鼠源抗体的人源化设计

鼠源抗体的人源化设计

前言 (1)

方法 (2)

结果与讨论 (3)

鼠源抗体筛选人源框架 (3)

人源化抗体CDR的改造 (4)

结论 (6)

附录 (6)

参考文献 (7)

前言

第一个人用抗体药物来自鼠源抗体，直到现在鼠源抗体仍然是抗体药物的一大来源[Pogson et al.,2016]。由于鼠源抗体的免疫原性，一般会对其作人源化处理。目前最通用的方法是将鼠抗的CDR序列移植到人源框架上[Hwang et al., 2005]。通常CDR移植后的人源化抗体与抗原的亲和力会减弱，如何保持人源化抗体的亲和力是目前最大的技术瓶颈。通过高通量的筛选方法可以得到适合CDR

移植的人源框架，但是这种实验方法周期长，价格昂贵[Townsend et al.,2015]。为了快速筛选出适合的人源框架，研究者利用序列比对和结构模拟的方法筛选出适合的人源框架，然后通过实验验证抗体与抗原的亲和力，减少了实验工作量，节约了成本和时间，未来会成为具有潜力的抗体人源化设计方法[Kurella et al., 2014;Choi et al.,2015;Choi et al.,2016]。本文采用自主开发的抗体人源化设计程序，对已知的鼠源抗体进行人源化设计，结果表明计算的方法可以筛选出序列同源性靠后但是亲和力更高的人源化框架。

方法

抗体阻断蛋白-蛋白相互作用的受体和配体结构已知（图1）。配体与抗体结合的区域重叠在受体和配体结合的区域（图2），所以鼠源的抗体可以有效阻断受体和配体的相互作用[Apgar et al.,2016]。通过鼠源抗体的人源化设计可以最大限度减少抗体的免疫原性。首先使用鼠源抗体（PDBID为5F3B）的序列在人源框架库中搜索排名靠前的序列作为候选序列，然后将人源序列同源建模到鼠源抗体的骨架上，保留鼠源CDR的序列，然后计算同源模型的能量，判断人源化抗体的稳定性。人源化CDR突变体采用相同的策略，不同之处在于替换鼠源CDR 序列为突变体序列，并且保留抗原的结构。

图1蛋白受体和配体复合体结构

图1中，黄色为配体结构，紫色为受体结构片段（PDBID：1NYU）

图2受体和配体以及抗体的复合体结构

图2中，黄色为配体结构，紫色为受体结构片段，绿色和青色为鼠源抗体重链和轻链。鼠源抗体的PDBID为5F3B。

结果与讨论

鼠源抗体筛选人源框架

使用鼠源抗体的序列在人的抗体框架库中筛选序列相似性靠前的框架，如图3所示，鼠的H链（5F3BH）可以找到相似性靠前的HM855688和AM940223两个框架，其中AM940223与实验使用的人源H链（5F3HH）完全一样。鼠的L链（5F3BL）可以找到相似性靠前的5个框架，没有出现与实验完全一样的人源L链（5F3HL）。实验并没有选择序列相似性排第一的人源框架（HM855688_X59318），而是排名靠后的人源框架（如图3所示，5F3HH_5F3HL与AM940223_X59318的相似性很高）。以上结果表明，鼠源序列相似性最高的人源框架并不一定是最合理的。由此可见，

利用序列相似性筛选人源框架并不能保证成功。合理的筛选标准应该能够表示抗体的稳定性，成药性等。其中抗体的稳定性可以用能量来表示，能量越低越稳定。如图3所示，AM940223_X59318的能量最低（能量取反），该人源框架最稳定（见附表1）。所以，通过能量筛选出的人源框架与实验最接近。

图3人源化框架的序列相似性和能量

图3中，横坐标表示与鼠抗H链序列相似性排前两位的人源框架，以及与鼠抗L链序列相似性排前5位的人源框架。纵坐标表示序列相似性以及链内能量（能量取反，见附表1）。其中5F3HH_5F3HL是实验使用的人源化框架，AM940223_X59318是计算筛选出的最稳定的人源化框架。

人源化抗体CDR的改造

为了减小人源化抗体中CDR的免疫原性，研究者通过突变CDR来获得与人源CDR相似的序列。这种突变虽然减少了鼠源CDR的免疫原性，但是同时也减小了抗体的与抗原的亲和力。实验的方法可以实现高通量筛选亲和力强的人源化CDR 突变体，但是工作量大，成本高，时间长。计算的方法已经被用于类似的研究，可以加速筛选到高亲和力并且低免疫原性的人源化抗体。我们使用CDR构象模拟的方法，计算了不同CDR突变体的亲和力，结果表明计算得到的结合能与抗体抗原亲和力高度相关（如图4，5所示，数据见附表2）。

图4不同人CDR突变体的亲和力与计算的结合能相关性图4中，横坐标表示用Biacore方法测得不同CDR突变体与靶蛋白的亲和力，纵坐标表示以鼠源抗体（5F3B）为模板，计算得到的不同CDR突变体与靶蛋白的

结合能。

图5不同人CDR突变体的亲和力与计算的结合能相关性图5中，横坐标表示用ELISA方法测得不同CDR突变体与靶蛋白的亲和力，纵坐标表示以鼠源抗体（5F3B）为模板，计算得到的不同CDR突变体与靶蛋白的

结合能。

结论

综上所述，我们提供了一种基于同源建模能量的抗体稳定性指标用于筛选鼠源抗体的人源化框架，以及基于抗体抗原结合能的亲和力判定方法。计算的结果与实验高度相关。

附录

附表1人源化框架与鼠抗的序列相似性以及计算的能量

HM855688_V01576188.522181.494-1335.87-1170.72

HM855688_Y14865188.522181.4436-1333.14-1162.41

bHM855688_X63398188.522180.9864-1335.87-1156.87

5F3HH_5F3HL185.748185.4072-1339.78-1172.53

AM940223_X59318185.748186.4776-1339.73-1180.94

AM940223_M64855185.748186.4284-1339.78-1173.34

AM940223_V01576185.748181.494-1339.78-1170.72

附表2鼠抗及其人源化版本的亲和力以及计算的结合能

Construct Biacore KD

a)ELISA IC50

a)

BiacoreΔG

b)

ELISAΔG

b)

ΔE

C)