医学遗传学设计实验-完整ppt课件

❖ 4.1.2 提取胎儿游离DNA： ❖ （1）离心
第一次离心：经预处理后的血浆以1600×g的速度 离心10min，离心后取上清液置一20℃保存备用；
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第二次离心：将第一次离心后的上清液以13000— 16000×g的速度高速离心10min，离心后取上清液 置一20℃保存备用。
❖ （2）提取胎儿游离DNA： 取出上清液按照血样DNA提取试剂盒(QIAamp DNAbloodmini, Qia2gen)说明书中血液DNA的提 取方案提取DNA。
结果可能获得10kb、14kb两种长度的含a珠蛋白基
因簇的DNA片段。
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❖ 2．琼脂糖凝胶电泳
（1）加样：取18μl胎儿DNA酶处理液与2μl的DNA上 样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。
（2）电泳：加完样后，插上导线，打开电源，按 照 需 要 调 节 电压至120V，电泳开始，观察电泳槽中 负极的铂金丝处是否有气泡出现。
防止遗传病、先天畸形患儿出生的最有效而可行的
方法，对于减少群体中致病基因频率和提高人口素
质具有十分重要的意义。
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❖ 传统产前诊断方法一般采用羊膜腔穿刺、绒毛膜取 样和脐静脉穿刺等，它们都具有创伤性，可能对孕 妇及胎儿造成一定危害，如宫内感染、出血甚至流 产、死胎等。利用孕妇外周血中游离的胎儿DNA进 行产前诊断是一项非创伤性产前诊断技术，易于被 孕妇接受。
（3）当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约1cm时，将 电压回零，关闭电源，停止电泳。
（4）取出凝胶，在波长为302nm的紫外灯下观察染 色后的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔 红色荧光条带。
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❖ 3．转膜：
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❖ 4.1.3 利用PCR技术进行胎儿DNA扩增:
采用15 bp的随机引物，反应体系为： l0×PCR缓 冲液5μl ，Taq酶5 U，25 mmol／L MgC12 5 μl ， 2.5 mmol／L dNTP 4μl ， 200 mmol／L 15 bp随 机引物5 μl ，加双蒸水至50 μl ，置于基因扩增仪 上。反应条件为94℃预变性4 min 后，开始循环： 94℃ 1 min，37℃ 2 min，55℃ 4 min，循环30次， 最后72℃ 延伸5 min，4℃保存。
❖ 孕妇外周血中游离的胎儿DNA含量相对高，提取及 分析过程简单，易于发展为可应用于临床的大样本 高通量的检测方法。另外胎儿DNA在孕早期就可检 测到，且分娩后很快被清除，不会受前次妊娠的影 响。
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❖ PCR技术能在体外快速简便地扩增特异的DNA片段， 为基因诊断分析提供了方便，被广泛运用于遗传病 和肿瘤的基因诊断。若PCR产物的片段中包含有 RFLP的切点，则可将PCR扩增产物用相应的限制 酶处理，经电泳后检测其多态性，结合系谱进行分 析，可进行基因诊断。
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3．实验材料、试剂及器材
❖ 3.1 材料：
孕妇的新鲜外周血5 ml、琼脂糖凝 胶（新制备）、 硝酸纤维素滤膜（NC膜）、透明胶带、防护眼镜、 塑料瓶、塑料袋、保鲜膜、滤纸、X光底片
❖ 3.2 试剂：
EDTA（乙二胺四乙酸）盐抗凝剂，0．12 ml 10% 的中性buffer溶液(含4 %的甲醛)，QIAamp DNA提 取试剂盒(Qiagen)；Taq酶(Takara)，双蒸水， PCR缓冲液， dNTP (Promega)， AmpF1STR@ 扩增试剂盒(ABI)；BamHI内切酶，DNA上样缓冲 液，放射性物质（32p），变性液，预杂交液， 2×SSC（50%甲酰胺），X光片冲洗液。
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❖ 4.1.4利用Southern分子印迹杂交法检测出限制性 片段长度多态性（RFLP）进行基因诊断
❖ 1．用BamHI内切酶酶处理扩增产物，反应体系如 下：
待酶切DNA 1μg
双蒸水
适量
10X Buffer BamHI 2μl
BamHI
0.5-1μl
总体积
20μl
37℃孵育1小时或更长时间
医学遗传学设计实验
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实验设计方案：
一、实验名称 ：
二、总体设计思路：
三、具体设计方案：
1．实验目的
2．实验原理
3．实验材料、试剂及器材
4．实验方法及注意事项
5．实验预期结果及遗传指导
6．参考从孕妇外周血中提取胎儿 DNA进行a地贫的产前诊断
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二、总体设计思路：
抽取孕妇外周血 → 提取胎儿DNA → 利用 PCR技术进行胎儿DNA扩增 → 利用Sou-thern分 子印迹杂交法检测出限制性片段长 度多态性（RFLP）进行基因诊断【用DNA限制酶处 理扩增产物 → 琼脂糖凝胶电泳 → 转膜 →探针标记 → 预杂交 → Southern杂交 → 洗膜 → 放射性自显 影检测】
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❖ Southern分子印迹杂交是将酶解后的DNA片段经 琼脂糖凝胶电泳分离，然后经碱变性，Tris缓冲液 中和，高盐下通过吸附作用将DNA从凝胶中转印至 硝酸纤维素滤膜上，附着在滤膜上的DNA与32p标 记的探针杂交，利用放射自显影技术确定探针互补 的每条DNA带的位置，从而可以确定在众多酶解产 物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。此 法可检测出限制性片段长度多态性（RFLP），从 而进行基因诊断。
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三、具体设计方案：
1．实验目的
❖ 利用孕妇外周血中游离的胎儿DNA进行a地贫的产 前诊断，从而进行遗传指导。
2．实验原理：
❖ 地中海贫血的分布遍及全世界，我国南方省区的发
病率也较高，如广西壮族自治区可高达14.6%，其
次为广东、海南、云南等。在遗传咨询的基础上，
对高风险的胎儿进行产前诊断和选择性终止妊娠是
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❖ 3.3 主要仪器：
离心机，冰箱，基因扩增仪、微量移液枪(20μl)， 电泳仪，紫外透射仪，封口器，southern印迹杂交 实验仪器，水浴锅（0℃，42℃，100℃），琼脂糖 平板电泳装置，放射性检测仪，暗盒（加双侧增感 屏）
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4．实验方法及注意事项
4.1 方法步骤：
❖ 4.1.1 血浆制备： 抽取孕妇外周血5 ml，加入EDTA抗凝剂，0．12 ml 10% 的中性buffer溶液(含4 %的甲醛)进行预处 理。