基因毒性杂质控制
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质量管理部 分析三室 2016年6月
1
1
基因毒性杂质的定义
2
ICH M7介绍
3
基因毒性杂质的控制
4
当前需要关注的一些方面
2020/3/24
2
杂质按照毒性分为一般杂质和毒性杂质。基因毒性杂质 是一类可与DNA反应，造成DNA损伤，在很低水平下即可诱发
基因突变，并可能致癌的杂质。
PGIs（potentially genotoxic impurities 潜在基因毒性的杂质） GIs（ genotoxic impurities 基因毒性杂质）
需控杂质与已建立可接受限度的中间体物化特性相似，清除方式相似， 且残留更低。
案例4：高反应活性基因毒性物质（二氯亚砜）。
根据反应活性不可能残留。
上述案例详见M7 第25页：
2020/3/24
26
附 关于杂质限度的界定方法
在满足以下1或多种条件视为得到界定（制剂同原料药）
(1) The observed level and proposed acceptance criterion for the impurity do not exceed the level observed in the reference listed drug product.
➢ 方法2：起始原料或中间体标准或中控过程中控制在可接受限度以下；
➢ 方法3：起始原料或中间体标准或中控过程中控制在可接受限度以上；
明确杂质的去向及清除过程； 根据实验室研究，成品残留在可接受限度的30%以下（推荐加标试验）； 必要时有中试或商业化批数据支持。
➢ 方法4：充分理解工艺参数和影响杂质残留因素，有足够信心保证原 料药中残留在可接受限度以下，不需检测（不定入任何标准）。
化合物特定限度或以下
已知有致突变性但致癌性未知 2 的物质（细菌突变试验阳性， TTC限度或以下
无啮齿动物致癌数据）
TTC限度或以下；或进行细菌致
3
含警示结构的物质，与API结构 突变性试验。
无关，无致突变性数据
如果无致突变性=第5类；
如果有致突变性=第2类。
所含警示结构与活性成份（API）
4
相同，或与已证实无基因毒性 原料药结构相关化合物的警示
2020/3/24
11
3、举例如下：
例1：瑞戈非尼(Regorafenib)
加拿大审评报告中，一个中间体Ames结果阳性，大鼠肝慧星致突变试验确立NOEL（无反应剂量 水平），提示每日最大摄入该杂质为0.0027mg/kg，如果体重按50kg计，则摄入量为 0.0027×50=0.135mg；瑞戈非尼日最大用量为160mg，故可推测其标准中该杂质限度为 0.0027×50kg/160=0.084%，即840ppm。（显著大于基于TTC水平的约9ppm限度）
文献：STIVARGA® regorafenib tablets 40mg PRODUCT MONOGRAPH 第36页
2020/3/24
12
3、举例如下
例2： 恩杂鲁胺 • FDA审查资料列出三个有警示结构杂质的化学名和基因毒性的实验
代号，但没有提供实验结果； • 日本的公开资料中则有实验代号和结果； • 通过对比实验代号的一致性，获知这几个杂质的试验结果为阴性。
Group 3:Heteroatomic Groups(含杂原子化合物）
A N
A
Aminoaryls and alkylated aminoaryls 芳香胺和烷基取代的芳酰胺
O
O NH2 A
Carbamates 氨基甲酸类
AA
NN
A
R
Hydrazines and azo Compounds 肼和偶氮化合物
N+ _ O
N-Hydroxyaryls N-羟基苯胺
N-Acylated aminorryls N-酰化氨基苯
Aza-aryl N-oxides 氮杂芳基N-氧化物
Group 2:Alkyl and Aryl Groups(烷烃和环烷烃类化合物）
O AH
OH N AA
NO N AA
A NO2
Aldehydes 醛
（2）特定限度控制策略
• 计算：已知致癌活性（如半数致癌剂量TD50），线性外推可接受限度，按十万分之 一风险计算，TD50/50000，据此计算限度(见第16页，note4,环氧乙烷)；
• 参考：如有化学结构相似，且特定限度已确定的化合物，在提供结构相似合理性
及支持数据前提下，可参考计算限度；
• 计算：如前例，已知NOEL，计算杂质的PDE，结合每日最大用药剂量计算限度；
理化性质如反应活性，溶解性、挥发性，电离度等分析。
2020/3/24
23
方法3：案例1（M7 第24页 case1）
a、中间体X距原料药尚有2步反应，标准定入杂质A，杂质A化学性质稳定； b、将杂质A以不同浓度加入中间体X进行加标试验，达1%水平能持续从原
料药中去除至限度的30%以下； c、中试规模多批次成品杂质A结果低于基于TTC限度的30%以下；
＞10年至 终生
60
30
5
• 上表只适用于原料药有3个或3个以上分类2或3杂质。（结构相似，推测基因 毒性作用方式及分子靶向相同的杂质推荐总量为1.5微克/天，或根据情形进行 说明 EMEA Questions and answers on the ‘Guideline on the limits of genotoxic impurities’ 问题7）；
详见ICH Q3C.
