第四章抗体制药123节解析
合集下载
生物技术制药抗体制药网载
小分子抗体类型有： Fab片段抗体 Fv抗体 单链抗体
三、小分子抗体
单域抗体
最小识别单位
单链抗体的优点：
可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白，肿瘤显象背景更加清晰性。 易渗透肿瘤组织中增加药物治疗浓度。 免疫源性小，可消除人抗鼠的排异反应。
单链抗体大多在大肠杆菌中表达，有三种形式： 直接在细胞质中表达； 与其它菌体融合表达融合蛋白； 分泌表达具有功能的单链抗体。
第三节 鼠源性单克隆抗体 的改造
杂交瘤单抗为鼠源性，应用人体产生人抗鼠抗体及毒副作用。对鼠源性的单抗进行基因加工和改造。
目的：降低免疫源性；降低相对分子量。
人-鼠嵌合抗体、改形抗体 、小分子抗体。
Ig分子结构
Ig分子的基因结构
抗原抗体结合功能—抗体可变区（V）
01
同种性免疫源性—抗体稳定区（C）
01
在基因水平上将鼠源单抗的H 和L链可变区基因分离出来，分别与人Ig的H 和L链的稳定区（C）基因连接成人-鼠嵌合抗体的H 和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达完整人-鼠嵌合抗体。
01பைடு நூலகம்
一、人鼠嵌合抗体
用鼠源单抗的CDR序列替换人Ig 分子中CDR序列，则可使人的Ig 分子具有鼠源单抗的抗原结合特异性。可消除免疫源性。
单克隆抗体作为抗体制剂，在临床上主要用与疾病的诊断和治疗。
01
单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原，辅助临床诊断。用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，做免疫定位诊断。
02
单克隆抗体用于临床治疗，CD3单克隆抗体作为免疫抑制剂对器官移植免疫排斥有抑制作用。
以单克隆抗体作为载体的药物对肿瘤进行定向治疗。
多克隆抗体：病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称多克隆抗体。
三、小分子抗体
单域抗体
最小识别单位
单链抗体的优点：
可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白，肿瘤显象背景更加清晰性。 易渗透肿瘤组织中增加药物治疗浓度。 免疫源性小，可消除人抗鼠的排异反应。
单链抗体大多在大肠杆菌中表达，有三种形式： 直接在细胞质中表达； 与其它菌体融合表达融合蛋白； 分泌表达具有功能的单链抗体。
第三节 鼠源性单克隆抗体 的改造
杂交瘤单抗为鼠源性，应用人体产生人抗鼠抗体及毒副作用。对鼠源性的单抗进行基因加工和改造。
目的：降低免疫源性；降低相对分子量。
人-鼠嵌合抗体、改形抗体 、小分子抗体。
Ig分子结构
Ig分子的基因结构
抗原抗体结合功能—抗体可变区（V）
01
同种性免疫源性—抗体稳定区（C）
01
在基因水平上将鼠源单抗的H 和L链可变区基因分离出来，分别与人Ig的H 和L链的稳定区（C）基因连接成人-鼠嵌合抗体的H 和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达完整人-鼠嵌合抗体。
01பைடு நூலகம்
一、人鼠嵌合抗体
用鼠源单抗的CDR序列替换人Ig 分子中CDR序列，则可使人的Ig 分子具有鼠源单抗的抗原结合特异性。可消除免疫源性。
单克隆抗体作为抗体制剂，在临床上主要用与疾病的诊断和治疗。
01
单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原，辅助临床诊断。用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，做免疫定位诊断。
02
单克隆抗体用于临床治疗，CD3单克隆抗体作为免疫抑制剂对器官移植免疫排斥有抑制作用。
以单克隆抗体作为载体的药物对肿瘤进行定向治疗。
多克隆抗体：病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称多克隆抗体。
生物技术制药第4章
在体内，可表现为溶菌、杀菌、促进 吞噬或中和毒素等作用，故可治疗， 即抗体治疗药物。
三大类抗体诊断药物：
一、血清学鉴定用的抗体试剂 二、免疫标记用的抗体试剂 三、体内导向诊断药物
一、血清学鉴定用的抗体试剂
血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未 知的抗原型，主要用于疾病的病原菌 的诊断和血型鉴定，常用凝集反应。
二、抗癌药物偶联的抗体药物
常用抗癌药如氨甲喋呤、阿霉素、丝 裂霉素、环磷酰胺等，以人血清白蛋 白为中间载体，可明显提高每分子抗 体所携带的氨甲喋呤量，使体外细胞 毒性提高2倍。
1、荧光抗体诊断试剂
用荧光色素标记抗体，当抗原与抗 体反应时可发光。
2、免疫酶抗体诊断试剂
