转感受态制备1）从新鲜琼脂板上挑取单个BJ5183细菌，接种于LB培养基中，37℃振摇过夜。
2）接种25ml过夜培养物于500ml LB培养基，37℃振摇，至OD600 达到0.4。
3）迅速将培养物置于冰浴中30min，至充分冷却。
4）将菌液转移至预冷的离心管中，4℃下以2500r/min离心15 min，弃培养液，回收细胞。
5）以10ml预冷的10%甘油洗涤沉淀，低温离心，共两次。
6）加约1ml（适量）预冷的10%甘油重悬沉淀，稀释悬液100倍，测量OD600，至稀释浓度为2-3×1010个细胞/ ml (1.0 OD600约2.5×1010个细胞/ml)。
分装，-80℃或液氮保存待用。
2 病毒骨架质粒转化大肠杆菌，扩增，纯化。
3 将1-5µl (约1µg) 线性化的穿梭质粒及1µl（约100ng/µl）病毒骨架质粒（如pAdEasy-1）加入至含约40µl BJ5183电转感受态的EP管中混匀,冰上冷却。
4 将混合物加入电转杯，电击（1250-1500V/mm,5ms）。
5 电击结束取出样品，加入1ml SOC或LB培养液，37℃低速振荡40min。
6 取适当体积的电击转化细胞液涂于数个卡那霉素抗性平板（25-50mg/ml），37℃培养16-20hr。
7 次日挑取平板上长出的菌落（选择最小的菌落）,接种于3ml含25-50mg/ml的LB 培养基，37℃培养10-15hr。
腺病毒包装注意事项.
在293细胞中大量扩增腺病毒一旦重组病毒已被纯化和鉴定，即可在293 细胞中进行大量扩增。
本手册提供了递增培养规模和腺病毒感染周期的基本方法，按这一方法最终得到的病毒量约为3×1011～3×1012。
由于一个细胞中所含的病毒颗粒为1000～10000，因此1L 培养细胞可得到约5×1012病毒颗粒。
如果要把病毒用氯化铯梯度离心纯化，则必须至少3×108的细胞，这样才能正确分辨出病毒带。
对于蛋白表达，则根据需要可在任何一步扩增步骤中停止，离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提(根据蛋白类型的不同抽提上清或细胞沉淀)。
为优化时间进程，每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同步。
如果由于各种原因不能同步，则必须将病毒冻存，直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。
注意每次扩增都将会剩下一些病毒，这些病毒先不必丢弃，以便下一步扩增失败时备用。
每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒，这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。
操作步骤：1 在100mm 培养皿或75cm2培养瓶中加入10ml DMEM5%培养5×106293 细胞。
2 取0.5ul 首次扩增的病毒保存液，加入DMEM5%至1ml，混匀，这样稀释得到的MOI 值约为5。
3 移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动3 次，37℃CO2 孵箱中培养90 分钟。
4 加入9ml DMEM5%。
5 再培养72 小时，这时在10ml 溶液中大约有5×109～5×1010个病毒颗粒，进行MOI 测定以估计病毒颗粒。
注：如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定。
收集细胞，600×g 离心 5 分钟沉淀细胞，去上清后加入最小体积(一般为原始体积的1/10 即1ml)病毒保存溶液重悬细胞。
-200C /370C 冻融3 次，台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清，然后进行病毒滴定。
腺病毒的包装步骤 自己总结 很详细
Adenoviruses Expression System1、从NCBI网站上查找相应基因（如小鼠KL14基因）的编码区，即CDS序列。
2、根据KLF14 CDS设计相应的引物，PCR来扩增KLF14的编码序列，即KLF14的cDNA3、将扩增出来的cDNA序列连接到PGEM-Teasy载体，蓝白斑筛选，挑取白斑摇菌，提质粒，EcoR I 酶切鉴定，然后送测序4、测序正确后用限制性内切酶把cDNA切下来连接到pcDNA3.1载体(很重要的一种表达载体)上，做报告基因实验。
5、双荧光报告基因检测其对下游的靶基因启动子有作用以后，用合适（HindIII和XhoI）的限制性内切酶将连接到pcDNA3.1上的KLF14 cDNA切下来，凝胶回收，同时也切pAdTrack-CMV 回收。
把KLF14 cDNA连接到pAdTrack-CMV载体上。
6、在包装腺病毒之前要先用western检测一下连接到pAdTrack-CMV的KLF14的cDNA能否表达出蛋白。
把第5步连接好的质粒用转染试剂转染293A细胞，然后收细胞（RAPI裂解液，加蛋白酶抑制剂），提取蛋白，做western，杂标签抗体（Myc或Flag）。
只有在293A细胞有表达之后才可以继续包装。
7、在第5步最好多提取一些连接好的KLF14 cDNA-CMV质粒，浓度高点。
然后用PmeI酶切，让这个质粒线性化（大概要切10ug左右，50ul的体系）。
然后跑胶回收切开的质粒，一般PmeI都可以完全切开，大概要回收3-4ug。
8、将回收的线性化产物加入到BJ5183感受态细菌中（该细菌中已经含有pAdEasy-1质粒），电转化让其发生重组。
然后在kanamycin抗性的平板上筛选，就按一般的热激，涂板的方法转化就可以。
因为重组后的pAdTrack-CMV-KLF9+ pAdEasy-1非常大，大约41.5kb，所以要差不多在37度细菌孵箱中生长16-20h才可以，即使长出菌落，也是非常小的那种。
病毒包装实验整体流程及原理(慢病毒、腺病毒)
广州英思特生物科技有限公司为您提供高效快速的病毒包装实验外包服务，公司网址：有需要请联系丘先生病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1 慢病毒1.1.1 原理慢病毒( Lentivirus )是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA 慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2 特点1) 直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2) 可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3) 可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4) 无需任何转染试剂，操作简便。
5) 可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3 慢病毒包装简要流程：1) 含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