2020/3/24
16
4、基因毒性杂质的限度
（3）非终生暴露（Less than lifetime,LTL）的控制 采用Staged TTC Approach
单个基因毒性杂质可接受摄入量
治疗期
日摄入量 （μg/day）
≤1月 120
Байду номын сангаас
＞1-12月 20
＞1-10年 10
＞10年至 终生
① 合成工艺杂质：
起始物料、中间体中检出的杂质；（杂质谱分析！） 从起始物料至成品整个路线中可能的反应副产物；（杂质谱分析！） 长路线早期的部分杂质或许可以忽略；（反应步骤！） 基于风险角度提供依据说明工艺路线中哪个节点后的杂质应作致突变性
评价；（反应步骤！） 工艺后期步骤使用的起始物料，应对该起始物料最后一步合成涉及的基
杂质谱分析时要特别关注！ 基因毒性杂质的控制是药品质量关注的重点！
对业界和监管部门是一个巨大的挑战！
2020/3/24
3
EMEA、FDA及ICH均相继发布了关于遗传毒性 和致癌性杂质相关的指导原则。
2020/3/24
4
2020/3/24
5
2020/3/24
6
原料药及制剂杂质评估
(Drug substance and drug product impurity assessment M7 第4页 )
结论：中间体X标准中杂质A控制限度1.0%可接受，原料药标准不再
检测。
2020/3/24
24
方法3：案例2（M7 第24~25页 case2）
根据加样研究获得的预期清除率
a、一个5步合成工艺，起始物料Y 在第3步引入，物料Y标准中定入基因毒性杂质 B，控制限度为0.1%；
b、为确定0.1%限度是否可接受，进行实验室清除研究试验。将杂质B以不同 浓度（最高10%）加入起始物料Y进行加标试验；
上述条件满足分类3。
结论：按一般杂质控制。
2020/3/24
13
需充分检索和对比文献后，确定控制策略！
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14
4、基因毒性杂质（分类1、2和3）的限度
（Risk characterization M7 第7页）
（1）基于TTC的控制
一般为长期用药（＞10年）、杂质无致癌性数据（分类2和3）； 杂质控制水平为1.5μg/日；
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10
2、致癌风险控制水平TTC
❖ TTC是一个假设性概念，控制肿瘤发生风险水平为 1：100000，即十万分之一；
❖ 基于平均每日1.5μg的摄入水平，且终生（以70年计）暴露； ❖ 是指累积剂量，摄入总量：
1.5 μg/day x×70×365 days=38.3 mg 赖祖亮@小木虫
c、试验得到最后3步的清除因子>500，推算起始物料Y含杂质B为0.1%时，成 品中残留低于2ppm，
d、成品基于TTC的可接受限度为50ppm。
结论： 起始物料Y中杂质B控制限度0.1%可接受，不需提供中试及商业化 批
数据。
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案例3：关于结构相似的基因毒性杂质的控制（芳硝基位置异构体 杂质）；
EWG
Michale-reactive Acceptors 迈克尔加成反应受体
O P
OR
O S
OR
Alkyl Esetrs of Phosphonates or Sulfonates 膦酸酯或者磺酸酯
Halogen
A Halogen
Halo-alkenes 卤代烯烃
Primary Halides 烷烃和环烷烃卤代物
2020/3/24
15
根据毒理学试验数据（NOEL或LOEL）计算允许日暴露量
（permitted daily exposure, PDE）
公式中F1~F5因子的取值 F1: 物种间的差异（大鼠取5，小鼠取12）； F2: 考虑人个体间的差异，一般固定取值10； F3: 暴露时间，取值范围1~10； F4：毒性反应的严重程度，取值范围1~10； F5: NOEL的剂量确立取值1，仅LOEL剂量确立取值10。
因毒性杂质进行评估。（反应步骤！）
② 降解杂质
实际检出杂质：长期稳定性及制剂过程中检出的报告限度以上杂质（ICH Q3A/B ）；
潜在杂质：加速试验及光照试验检出的鉴定限以上杂质，长期未确认。
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7
Group1:Aromatic Groups(芳香族化合物）:
OH N
A
A NA
O
N-Methylols N-亚甲基醇
N-Nitrosamines N-亚硝基胺