用酶标记抗体来检测抗原，有免疫酶 染法和酶免疫测定。
3、放射免疫用抗体诊断试剂
把放射性核素分析的高度灵敏度与抗 原抗体反应的特异性结合。
三、体内导向诊断药物
以抗体为载体的导向诊断药物的研究比 导向治疗更接近临床应用阶段。
结合抗原的两个臂具有不同的特异性。
双功能抗体的优点
一个臂识别肿瘤细胞表面抗原，包括 肿瘤相关抗原、癌基因产物、特殊的 白细胞分化抗原、病毒蛋白抗原、特 异性受体等，并有效结合；另一个臂 可识别免疫效应细胞及分子,如CD3(T 细胞识别抗原的单位）、毒素、药物等。
五、抗体融合蛋白
构建抗体融合蛋白的原则：将第一个蛋 白的终止密码子删除，再接上带有终止 密码子的第二个蛋白基因，即可实现两 个基因的共表达。
致力于抗体小型化和人源化研究。
一、放射性核素标记的抗体治疗药物
抗体作为放射性核素的导向载体，操 作简单、用量小，且能观察到药物在 体内的分布和药物动力学，放射性标 记的抗体有较大的杀伤范围，有利于 克服肿瘤表面抗原的异质性，对肿瘤 细胞的杀伤也不依赖抗原抗体结合后 的吸收作用，由于分子量小，容易穿 透到达肿瘤部位。
三大类抗体诊断药物：
一、血清学鉴定用的抗体试剂 二、免疫标记用的抗体试剂 三、体内导向诊断药物
一、血清学鉴定用的抗体试剂
血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未 知的抗原型，主要用于疾病的病原菌 的诊断和血型鉴定，常用凝集反应。
二、抗癌药物偶联的抗体药物
常用抗癌药如氨甲喋呤、阿霉素、丝 裂霉素、环磷酰胺等，以人血清白蛋 白为中间载体，可明显提高每分子抗 体所携带的氨甲喋呤量，使体外细胞 毒性提高2倍。
1、荧光抗体诊断试剂
用荧光色素标记抗体，当抗原与抗 体反应时可发光。
2、免疫酶抗体诊断试剂
用酶标记抗体来检测抗原，有免疫酶 染法和酶免疫测定。
3、放射免疫用抗体诊断试剂
把放射性核素分析的高度灵敏度与抗 原抗体反应的特异性结合。
三、体内导向诊断药物
以抗体为载体的导向诊断药物的研究比 导向治疗更接近临床应用阶段。
结合抗原的两个臂具有不同的特异性。
双功能抗体的优点
一个臂识别肿瘤细胞表面抗原，包括 肿瘤相关抗原、癌基因产物、特殊的 白细胞分化抗原、病毒蛋白抗原、特 异性受体等，并有效结合；另一个臂 可识别免疫效应细胞及分子,如CD3(T 细胞识别抗原的单位）、毒素、药物等。
五、抗体融合蛋白
构建抗体融合蛋白的原则：将第一个蛋 白的终止密码子删除，再接上带有终止 密码子的第二个蛋白基因，即可实现两 个基因的共表达。
致力于抗体小型化和人源化研究。
一、放射性核素标记的抗体治疗药物
抗体作为放射性核素的导向载体，操 作简单、用量小，且能观察到药物在 体内的分布和药物动力学，放射性标 记的抗体有较大的杀伤范围，有利于 克服肿瘤表面抗原的异质性，对肿瘤 细胞的杀伤也不依赖抗原抗体结合后 的吸收作用，由于分子量小，容易穿 透到达肿瘤部位。
第四章 抗体制药ppt课件
解决问题的方法或途径——基因工程技术
1984年报道了人—鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗体、 单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基本上消 除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整抗 体分子的1/80～1/3。
第一节 单克隆抗体（Monoclonal Antibody） 的制备
1、单克隆抗体与多克隆抗体
单克隆抗体（McAb ）：如果把能分泌某种特异抗体的 一个B型淋巴细胞分离出来，通过纯种培养，则只产生一种 抗体，可以特异性地与体内一种抗原结合，这种单一的特异 抗体即为单一B细胞克隆抗体，即单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。
2、制备单克隆抗体的一般流程
3、杂交瘤细胞的制备与筛选流程图
BALB/C小鼠
注射矿物油诱发 骨髓瘤细胞 TK或HGBRT缺陷
BALB/C小鼠
注射某种抗原免疫 脾细胞 B淋巴细胞
融合（PEG） 分装于多孔培养板培养（HAT） 亲株死亡
杂交瘤细胞生长繁殖
鉴定单克隆抗体 选出优良杂交瘤细胞， 用于生产或冷冻保藏
二、杂交瘤细胞的制备
1、抗原与动物免疫的获得
免疫方法：体内免疫和体外免疫 抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原 免疫动物：BALB/c小鼠和Lou大鼠
多克隆抗体：动物细胞的免疫系统接受到一个新的抗原 时，并不是对抗原的所有表面都作出反应，而只对抗原中特 异的抗原决定簇产生应答，一般一个抗原有多个抗原决定簇， 可以同时诱导产生多个B型淋巴细胞的增生。机体在同一时间 都是接受多种外界的抗原物质的，使得B型淋巴细胞增生的种 类也有多种，造成不同种B型淋巴细胞同时存在于体液中，由 此产生的抗体也是多种，所以从体液中分离提取的多种抗体 也是由多种B型淋巴细胞产生出来的，是多种抗体的混合物。 由B细胞分裂而形成的细胞群（是同质的），称为一个克隆。 因此存在于体液中各种抗体的总和可称为多种B细胞克隆抗体， 简称多克隆抗体（polyclonal antibody）。
