实验19 海洋沉积物中磷分级提取及生物可利用磷的估算

实验十九海洋沉积物中磷分级提取及生物可利用磷的估算
一、实验目的
1、掌握海洋沉积物中磷分级提取方法
2、学会估算海洋沉积物中生物可利用磷
二、实验原理
磷是海洋浮游植物生长的重要营养元素，也是引发水体富营养化的重要因素。

近年来，近岸海域由富营养化引起的赤潮灾害爆发频率逐年增加，导致海洋生物系统的退化。

海底沉积物是海水磷的“源”与“汇”，它既可接受来自水体的磷，也可以在适当的条件下向上覆水体释放磷，从而进一步加剧水体的富营养化水平。

沉积物在生源要素磷的循环过程中起着十分重要的作用，从某种意义上，对沉积物中磷的形态研究是进行磷的海洋生物地球化学循环研究的前提，也是预防赤潮发生及进行海域污染治理和保护的保障。

海洋沉积物中磷含量不高，根据沉积物中磷的结合态和化学性质的差异，可将其分为无机磷和有机磷，如下图所示：
磷灰石磷（AIP）：Ca-P
无机磷（IP）
总磷（TP）非磷灰石磷（NAIP）：（Fe+Al）-P
有机磷（OP）
研究表明，分离和定量测定海洋沉积物中各种形态磷的最理想的方法是化学试剂提取法。

化学试剂提取法是基于给定提取剂对某一结合形式磷选择性的操作性定义，该方法要求样品中磷的含量大于0.005％，精密度可达4％。

、NaOH和HCl对海洋沉积物中磷进行三步提取，以便估算本实验采用MgCl
2
沉积物中磷的生物可利用性。

第一步用MgCl
提取磷，包括了悬浮物中浮游植物
2
细胞内的磷和吸附于悬浮颗粒物中水合氧化物表面的磷。

第二步用NaOH提取磷，提取的主要是颗粒物中被Fe、Al水合氧化物吸附的磷和一部分铁铝磷酸盐，这部分磷被称为是Fe-P、Al-P。

第三步用HCI提取磷，提取的主要是磷灰石磷，
这部分磷难以被生物所利用。

因此，能被生物所利用的磷是MgCl
2
提取相和NaOH 提取相的磷。

三、实验步骤
1.海洋沉积物中总磷（TP）消解
平行称取40mg站位3的沉积物三份，分别放入50mL具塞玻璃比色管中，再
加入5% K
2S
2
O
8
10mL和6mol/L H
2
SO
4
0.83mL,盖上塞子，用保鲜塑料扎紧瓶口
(防止高温高压后溶液沸腾溢出)，于120C高压消解0.5h,自然冷却至室温。

将溶液转移至50mL聚乙烯离心管中，用少量蒸馏水将比色管中的残渣洗涤干净，洗涤液并入离心管中，以4000r/min转速离心10min后，上清液倒回原比色管，而离心管中的残渣用20mL蒸馏水搅匀后再以同样的时间和速度离心，上清液并入原比色管。

用10mo/L NaOH约0.8mL中和pH为5-7后，用蒸馏水定容至50mL,摇匀静置，待黄色颗粒物沉淀完全后，移取10mL上清液于50mL比色管中，定容后按磷钼蓝法测定含磷量。

注意:由于所测样品总磷含量未知，建议三份样品先用一份取一定体积稀释后显色，视其含量是否在测量范围（稀释5倍）。

2.海洋沉积物中不同存在形态磷的分级提取
图1 海洋沉积物各种形态磷的分级提取流程示意图
2.1 MgCl
2提取相磷（MgCl
2
-P）的提取
平行称取50mg站位3的沉积物三份，分别放入50mL具塞聚乙烯离心管中，加入20mL 1.0mol/L MgCl
2
，，放入振荡床中振荡提2h(200rpm/min)后，以4000r/min转速离心10min,将上清液小心倒入50mL小烧杯中后移取15mL上清液于50mL具塞比色管，定容至50mL,用磷钼蓝法测定含磷量。

同时做一份空白。

残余的上清液倒净后，取20mL蒸馏水倒入离心管，搅动残渣，再次离心后弃去蒸馏水，进行下一步的提取。

2.2 NaOH提取相磷(NaOH-P)的提取
取0.1mol/L NaOH溶液20mL,倒入MgCl
2
提取后剩余残渣的离心管中，搅句，振荡4h后，离心10min(4000rpm/min)。

将上清液小心倒入50mL小烧杯中后移取15mL上清液于50mL具塞比色管，加入1滴酚酞指示剂，用若干滴1.0mol/L HC1中和至pH=7后定容至50mL。

移取10mL于50mL比色管中，定容后用磷钼蓝法测定含磷量。

同时做一份空白。

残余的上清液倒净后，取20mL蒸馏水倒入离心管，搅动残渣，再次离心后弃去蒸馏水，进行下一步的提取。

2.3 HC1提取相磷(HCl-P)的提取
取1.0mol/L HCl溶液20mL,倒入NaOH提取后剩余残渣的离心管中，搅匀，振荡1h后，离心10min(4000rpm/min)。

将上清液小心倒入50mL小烧杯中后移取15mL上清液于50mL具塞比色管，用0.8mL 10mol/L的NaOH调节溶液pH=7，用磷钼蓝法测定含磷量。

同时做份空白。

3.磷钼蓝法测定活性磷酸盐
3.1 工作曲线制作
分别移取磷标准使用液0、0.5、1.00、1.50、2.00、2.50mL于50mL比色管中，用蒸馏水稀释到刻度；加入混合试剂5mL，混匀；10min后以蒸馏水为参比，用5cm比色皿在880nm波长下测其吸光值A。