1) 2) 3) 4) 5)2) 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞 293T 等。
3) 培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4) 病毒的纯化和浓缩。
5) 分装、-80 C 保存。
6)滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、 腺病毒 1.2.1原理腺病毒(Adenovirus , Ad)是一种无包膜的线状双链DNA 病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad 载体都是基于血清型 2和5,通过转基因的方式取 代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
维真腺病毒扩增流程
腺病毒扩增的步骤
1.转染前1d将293A细胞接种于10cm皿，密度为1-2×106，加入10ml新鲜DMEM培养
基(含10%胎牛血清)进行培养，当细胞汇合度达到70-80%时（约1×107）进行腺病毒感染。
2.以腺病毒滴度1010 vp/ml为例，一般取50ul病毒液加到铺好的细胞中。
3.感染后24-48h，每天镜检两次，观察细胞是否出现CPE（细胞病变效应）。
当CPE接近
完成（即大多数细胞呈类圆形），用移液管将皿上的细胞吹至培养液中。
4.收集细胞和培养液。
1500g离心7min收集细胞。
除去上清液，悬浮细胞用1ml病毒冻
存液（10mM Tris-Hcl，pH=8.0，MgCl2 2mM，4%蔗糖）重悬。
5.反复冻融细胞4次释放病毒颗粒。
12000g离心2min，除去细胞碎片。
弃沉淀，保存上
清液中的病毒。
6.病毒上清于-80℃冻存或用于病毒滴度测定。
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腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染
一、包装
1.包装细胞
详情见AD-293 Cells.pdf，AdEasy™ Adenoviral Vector System.pdf（P31-P32）2.细胞转染
方法一、
详情见Adeno-X Expression System 1 User Manual.pdf（P28-P29）
C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒.pdf
3.病毒收集
详情见AdEasy™ Adenoviral Vector System.pdf（P34）
二、扩增
详情见Adeno-X Expression System 1 User Manual.pdf（P29-P30）
三、纯化
(i) 病毒上清（接一、包装3.病毒收集）.
(ii) Add 51 ml of a 50% PEG 6000 solution.
(iii) Add 21.7 ml of a 4 M NaCl stock solution.
(iv) Add 23.3 ml of PBS. This will result in a final volume of 300 ml. The final PEG 6000 concentration will be 8.5% and the
final NaCl concentration will be B0.3 M.
(v) Distribute the sample as 150-ml aliquots in two 250-ml polypropylene
wide-mouthed bottles.
(vi) Store the bottles at 4 1C for 1.5 h. Mix contents every 20–30 min.
(vii) Centrifuge bottles at 7,000g for 10 min at 4 1C using a Beckman fixed-angel JLA-10.500 rotor.
(viii) After centrifugation, a white pellet should be visible.
(ix) Carefully decant the supernatant and add 1.2 ml of 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, per
bottle. Resuspend the pellets by
vigorously pipetting liquid up and down.
(x) Vortex the bottles vigorously for 20–30 s to further resuspend the pellets.
(xi) Transfer the vector suspension into screw-cap microfuge tubes in aliquots of 100 ml.
(xii) Snap-freeze the tubes in crushed dry ice and store at -80 。
C.
a.按照10ml的病毒上清加入2.5ml的50%PEG6000混合；
b. 加入1.064ml的4M的NaCl混匀；
c. 加入1.142ml的PBS混匀；
d. 4°C下，孵育1.5h，每20-30min颠倒混匀；
e. 4°C下，7000g离心10min。
f.小心移除上清，切勿触动白色沉淀，如果白色沉淀出现松动，可以在7000 g 下短暂离心；
g. 加入原病毒上清1/200 to 1/100 体积的PBS重悬沉淀病毒粒子；
h. 立即对浓缩纯化的病毒粒子进行滴度测定，并分装后（50-100ul/管）冻存于-80°C超低温冰箱中；
上述所需试剂配制方法见Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.pdf（P3）
四、滴度测定
病毒滴度测定-针对有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc
病毒滴度测定-针对没有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc
五、感染
详情见Adeno-X Expression System 1 User Manual.pdf（P31）
a. 感染前24小时，把细胞传代至35 mm平皿中，加入完全培养基至终体积3ml，培养过夜，感染时，细胞密度为80–90%；
b. 把冻存于-80°C的病毒取出并在室温下冻融；
c. 用新的完全培养基更换培养液，并加入冻融的病毒粒子（MOI为50-100）和polybrene（4 μg/ml），培养液终体积为3ml；
d. 感染8-24h后，用新3-4ml新完全培养基更换感染培养液；
e. 感染48小时后收取细胞进行QPCR检测，感染72小时后收取细胞进行WB 检测；。