优选第四章抗体制药
2020/8/7
6
多抗与单抗
多克隆抗体：病原微生物含有多种抗原决定簇的 抗原物质，对其产生的抗体也是多种抗体的混合 物，称为多克隆抗体。
单克隆抗体：针对一个抗原决定簇的抗体，又是 单一的B淋巴细胞克隆产生的、高度特异、均一、 来源稳定、可大量生产的抗体。
7 2020/8/7
抗原 免疫
传统抗血清
11 2020/8/7
基因工程技术为解决问题提供了可能
基本消除了单克隆抗体的鼠 源性（免疫原性）,鼠源氨基 酸只占完整抗体分子的 1/80~1/3，只保留同抗原特 异性结合的活性。
制备出改形抗体、单链抗体、 单域抗体、最小识别单位等 很多类型的抗体或抗体单位。
12 2020/8/7
二、抗体工程发展历程及趋势
双特异抗体 2个
Fc融合蛋白 7个
2008 Cimzia
2009 Stelara Sinponi
2010 Actemra Numax
2011 Benlysta Yervoy Adcetris
2012 Perjeta Eylea
2013 Kadcyla Gazyva
2014 Cyramza Sylvant Entyvio Keytruda
Biogen-IDEC
8.678
Non-Hopkin’s Lymphoma
4
Enbrel
Amgen
4
Lantus (insulin glargine)
Sanofi
6
Avastin
Roche/Genentech
8.538 7.279 6.957
RA、牛皮癣 I/II型糖尿病 结肠癌，NSCLC
7
Herceptin
生物技术制药-03抗体制药
• 杂交后存在脾细胞、脾-脾融合细胞、瘤细胞、瘤-瘤融
合细胞和脾-瘤融合细胞。 • 根据这一点，可将混存于细胞群中的正常细胞，通过 试管内培养进行选择。脾-脾融合细胞和瘤细胞在这样 的条件下，几天内迅速死亡。此外，由于SP2/0等骨髓 瘤细胞都是次黄嘌呤（H）鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HGPRT）缺乏株，瘤-瘤融合细胞和瘤细胞因不能合 成DNA而死亡。 • 脾细胞中存在HGPRT酶，因此脾-瘤融合的杂交瘤细胞 可利用HGPRT酶，用次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T） 合成DNA，使杂交瘤细胞得以生长。次黄嘌呤和胸腺 嘧啶脱氧核苷可作为中间合成途径的原料而进行添加。
一、抗原与动物免疫
• （3）免疫方法：体内免疫法和体外免疫法 • 体内免疫法：适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，
一般用8~12周龄的雌性鼠。颗粒性抗原（如细菌、细胞 抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔107 个细胞进行初次免疫，间隔1~3周，再追加免疫1~2次， 可溶性抗原则按每只小鼠10~100mg抗原与福氏完全佐剂 等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫，间隔2~4周， 再用不加佐剂的原抗原追加免疫1~2次。一般在采集脾 细胞前3日由静脉注射最后一次抗原，其目的是使对应 的B淋巴细胞克隆受到可靠的最大限度的刺激，使其迅 速地增殖分裂，因为细胞融合后增殖最好的细胞是迅速 分裂的细胞。有人认为在常规免疫的基础上用脾内免疫 法做追加免疫较佳。
二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养
• （1）细胞融合基本方法：取适量脾细胞（1×108）与
骨髓瘤细胞（2 ×107 ~3×107）进行混合，在聚乙二醇 （PEG）作用下诱导它们融合，时间控制在2min以内， 然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释。 • （2）用于融合的骨髓瘤细胞应具备条件：融合率高， 自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力 强且长期稳定等特点。书中表4-1列举了主要的骨髓瘤 细胞系，其中SP2/0、P3.653细胞本身不分泌抗体，细胞 融合后产生的杂交瘤细胞只分泌均一的、完全来自脾细 胞的抗体分子，它们是目前较为理想的可供融合的骨髓 瘤细胞。特别是SP2/0细胞系还具有容易培养、融合率 高等特点，被国内外多个实验室广泛采用。
第四章 抗体制药
B淋巴细胞与抗体的关系：
B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗
体。