3.2样品测定
取50mL水样，按照工作曲线的制作步骤操作，测定吸光值A
b ，将(A
b
-A
)代
入线性回归方程求样品浓度。

四、实验数据及处理
1. 标准工作曲线绘制
表1 标准工作曲线数据表
磷标准使用液使用
量（mL ）
溶液浓度
吸光值A A-A 0 0 0 0.001 0.000 0.50 2.48 0.083 0.083 1.00 4.96 0.166 0.165 1.50 7.44 0.246 0.245 2.00 9.92 0.321 0.320 2.50
12.4
0.417
0.416
溶液浓度 ，M P 取31g/mol 以浓度为纵坐标，A-A 0为横坐标，求线性回归方程Y(mg/L)=a+b(A-A 0)；其中A 0为试剂空白。

图2 标准工作曲线
由标准工作曲线得到溶液浓度与吸光值的关系：y = 0.3021x + 0.0001（R² = 0.9991）
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12
0.14 0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
溶液浓度m g /L
相对吸光值A-A 0
2.海洋沉积物中总磷（TP）的测定
表2 海洋沉积物中总磷（TP）的测定数据表
序号吸光值A A-A
0样品质量
g
浓度（稀释5倍）
mg/L
TP含量
mg/kg
空白0.026 0.000 / / /
1 0.449 0.423 0.0401 0.129 80.4
2 0.338 0.312 0.0398 0.095
3 59.9
3 0.386 0.360 0.0401 0.110 68.6
由于实验过程中直接移取样品1上清液用于预实验，再次移取时与下层距离较近，可能受到下层沉淀的影响而使得样品1测得吸光值较大，故将样品1测得数据舍去，取样品2和样品3测得的平均值作为总磷含量：
总磷含量
3.海洋沉积物中不同存在形态磷的分级提取
表3 海洋沉积物中不同存在形态磷的分级测定数据表
序号样品质量
g
吸光值A
MgCl
2
-P NaOH-P（稀释5倍）HCl-P
空白/ 0.029 0.003 0.030
1 0.0501 0.104 / 0.175
2 0.0500 0.105 0.111 0.179
3 0.0500 0.098 0.10
4 0.166 MgCl
2
-P：
NaOH-P：
HCl-P：
表4 海洋沉积物中不同存在形态磷的分级数据处理表
序号
分级磷含量 mg/kg
MgCl
2
-P NaOH-P HCl-P
1 2.36 / 4.48
2 2.39 16.8 4.60
3 2.18 16.7 4.21
平均 2.31 16.8 4.43
平均
生物可利用磷含量
表5 海洋沉积物中不同形式磷的分析记录表
序号总磷测定
样品重量
g
总磷含量
P
T
mg/kg
分级提取
样品重量
g
MgCl
2
-P NaOH-P HCl-P
mg/kg
1 0.0401 / 0.0501 2.36 / 4.48
2 0.0398 59.9 0.0500 2.39 16.8 4.60
3 0.0401 68.6 0.0500 2.18 16.7 4.21
平均0.0400 64.2 0.0500 2.31 16.8 4.43
五、实验讨论
1、用10mol/L NaOH溶液调节总磷消解液的pH时，为什么pH不能超过7？
因为磷钼蓝法测定活性磷酸盐需要在偏酸性条件下进行，磷钼黄碱性条件下会溶解，如果pH>7，钼酸铵就无法与磷酸盐反应生成磷钼黄，无法显色。

2、本实验用酸性K
2S
2
O
8
氧化法消解沉积物，测定得到的总磷包括哪些磷？
磷灰石无机磷（AIP）、非磷灰石无机磷（NAIP）、结合态或络合态的有机磷（OP）等。

3、MgCl2提取后的沉积物（残渣）如果不用蒸馏水洗涤离心，直接加入NaOH进行下一步的提取可以吗？为什么？
蒸馏水离心实际上起到了洗涤的作用，若不洗涤，离心管内残余的MgCl
会
2
沉淀也与NaOH反应，消耗了NaOH，影响NaOH的提取效果；同时，生成Mg(OH)
2
会对后续HCl的提取造成影响。

4、其他注意事项？
分光光度计与透光度有关，消解液和提取液的透明度是影响磷含量测定的关键步骤之一，故离心、移取上清液等步骤需小心，不可将残渣带入上清液，可用吸管小心吸出，避免倾倒带来的搅动。

由于所测样品总磷含量未知，实际测量时三份样品可先用一份取一定体积稀释后显色，视其含量是否在测量范围（稀释5倍），再做后续实验。

调节pH时选用浓度合适的酸或碱，实验较繁琐，合理安排时间。