Nitro compounds 硝基化合物
O
A
A
Epoxides 环氧丙烷
H N
A
A
Aziridines 氮丙啶类
O O C (S)
(S) N
Halogen
Propiolactones 环丙酯
N or S Mustards β卤代乙胺
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9
1、毒理学关注阈值（a threshold of toxicological concern；TTC）
未作研究（毒理学方面）的化学物质可接受的摄入水平，基于 TTC水平控制下，致癌或其他毒性风险可以忽略。 原料药及制剂致突变杂质TTC值：1.5μg/日。 强致癌性物质（cohort of concern）如黄曲霉素类似物、N亚硝基和烷基-偶氮氧化物除外，这类化合物可接受的限度应显 著降低。
A为烷烃基、芳香基或H；EWG为吸电子取代基，如氰基、羰基或酯基等。 基因毒性的警示结构不只限于以上所列，进一步了解可参见: 马磊,马玉楠等.遗传毒性杂质的警示结构 .中国新药杂志 ,2014，23(18) :2106~11
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8
分类
定义
建议的控制方法
1 已知的有致突变致癌性物质
• 特定限度杂质或分类1的杂质不计入总限度； • 制剂中降解产物单独控制，不计入总限度； • 复方制剂每个活性成分分别控制。
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4、基因毒性杂质的限度
（5）方法中的例外和灵活情形 ➢ 较高暴露于其它来源，如食品或内源性代谢物（如甲醛）。 ➢ 严重疾病； ➢ 预计生存期较短； ➢ 迟发性慢性疾病； ➢ 可选择的治疗方法有限。
以上情形往往可适当提高可接受限度。 要了解治疗的适应证、治疗患者人群和临床治疗的可选
方法！
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22
（1）工艺杂质控制 ➢ 方法1：原料药质量标准中控制在可接受限度以下
至少连续6批中试或连续3批放大检出低于限度30%以下，可周期性检验。
1.5
间隔给药按实际给药天数计，例：某药治疗期2年，每周给药一次，2 年实际给药104天，处于1~12月期间段，限度为20μg/day；
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4、基因毒性杂质的限度
（4）多个基因毒性杂质的控制
多个基因毒性杂质可接受摄入量
治疗期
日摄入量 （μg/day）
≤1月 120
＞1-12月
＞1-10年
按一般杂质控制
结构相同
5
无警示结构，或有充分的数据 证明其警示结构无致突变性
按一般杂质控制
TTC仅适用于分类2和3，分类1应采用杂质特定限度,一般不用TTC； 分类2杂质还分类3可单用杂质进行细菌致突变试验（Ames），如为阴性则解除对警示结构的关注，无
需进一步评估基因毒性；
可进一步进行体内（in vovo）致突变试验，根据结果制定杂质的特定限度。
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1
基因毒性杂质的定义
2
ICH M7介绍
3
基因毒性杂质的控制
4
当前需要关注的一些方面
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杂质按照毒性分为一般杂质和毒性杂质。基因毒性杂质 是一类可与DNA反应，造成DNA损伤，在很低水平下即可诱发
基因突变，并可能致癌的杂质。
PGIs（potentially genotoxic impurities 潜在基因毒性的杂质） GIs（ genotoxic impurities 基因毒性杂质）
需控杂质与已建立可接受限度的中间体物化特性相似，清除方式相似， 且残留更低。
案例4：高反应活性基因毒性物质（二氯亚砜）。
根据反应活性不可能残留。
上述案例详见M7 第25页：
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附 关于杂质限度的界定方法
在满足以下1或多种条件视为得到界定（制剂同原料药）
(1) The observed level and proposed acceptance criterion for the impurity do not exceed the level observed in the reference listed drug product.