动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种 以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有 特异性免疫作用。 每一个B淋巴细胞只能产生一种抗体。
20世纪60年代发现多发性骨髓瘤是
浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。病
人血清中出现同抗体结构类似的球蛋白， 统称为免疫球蛋白（immunoglobulin， Ig）。所以Ig是化学结构的概念，而抗 体是生物学功能的概念。
骨 髓 癌 细 胞
NS-1
B cell
-b -a
-c -d
脾 细 胞
传统抗体 (抗血清)
细胞融合
PEG HAT -a -b Cell fusion
分株培养筛选
对 抗 原 的 反 应
a b c d
+ + + +
-c
-d ELISA
Ag X
无 法 分 辨 完 全 不 同
a b c d’
+ + + -
Ag X’
细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋
巴细胞融合，得到杂种骨髓瘤细胞。
杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，既
具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也 有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的 特性，用这种来源于单个融合细胞培养 增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定 簇的特异单克隆抗体。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、
ELISA用于破伤风抗体的筛选
ELISA
多头加样枪
克 隆 化
克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而 获得细胞集团的整个培养过程。这种 群体细胞的生物学特性和功能完全相 同。 常用方法：有限稀释法和软琼脂培养 法
生物技术制药第四章 抗体工程制药：单克隆抗体基因工程抗体噬菌体抗体技术
第四章抗体工程制药第三节单克隆抗体的制备*原理制备流程原理书本84页单克隆抗体技术的原理是基于动物细胞融合技术得以实现的，即骨髓瘤细胞与B细胞的融合。
骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。
将免疫B细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特点，既有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成的分泌特异性抗体的能力。
@ 细胞融合后存在：脾细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞@ 筛选及抗体检测：HAT培养液：次黄嘌呤（H)、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶（T)，氨基蝶呤可阻断DNA的合成。
如细胞含有胸腺嘧啶激酶（TK）、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）此两种酶则可启动补救（应急）途径。
次黄嘌呤，胸腺嘧啶在HGPRT作用下合成DNA的合成，并可克服氨基蝶呤的阻断。
在HAT培养液中，骨髓瘤细胞缺乏TK或HGPRT而不能生长，而脾细胞能生长但不能长期增殖而死亡，只有杂交瘤细胞具有以上两种酶故能生长。
脾细胞（HGPRT+, TK+, 不能长期生长）骨髓瘤细胞（HGPRT-, TK-，不能生长）杂交瘤细胞（HGPRT+, TK+ ，能够生长）单克隆抗体制备流程图书本85页！！！制备流程：抗原→受体动物→致敏B 细胞+骨髓瘤细胞（PEG）→杂交瘤（细胞培养（HAT 培养基）→阳性筛选—①体内培养②体外培养）→单克隆抗体；第四节基因工程抗体一、单克隆抗体人源化(humanized antibody)；降低ＨＡＭＡ反应；人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。
*人源化抗体种类特点概念二、小分子抗体*种类用途可以用图示表示包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别单位等几种。
基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V区片段，其相对分子质量仅为原抗体的1/80-1/3(1)Fab片段抗体：VH+CH1 (2)FV抗体：VH+VL(3)单链抗体：VH-Linker-VL (4)单域抗体：VH或VL小分子抗体有很多优点:可以用细菌或酵母菌发酵生产，成本低;分子小，穿透力强;不含Fc，没有Fc带来的效应;在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。
