蛋白质组学思考题答案

1.蛋白质组学概念？

蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，从蛋白质整体水平上来认识生命活动规律的科学。

2.蛋白质分离纯化的基本原则？

（1）获得尽可能多的样品蛋白

（2）不同的制备方法配合使用

（3）制备的方法与后续研究相结合

3.细胞破碎的方法有哪些？

（1）温和裂解方法：冻融，渗透，去污剂，酶消化法，匀浆法

（2）强烈裂解方法：超声波，玻璃珠，研磨法

4.蛋白质裂解液使用还原剂、去污剂及变性剂的作用分别是什么，熟悉经常用到的试剂？

（1）去污剂：有助于溶解膜蛋白质，并有助于膜蛋白质与脂类的分离。常用的有离子型去污剂（SDS），非离子型去污剂（TritonX-100），两性离子去污剂(CHAPS)。

（2）变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。常用的有尿素和硫脲。

（3）还原剂：用于还原二硫键或防止蛋白质氧化，增加蛋白质的溶解性。常用的有具游离巯基的β－巯基乙醇（β－ME），二硫苏糖醇（DTT）和不带电荷的三丁基膦（TBP）。

5.蛋白质裂解液中加入两性电解质的作用是什么？

（1）起载体作用

（2）捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性

6.影响样品制备的干扰物质有哪些？

（1）盐（NaCl）

（2）离子去污剂（SDS）

（3）核酸、脂类及多聚糖

（4）酚类复合物

（5）不溶物质

7.实验时去除植物材料中酚类物质的方法是什么？

（1）还原状态：通过氢键与蛋白结合；处理方法：添加PVPP，形成多酚物（2）氧化状态（醌）：发生共价结合；处理方法：添加还原剂 (DTT, 抗坏血酸, 亚硫酸盐)

8.凝胶的分子筛效应？

凝胶分离不同分子量大小的分子的特性称为分子筛效应。

9.双向电泳第一向进行胶条水化时的两种方式是什么？各有什么特点？

（1）主动水化：低电压可以让高分子量的蛋白更好地进入胶条

（2）被动水化：蛋白自然地进入胶条；用于高盐浓度的蛋白样品；水化后, 在电极处使用滤纸片除盐，如果在水化前使用滤纸片会导致蛋白被吸附在滤纸片上10.双向凝胶电泳的基本原理？

2D-SDS-PAGE是两种分离方法的结合

（1）根据等电点用IEF分离蛋白质

（2）在聚丙烯酰胺凝胶上电泳进一步分离聚焦的蛋白质根据等电点的不同，第二向电泳根据分子质量的不同分离蛋白质

11.双向凝胶电泳的基本流程？

(1)等电聚焦：标记胶条→样品上样及水化→置于聚焦盘内→设定IEF电泳程序→加矿物油覆盖胶面

(2)胶条平衡：先在含有SDS、还原剂DTT但不含碘乙酰胺的平衡液中平衡，再在含碘乙酰胺的平衡液中平衡

(3)SDS-PAGE：制胶→样品制备→加缓冲液→连接电源→电泳

(4)染色：染色液及脱色液的配制→染色→脱色

12.双向电泳中第一向到第二向进行平衡过程的机理？

平衡buffer 1：还原(将S–S键转化为SH)，DTT

平衡buffer 2：烷基化物 (使每个SH均烷基化以防止S–S键的重新形成),碘乙酰胺

13.蛋白凝胶染色的方法有哪些？各有哪些优缺点？

（1）考马斯亮蓝法

优点：选择性地对蛋白质进行染色，大大地降低了化学噪音，提高了灵敏度（2）胶体考染法

优点：考马斯亮蓝定量地与蛋白质结合，可以准确定量蛋白质；

缺点：蛋白质谷氨酸羧基侧链不可逆的酯基化（酸催化下），使得肽谱数据失真（3）银染法

优点：大大提高了灵敏度；扩展了动态线性范围兼容质谱（去除戊二醛后）；快速，方便

缺点：银离子可与半胱氨酸残基结合；银染试剂戊二醛和甲醛都会对蛋白质的α-和ε-氨基烷基化，妨碍后续分析

（4）SYPRO染料

优点：快速，灵敏，终点式染色易操作；动态线性范围广，染色覆盖范围广；不干扰后续分析。

14.正相和反相液相色谱的区别？

（1）正相色谱法：采用极性固定相；流动相为相对非极性的疏水性溶剂，常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。