➢ 方法2：起始原料或中间体标准或中控过程中控制在可接受限度以下；
➢ 方法3：起始原料或中间体标准或中控过程中控制在可接受限度以上；
明确杂质的去向及清除过程； 根据实验室研究，成品残留在可接受限度的30%以下（推荐加标试验）； 必要时有中试或商业化批数据支持。
➢ 方法4：充分理解工艺参数和影响杂质残留因素，有足够信心保证原 料药中残留在可接受限度以下，不需检测（不定入任何标准）。
化合物特定限度或以下
已知有致突变性但致癌性未知 2 的物质（细菌突变试验阳性， TTC限度或以下
无啮齿动物致癌数据）
TTC限度或以下；或进行细菌致
3
含警示结构的物质，与API结构 突变性试验。
无关，无致突变性数据
如果无致突变性=第5类；
如果有致突变性=第2类。
所含警示结构与活性成份（API）
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相同，或与已证实无基因毒性 原料药结构相关化合物的警示
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3、举例如下：
例1：瑞戈非尼(Regorafenib)
加拿大审评报告中，一个中间体Ames结果阳性，大鼠肝慧星致突变试验确立NOEL（无反应剂量 水平），提示每日最大摄入该杂质为0.0027mg/kg，如果体重按50kg计，则摄入量为 0.0027×50=0.135mg；瑞戈非尼日最大用量为160mg，故可推测其标准中该杂质限度为 0.0027×50kg/160=0.084%，即840ppm。（显著大于基于TTC水平的约9ppm限度）
文献：STIVARGA® regorafenib tablets 40mg PRODUCT MONOGRAPH 第36页
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3、举例如下
例2： 恩杂鲁胺 • FDA审查资料列出三个有警示结构杂质的化学名和基因毒性的实验
代号，但没有提供实验结果； • 日本的公开资料中则有实验代号和结果； • 通过对比实验代号的一致性，获知这几个杂质的试验结果为阴性。
Group 3:Heteroatomic Groups(含杂原子化合物）
A N
A
Aminoaryls and alkylated aminoaryls 芳香胺和烷基取代的芳酰胺
O
O NH2 A
Carbamates 氨基甲酸类
AA
NN
A
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Hydrazines and azo Compounds 肼和偶氮化合物
N+ _ O
N-Hydroxyaryls N-羟基苯胺
N-Acylated aminorryls N-酰化氨基苯
Aza-aryl N-oxides 氮杂芳基N-氧化物
Group 2:Alkyl and Aryl Groups(烷烃和环烷烃类化合物）
O AH
OH N AA
NO N AA
A NO2
Aldehydes 醛
（2）特定限度控制策略
• 计算：已知致癌活性（如半数致癌剂量TD50），线性外推可接受限度，按十万分之 一风险计算，TD50/50000，据此计算限度(见第16页，note4,环氧乙烷)；
• 参考：如有化学结构相似，且特定限度已确定的化合物，在提供结构相似合理性
及支持数据前提下，可参考计算限度；
• 计算：如前例，已知NOEL，计算杂质的PDE，结合每日最大用药剂量计算限度；
理化性质如反应活性，溶解性、挥发性，电离度等分析。
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方法3：案例1（M7 第24页 case1）
a、中间体X距原料药尚有2步反应，标准定入杂质A，杂质A化学性质稳定； b、将杂质A以不同浓度加入中间体X进行加标试验，达1%水平能持续从原
料药中去除至限度的30%以下； c、中试规模多批次成品杂质A结果低于基于TTC限度的30%以下；
＞10年至 终生
60
30
5
• 上表只适用于原料药有3个或3个以上分类2或3杂质。（结构相似，推测基因 毒性作用方式及分子靶向相同的杂质推荐总量为1.5微克/天，或根据情形进行 说明 EMEA Questions and answers on the ‘Guideline on the limits of genotoxic impurities’ 问题7）；
详见ICH Q3C.