生物制药技术-第四章-抗体制药(1,2,3)
胞都是次黄嘌呤鸟瞟岭磷酸核糖转移酶 (HGPRT)缺乏株，脾细胞内却有这种酶，因此脾-瘤融合的杂交瘤细 胞 可利用HGPRT，用次黄瞟岭(H)和胸腺嘧啶(T)合成DNA，使杂交瘤细胞 得以生长。选择 性培养的常规方法是将融合的细胞悬浮于HAT的培养 液(表4 - 2)中，加入到含有饲养细胞 的96孔板内.根据情况每2~3 d 换液一次。换液时吸去l/2~2/3培养液，加入等量的新鲜 培养液。在 融合后7 d内用HAT培养液，杀死瘤瘤融合细胞后，第七天至第十四天 改用HT 培养液，第十四天以后用普通的RPMl1640完全培养液(表4 3)，从融合后8~9d就可对所 有克隆生长孔的培养上清进行抗体检测， 筛选出产生抗体的阳性克隆。
因此，抗体是指能与相应抗原特异性综合的具有免疫功能的球 蛋白。它是机体免疫系统受 抗原物质刺激后，B淋巴细胞被活化、 增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。20 世纪60年 代初期.发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。患 者血清中也出现 同抗体分子结构类似的球蛋白。因此，将具有抗体 活性及化学结构与抗体相似的球蛋白统称为 免疫球蛋白 (immunoglobulin，Ig)。 显然，Ig是化学结构上的概念，而抗体是生物学功能上的概 念。也 就是说，所有抗体均是Ig，但并非所有Ig分子都具有抗体活性。由 于病原微生物是含有 多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制 剂也是多种抗体的混合物.故称多克隆抗体， 即针 对多种抗原决定 簇的抗体。这些抗体制剂在应用过程中经常发生非特异性交叉反应 而出现假阳 性结果，必须经多次吸收试验才能得到所谓的精制单价 血清，用于临床病原学诊断，如痢疾杆菌 属诊断血清和沙门氏菌属 诊断血清等。虽然称为精制单价血清，但仍然难免出现假阳性结果; 而且其产量很低.很难满足临床治疗和诊断上的需要。
因此，抗体是指能与相应抗原特异性综合的具有免疫功能的球 蛋白。它是机体免疫系统受 抗原物质刺激后，B淋巴细胞被活化、 增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。20 世纪60年 代初期.发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。患 者血清中也出现 同抗体分子结构类似的球蛋白。因此，将具有抗体 活性及化学结构与抗体相似的球蛋白统称为 免疫球蛋白 (immunoglobulin，Ig)。 显然，Ig是化学结构上的概念，而抗体是生物学功能上的概 念。也 就是说，所有抗体均是Ig，但并非所有Ig分子都具有抗体活性。由 于病原微生物是含有 多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制 剂也是多种抗体的混合物.故称多克隆抗体， 即针 对多种抗原决定 簇的抗体。这些抗体制剂在应用过程中经常发生非特异性交叉反应 而出现假阳 性结果，必须经多次吸收试验才能得到所谓的精制单价 血清，用于临床病原学诊断，如痢疾杆菌 属诊断血清和沙门氏菌属 诊断血清等。虽然称为精制单价血清，但仍然难免出现假阳性结果; 而且其产量很低.很难满足临床治疗和诊断上的需要。
抗体制药
1940年至1980年抗体的生产和纯化技术显著提高， 抗体制剂更适于静脉注射，并证实人免疫球蛋白制剂 可减少丙种球蛋白缺乏症患儿的感染。
6
1975年杂交瘤技术的创立给抗体的研究及应用带来了 突破。单克隆抗体作为临床诊断、治疗、预防以及基础理 论研究（如纯化蛋白、免疫沉淀、免疫细胞化学等）的新 型制剂，已日益显示出重要的作用和广阔的应用前景，以 单克隆技术为主要产品的生物技术已成为具有巨大市场潜 力的新兴产业部门。
16
2．可变区与恒定区：
重链及轻链N端部分的氨基 酸组成及排列变化多端，称为抗 体可变区（约占重链1/4～1/5及 轻链1/2）（variable region， V区）；V区以外的结构氨基酸 组成、数量、排列则相对恒定， 称为抗体的恒定区（constant region, C区）,该区主要发挥抗 体分子的相应功能。
39
5. 靶向作用
天然不加修饰的单抗可以通过上述几种机制发 挥治疗作用，但在许多情况下，尤其是实体恶性肿 瘤，其效果不甚理想。可以利用抗体的特异性结合 活性，将细胞杀伤性物质选择性导向肿瘤部位。
如：放射性核素、化疗药物、毒素等。
40
第二节 单克隆抗体
单克隆抗体是针对一个抗原决定簇、由单一B淋巴细 胞克隆产生的抗体；单克隆抗体的结构和特异性完全相 同。