（2）反相色谱法：一般用非极性固定相；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。

15.分子离子、质荷比定义？

（1）分子离子：气态分子失去一个电子所得的离子叫做分子离子。

（2）质荷比（m/z)：质谱检测的分子离子的质量与其所带电荷的比值。

16.生物质谱的基本原理是什么？

分析样品在特定的条件下转变为高速运动的离子，这些离子根据质量/电荷比的不同在静电场和磁场的作用下得到分离，用特定的检测器可以记录不同质荷比的各种离子的相对强度并形成质谱图。

17.生物质谱仪由几个主要部分组成？

基本部分：（1）离子源

（2）质量分析器

（3）检测器，检测由质量分析器分离的离子

其他部分：（1）复杂计算机

（2）真空泵系统

18.比较MALDI和ESI的异同点？

MALDI离子源工作原理：

(1)以脉冲方式使样品离子化，从固相标本中产生的离子，并在飞行管中测定分子量

(2)将分析物分散在基质分子（尼古丁酸及其同系物）中并形成晶体，用激光照射晶体，由于基质分子经辐射所吸收的能量导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，导致基质和分析物膨胀并进入气相

(3)样品被包裹在基质中，大部分激光能量被基质的发色基团首先吸收，从而保护了样品分子的完整性

MALDI

优点：能够耐受高盐；具有较高的质测上限；能分析混合物；敏感度为fmol；可发展为蛋白及核酸测序手段

缺点：质量分辨率＜500*；质量测定精确度为± 0.1% ～±0.01%；不能与液相色谱联用

ESI离子源工作原理：

原理：样品通过液流流动（通常从HPLC）进入离子源，穿过有持续高压的不锈钢锥体或进样针，随着液流利开进样针样品分散为细雾状微滴。微滴含有肽离子以及HPLC流动相组分（水、乙腈、醋酸等）。离子源进一步从溶液组分中分离肽离子，将离子转移到质量分析器。

ESI

优点：能与HPLC、CZE联用；能形成多价离子，可更为准确地测定分子量；质量分辨率为2000以上*；可以直接从水相观察非共价复合物；敏感度为fmol ～pmol；质量测定精确度为±0.01%

缺点：在分析混合物时，多价离子形成会使结果分析比较困难；仅在低盐（＜

1mmol/L）条件下给出理想信号；样品组成过于复杂时可能不产生信号信号

19.肽质量指纹图谱是如何鉴定蛋白质的？

PMF原理：将由质谱获得的肽段实验质量数据与数据库中已知蛋白的肽段理论数据对比已达到鉴定蛋白的目的。

eg：蓖麻毒素（Ricin）

MALDI-TOF质谱的测定，得到Ricin的分子量为62925Da

↓

根据Ricin的肽质量指纹图谱，共检出22条肽谱峰

↓

将这些肽片段的质量数据用MASCOT搜索引擎在SwissProt数据库中进行PMF检

索

21.什么是二级质谱图？

二级质谱图：在一级质谱图中，选择其中的一个峰，对其进行CID过程，就得到一张二级质谱图。

CID：碰撞诱导解离,是通过撞击使得多肽的肽键断裂的过程。

22.目前鉴定蛋白质磷酸化的主要技术手段有哪些？

（1）抗体法：主要采用磷酸化蛋白质抗体富集磷酸化蛋白；专一性强、效率高。（2）离子交换色谱：离子交换色谱的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。可分为强阳离子交换色谱和强阴离子交换色谱。