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4、基因毒性杂质的限度
（3）非终生暴露（Less than lifetime,LTL）的控制 采用Staged TTC Approach
单个基因毒性杂质可接受摄入量
治疗期
日摄入量 （μg/day）
≤1月 120
Байду номын сангаас
＞1-12月 20
＞1-10年 10
＞10年至 终生
① 合成工艺杂质：
起始物料、中间体中检出的杂质；（杂质谱分析！） 从起始物料至成品整个路线中可能的反应副产物；（杂质谱分析！） 长路线早期的部分杂质或许可以忽略；（反应步骤！） 基于风险角度提供依据说明工艺路线中哪个节点后的杂质应作致突变性
评价；（反应步骤！） 工艺后期步骤使用的起始物料，应对该起始物料最后一步合成涉及的基
杂质谱分析时要特别关注！ 基因毒性杂质的控制是药品质量关注的重点！
对业界和监管部门是一个巨大的挑战！
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EMEA、FDA及ICH均相继发布了关于遗传毒性 和致癌性杂质相关的指导原则。
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原料药及制剂杂质评估
(Drug substance and drug product impurity assessment M7 第4页 )
结论：中间体X标准中杂质A控制限度1.0%可接受，原料药标准不再
检测。
2020/3/24
24
方法3：案例2（M7 第24~25页 case2）
根据加样研究获得的预期清除率
a、一个5步合成工艺，起始物料Y 在第3步引入，物料Y标准中定入基因毒性杂质 B，控制限度为0.1%；
b、为确定0.1%限度是否可接受，进行实验室清除研究试验。将杂质B以不同 浓度（最高10%）加入起始物料Y进行加标试验；
上述条件满足分类3。
结论：按一般杂质控制。
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需充分检索和对比文献后，确定控制策略！
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4、基因毒性杂质（分类1、2和3）的限度
（Risk characterization M7 第7页）
（1）基于TTC的控制
一般为长期用药（＞10年）、杂质无致癌性数据（分类2和3）； 杂质控制水平为1.5μg/日；
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2、致癌风险控制水平TTC
❖ TTC是一个假设性概念，控制肿瘤发生风险水平为 1：100000，即十万分之一；
❖ 基于平均每日1.5μg的摄入水平，且终生（以70年计）暴露； ❖ 是指累积剂量，摄入总量：
1.5 μg/day x×70×365 days=38.3 mg 赖祖亮@小木虫
c、试验得到最后3步的清除因子>500，推算起始物料Y含杂质B为0.1%时，成 品中残留低于2ppm，
d、成品基于TTC的可接受限度为50ppm。
结论： 起始物料Y中杂质B控制限度0.1%可接受，不需提供中试及商业化 批
数据。
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案例3：关于结构相似的基因毒性杂质的控制（芳硝基位置异构体 杂质）；
EWG
Michale-reactive Acceptors 迈克尔加成反应受体
O P
OR
O S
OR
Alkyl Esetrs of Phosphonates or Sulfonates 膦酸酯或者磺酸酯
Halogen
A Halogen
Halo-alkenes 卤代烯烃
Primary Halides 烷烃和环烷烃卤代物
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根据毒理学试验数据（NOEL或LOEL）计算允许日暴露量
（permitted daily exposure, PDE）