一些与免疫系统关键分子相互作用的抗体，可以增强机体的免疫 应答能力，使原来较弱的、无效的抗肿瘤免疫反应得到有效的提高， 对机体提供免疫保护。
如抗CD40抗体：引起APC表面CD40分子的交联，激活APC(抗 原提呈细胞 ),提高其对肿瘤抗原的加工处理能力。(CD分子指的是与 人类细胞发育、分化、活化有关的膜抗原 )
17
3．超变区与框架区：
V区中某些特异位置上的氨基酸残基随抗体特异性不同而出现极 大的变异，这些区域称为超变区(hypervariable region, HV)或互补 决 定区（complementarity determining region, CDR）,是V区中特 异结合抗原的部位。
6
1975年杂交瘤技术的创立给抗体的研究及应用带来了 突破。单克隆抗体作为临床诊断、治疗、预防以及基础理 论研究（如纯化蛋白、免疫沉淀、免疫细胞化学等）的新 型制剂，已日益显示出重要的作用和广阔的应用前景，以 单克隆技术为主要产品的生物技术已成为具有巨大市场潜 力的新兴产业部门。
16
2．可变区与恒定区：
重链及轻链N端部分的氨基 酸组成及排列变化多端，称为抗 体可变区（约占重链1/4～1/5及 轻链1/2）（variable region， V区）；V区以外的结构氨基酸 组成、数量、排列则相对恒定， 称为抗体的恒定区（constant region, C区）,该区主要发挥抗 体分子的相应功能。
39
5. 靶向作用
天然不加修饰的单抗可以通过上述几种机制发 挥治疗作用，但在许多情况下，尤其是实体恶性肿 瘤，其效果不甚理想。可以利用抗体的特异性结合 活性，将细胞杀伤性物质选择性导向肿瘤部位。
如：放射性核素、化疗药物、毒素等。
40
第二节 单克隆抗体
单克隆抗体是针对一个抗原决定簇、由单一B淋巴细 胞克隆产生的抗体；单克隆抗体的结构和特异性完全相 同。
一些与免疫系统关键分子相互作用的抗体，可以增强机体的免疫 应答能力，使原来较弱的、无效的抗肿瘤免疫反应得到有效的提高， 对机体提供免疫保护。
如抗CD40抗体：引起APC表面CD40分子的交联，激活APC(抗 原提呈细胞 ),提高其对肿瘤抗原的加工处理能力。(CD分子指的是与 人类细胞发育、分化、活化有关的膜抗原 )
17
3．超变区与框架区：
V区中某些特异位置上的氨基酸残基随抗体特异性不同而出现极 大的变异，这些区域称为超变区(hypervariable region, HV)或互补 决 定区（complementarity determining region, CDR）,是V区中特 异结合抗原的部位。
生物技术制药—抗体制药原理
• 同一种属的个体，所产生针对不同抗原 的同一类别Iｇ，其C区氨基酸组成和排 列顺序比较恒定，其免疫原性相同，但V 区不同。
• 铰链区（hinge region）: 位于CH1和CH2 之间，包括重链链间二硫键，含有丰富的 脯氨酸（构成胶原纤维的重要成分）。具 有柔曲性，不形成螺旋，可以伸展、弯曲 和转动。有利于与不同距离的抗原表位结 合，又有利于暴露抗体分子的补体结合点， 同时对蛋白酶敏感，Ig被水解易在此区发生 裂解。
• 高变区为抗体与抗原的结合位置，VL和VH的 HVR1，HVR2，HVR3又分别称为CDR1，CDR2， CDR3，其中CDR3具有更高的高变程度，H链 在与抗原结合中起重要的作用。
• 在V区中，CDR之外区域的氨基酸组成和排列 顺序相对不易变化，称为骨架区 （framework region, FR）。
• 轻链（light chain，L链）
• 214个氨基酸残基组成，通常不含碳水化合 物，分子量为25KD，有两个由链内二硫键 组成的环肽，L链可分为：Kappa（κ）与 lambda（λ）2个亚型。
• 每一轻链上的型别只能属于两型别中的某 一型别,而不能两者兼而有之,亦即属于 Kappa型或是Lambda型，而不能有KappaLambda型者。
• 铰链区有蛋白水解酶的酶切位点。 • 木瓜蛋白酶在重链间二硫键的N端将其裂解成
分子量基本相等的三个片段：2个Fab和1个Fc 片段。Fab能够与抗原结合，称为抗原结合片 段（Fab），Fc能够与细胞表面的Fc受体结合。 Fc具有免疫原性和抗原性。因它容易形成结 晶，故称为可结晶片段（Fc）。
• 胃蛋白酶在重链间二硫键的羧基端将其裂 解成分子量两个不同的片段：一个由两个V 区连在一起的大片段F（abˊ）2和一些Fc裂 解的小碎片pFcˊ。pFcˊ分子量小，丧失免 疫原性。
• 铰链区（hinge region）: 位于CH1和CH2 之间，包括重链链间二硫键，含有丰富的 脯氨酸（构成胶原纤维的重要成分）。具 有柔曲性，不形成螺旋，可以伸展、弯曲 和转动。有利于与不同距离的抗原表位结 合，又有利于暴露抗体分子的补体结合点， 同时对蛋白酶敏感，Ig被水解易在此区发生 裂解。
• 高变区为抗体与抗原的结合位置，VL和VH的 HVR1，HVR2，HVR3又分别称为CDR1，CDR2， CDR3，其中CDR3具有更高的高变程度，H链 在与抗原结合中起重要的作用。
• 在V区中，CDR之外区域的氨基酸组成和排列 顺序相对不易变化，称为骨架区 （framework region, FR）。
• 轻链（light chain，L链）
• 214个氨基酸残基组成，通常不含碳水化合 物，分子量为25KD，有两个由链内二硫键 组成的环肽，L链可分为：Kappa（κ）与 lambda（λ）2个亚型。
• 每一轻链上的型别只能属于两型别中的某 一型别,而不能两者兼而有之,亦即属于 Kappa型或是Lambda型，而不能有KappaLambda型者。
• 铰链区有蛋白水解酶的酶切位点。 • 木瓜蛋白酶在重链间二硫键的N端将其裂解成
分子量基本相等的三个片段：2个Fab和1个Fc 片段。Fab能够与抗原结合，称为抗原结合片 段（Fab），Fc能够与细胞表面的Fc受体结合。 Fc具有免疫原性和抗原性。因它容易形成结 晶，故称为可结晶片段（Fc）。
• 胃蛋白酶在重链间二硫键的羧基端将其裂 解成分子量两个不同的片段：一个由两个V 区连在一起的大片段F（abˊ）2和一些Fc裂 解的小碎片pFcˊ。pFcˊ分子量小，丧失免 疫原性。
第四章 抗体制药
高变区之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对不易变化， 称为骨架区（FR），VH和VL各有4个骨架区，分别用FR1、 FR2、FR3和FR4表示。
VH和VL的三个高变 区共同组成免疫球 蛋白的抗原结合部 位，该部位形成一 个与抗原决定簇互 补的表面，所以高 变区又被称为互补 决定区（CDR）， 分别用CDR1、 CDR2和CDR3表示。 不同的抗体其CDR 序列不相同，并因 此决定抗体的特异 性，其中CDR3具有 更高的高变程度，H 链在于抗原结合中 起非常重要的作用。
2.同种异型 同种异型是指同一种属不同个体间的Ig分子抗原性的不 同，在同种异体间免疫可诱导免疫反应。
3.独特型 独特型是一种特异性免疫球蛋白V区上的抗原特异性， 独特型的抗原决定簇称为独特位，可在异种、同种异体以及 自身体内诱导产生相应的抗体，称为抗独特型抗体。
独特型和抗独特型抗体可形成复杂的免疫网络，在机 体免疫调节中占有重要地位。
在制备杂交瘤细胞时，选择缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖 转移酶（HGPRT）瘤细胞株，PEG法融合后，在含有次黄嘌呤、
氨基碟呤和胸腺嘧啶的HAT培养基上进行筛选。细胞中，DNA的
生物合成主要有两种途径——主要途径和补救途径，主要途径是 细胞由氨基酸和小分子化合物合成核苷酸，进而合成DNA，这一
途径会被HAT培养基中的氨基碟呤所阻断。失去主要途径的细胞
能产生某一特异性抗体的单克隆B细胞是获得单克隆抗体的
关键。骨髓瘤细胞即恶性浆细胞在培养条件下可以无限繁殖， 如果将B细胞和骨髓瘤细胞融合就能获得具有无限繁殖能力 并可分泌均质抗体的杂交瘤细胞。现阶段，杂交瘤细胞的两 个亲本细胞多来自小鼠——BALB/c小鼠。
二、单克隆抗体的制备
（一）抗原和动物免疫
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
从1984年报道人—鼠嵌合抗体以来，已制备 出改形抗体、单链抗体、单域抗体、最小识 别单位等诸多类型，基本上消除了鼠源性单 克隆抗体的免疫原性，相对分子质量只有完 整抗体分子的1／80—1／3，原来鼠源性单 克隆抗体的诸多生物学活性已消失，如激活 补体、促进吞噬功能(免疫调理)、抗体依赖细 胞介导的细胞毒副作用等，只保留同抗原特 异性结合的活性，即仅应用其导向作用，制 备导向药物用于肿瘤治疗。
浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。病 人血清中出现同抗体结构类似的球蛋白， 统称为免疫球蛋白（immunoglobulin， Ig）。Ig是化学结构的概念，而抗体是 生物学功能的概念。所有的抗体均是Ig， 但并非所有Ig分子都具有抗体活性。
第四章抗体制药123节解析
多克隆抗体与单克隆抗体 多克隆抗体：病原微生物含有多
第四章抗体制药123节解析
为使杂交瘤细胞稳定，免疫的动 物和骨髓瘤细胞供体是同一品系动 物。
常用的骨髓瘤细胞系多来自 BALB/c小鼠和 LOU大鼠，因此免 疫动物也采用相应的品系，最常用 的也是BALB/c小鼠。
第四章抗体制药123节解析
免疫的方法采用体内免疫法和体外 免疫法。
体内免疫法适用于免疫原性强、抗 原量较多时应用，一般用8～12周龄雌 性鼠。
第四章抗体制药123节解析
单克隆抗体定义
是将抗体产生的细胞与具有无限增殖 能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有 限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成 为纯一的单克隆细胞系而产生的抗 体。