公式中F1~F5因子的取值 F1: 物种间的差异（大鼠取5，小鼠取12）； F2: 考虑人个体间的差异，一般固定取值10； F3: 暴露时间，取值范围1~10； F4：毒性反应的严重程度，取值范围1~10； F5: NOEL的剂量确立取值1，仅LOEL剂量确立取值10。
因毒性杂质进行评估。（反应步骤！）
② 降解杂质
实际检出杂质：长期稳定性及制剂过程中检出的报告限度以上杂质（ICH Q3A/B ）；
潜在杂质：加速试验及光照试验检出的鉴定限以上杂质，长期未确认。
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Group1:Aromatic Groups(芳香族化合物）:
OH N
A
A NA
O
N-Methylols N-亚甲基醇
N-Nitrosamines N-亚硝基胺
Nitro compounds 硝基化合物
O
A
A
Epoxides 环氧丙烷
H N
A
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Aziridines 氮丙啶类
O O C (S)
(S) N
Halogen
Propiolactones 环丙酯
N or S Mustards β卤代乙胺
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1、毒理学关注阈值（a threshold of toxicological concern；TTC）
未作研究（毒理学方面）的化学物质可接受的摄入水平，基于 TTC水平控制下，致癌或其他毒性风险可以忽略。 原料药及制剂致突变杂质TTC值：1.5μg/日。 强致癌性物质（cohort of concern）如黄曲霉素类似物、N亚硝基和烷基-偶氮氧化物除外，这类化合物可接受的限度应显 著降低。
A为烷烃基、芳香基或H；EWG为吸电子取代基，如氰基、羰基或酯基等。 基因毒性的警示结构不只限于以上所列，进一步了解可参见: 马磊,马玉楠等.遗传毒性杂质的警示结构 .中国新药杂志 ,2014，23(18) :2106~11
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分类
定义
建议的控制方法
1 已知的有致突变致癌性物质
• 特定限度杂质或分类1的杂质不计入总限度； • 制剂中降解产物单独控制，不计入总限度； • 复方制剂每个活性成分分别控制。
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4、基因毒性杂质的限度
（5）方法中的例外和灵活情形 ➢ 较高暴露于其它来源，如食品或内源性代谢物（如甲醛）。 ➢ 严重疾病； ➢ 预计生存期较短； ➢ 迟发性慢性疾病； ➢ 可选择的治疗方法有限。
以上情形往往可适当提高可接受限度。 要了解治疗的适应证、治疗患者人群和临床治疗的可选
方法！
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（1）工艺杂质控制 ➢ 方法1：原料药质量标准中控制在可接受限度以下
至少连续6批中试或连续3批放大检出低于限度30%以下，可周期性检验。
1.5
间隔给药按实际给药天数计，例：某药治疗期2年，每周给药一次，2 年实际给药104天，处于1~12月期间段，限度为20μg/day；
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4、基因毒性杂质的限度
（4）多个基因毒性杂质的控制
多个基因毒性杂质可接受摄入量
治疗期
日摄入量 （μg/day）
≤1月 120
＞1-12月
＞1-10年
按一般杂质控制
结构相同
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无警示结构，或有充分的数据 证明其警示结构无致突变性
按一般杂质控制
TTC仅适用于分类2和3，分类1应采用杂质特定限度,一般不用TTC； 分类2杂质还分类3可单用杂质进行细菌致突变试验（Ames），如为阴性则解除对警示结构的关注，无
需进一步评估基因毒性；
可进一步进行体内（in vovo）致突变试验，根据结果制定杂质的特定限度。