第四章抗体制药123节解析
单克隆抗体的应用
单克隆抗体作为抗体制剂，在临床上 主要用于疾病的诊断和治疗。
单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗 原，辅助临床诊断。用放射性核素标记 单克隆抗体进行肿瘤显像，做免疫定位 诊断。
第四章 抗体制药
第四章抗体制药123节解析
第一节 概述
1890年Behring和北里柴三郎发现白 喉抗毒素,建立了血清疗法,开创了抗体 制药之先河。 1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分 为白蛋白、α、β、γ球蛋白，并证明 抗体活性主要存在于γ球蛋白组分。 γ 球蛋白制剂是紧急预防甲型肝炎等传染 病的有效药物。
种抗原决定簇的抗原物质，因此 产生的抗体制剂也是多种抗体的 混合物，故称多克隆抗体。 病原诊断时易出现假阳性。
第四章抗体制药123节解析
1975年Kǒhler和Milstein首先 利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出 单克隆抗体（monoclonal antibody， McAb）。
单克隆抗体具有高度特异性、 均一性、来源稳定、可大量生产等 特点，为抗体制备和应用提供了全 新的手段，还促进了基础和临床医 学tibody）是指能与 相应抗原特异性结合具有免疫 功能的球蛋白。
抗体的产生：机体免疫系统 受抗原刺激后，B淋巴细胞被活 化、增殖和分化为浆细胞，由 浆细胞合成和分泌的球蛋白。
第四章抗体制药123节解析
免疫球蛋白与抗体的关系 20世纪60年代初期，发现多发性骨髓瘤是
一次抗原，目的是最大限度刺激B细胞 分裂为浆细胞，合成大量的抗体。
第四章抗体制药123节解析
有人主张采用脾内免疫法。 脾内免疫法即在麻醉下直接把 0.1～0.2mL抗原注入脾脏进 行免疫。细胞抗原需105个，可 溶性抗原需10µg，节省抗原量。
第四章抗体制药123节解析
体外免疫法用于不能采用体 内免疫的情况下，如制备人源性 单克隆抗体；免疫源性极弱，易 引起免疫抑制。 优点：需抗原量少（几个µg）， 免疫期短（４～５d），干扰因素 少。
一、抗原与动物免疫
制备特定抗原的单克隆抗体， 首先要制备用于免疫的适当抗原，再 用抗原进行动物免疫。
第四章抗体制药123节解析
有的抗原可以用化学合成：地高辛。 但在多数情况下抗原物质只能得到部分 纯化，如部分纯化的干扰素。在经过克 隆化选出最适当的单克隆抗体。在制备 恶性肿瘤细胞表面抗原的单克隆抗体时， 情况更为复杂，需要整个肿瘤细胞作为 免疫原，经过筛选、克隆化制备出仅存 于肿瘤细胞而不存在于正常细胞上的表 面标志分子的单克隆抗体。
第四章抗体制药123节解析
细胞融合的骨髓瘤细胞应具备的条件: 应具有融合率高，自身不分泌抗体，所
产生的杂交瘤细胞分泌抗体能力强且长 期稳定。 PEG的要求： PEG相对分子量4000，浓度为50%， 二甲基亚砜（DMSO）增加融合率。
第四章抗体制药123节解析
体外免疫法基本方法：
用4～8周龄BALB/c小鼠的脾 脏制成单个细胞悬液，再加入适 当抗原使其浓度达0.5～5µg/mL, 在5% CO2、37℃下培养4～5d,再 分离脾细胞,与骨髓瘤细胞进行杂 交。
第四章抗体制药123节解析
二、细胞融合与杂交瘤细胞的 选择性培养
细胞融合的基本方法： 脾细胞（1×10８） 骨髓瘤细胞（2×10７）混合 聚乙二醇（PEG）诱导下融合，时间＜ 2min，然后用培养液将融合液缓慢稀 释。
颗粒性抗原（如细菌、细胞抗原） 的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入 腹腔10７个细胞进行初次免疫，间隔 1～3周，再追加免疫1～2次。
第四章抗体制药123节解析
可溶性抗原按每只小鼠10～100µg 抗原与福氏完全佐剂等量混合后注 入腹腔内，进行初次免疫，间隔 2～4周，再用不加佐剂原抗原追加免疫
1～2次。 一般在采集脾细胞前3日由静脉注射最后
第四章抗体制药123节解析
单克隆抗体用于临床治疗，如针对于T 淋巴细胞共有的分化抗原CD3（Cluster of differentiation,CD3）的单克隆抗体作为因 对器官移植免疫排斥有抑制作用，用作免 疫抑制剂已经上市。
以单克隆抗体作为药物的载体对肿瘤 进行定向治疗。
第四章抗体制药123节解析
第四章抗体制药123节解析
第二节 单克隆抗体
是将抗体产生的细胞与具有无限增殖能力 的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆 化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产 生的抗体。
单克隆抗体是针对一个抗原决定族的抗体，又是单一 的B淋巴细胞克隆产生的；它的结构和特异性完全相同 的高纯度抗体。
第四章抗体制药123节解析