分子克隆载体
基因工程第三章分子克隆载体
2、可扩增性 质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复
制。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 ～几个；松驰型
质粒拷贝数较多，可达几百。
严谨控制型 拷贝数少，一般<10个，分子量大；
松弛控制型 拷贝数多，10-200个，分子量小；
复制受限，受细菌宿主DNA复制系 统的控制；
复制不受细菌DNA复制系统限制， 当宿主蛋白质合成受抑制时（如培 养中加入抗生素时），其拷贝数可 猛增至1000-3000之多，该性质对 基因工程技术十分有利。
7、载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段。
第一节 质粒载体
一、质粒的基本特性
质粒(plasmid)：是 独立于许多细菌及某些 真核细胞染色体外共价 闭合环状的DNA分子， 能独立复制的最小遗传 单位，大小在1—200kb 之间。和病毒不同，它们 没有衣壳蛋白（裸DNA）。
绝大多数质粒DNA是双链环形，它具有3种不同的构型:
来自pSCl01的 四环素抗性基因 Tetr
来自RSF2124的 氨苄青霉素抗性基 因Ampr。
特点
1. 具有多个单一的限制性内切酶位点。
2. Tetr中有BamH1切点（G↓GATCC）和SalⅠ切点 （G↓AATTC），Ampr中有PstⅠ切点（CTGCA↓G）。
3. 利用ColEl的复制子，所以在细胞中是多拷贝的，可通过氯 霉素使质粒拷贝数进一步扩增。
基因工程
第三章 分子克隆载体
商丘师范学院 马原松
பைடு நூலகம்
第三章 分子克隆载体
教学目的和要求:本章主要阐明用于核酸操作的各种载体: 质粒载体、噬菌体载体和单链丝状噬菌体载体等。通过 本章的学习要求学生了解质粒的基本特性，λ噬菌体的 分子生物学，穿梭载体、整合载体、解离载体等其它载 体；理解大肠杆菌表达载体；掌握质粒载体的工作原理， 噬菌体载体种类及工作原理，粘粒载体、噬菌粒载体的 工作原理。 重点、难点：质粒载体、噬菌体载体的种类和工作原理。 教学方法：讲授、讨论、计算机辅助教学等
CHAPTER 8 分子克隆载体
严谨型和松弛型
一、质粒的基本特征
3.质粒的不相容性 两个质粒在同一宿主中不能共存(不能 共用同一复制系统)。
4.转移性
质粒可通过细菌结合的作用转移到新
宿主细胞内。
二、标记基因
1.选择标记基因 用于鉴别目的DNA的存在，将成功转 化了载体的宿主挑选出来。 最广泛使用的是抗生素基因：ampr，
克 隆 载 体
克 隆 载 体
表 达 载 体
第二节 λ噬菌体载体
一、λ噬菌体的分子生物学
1.基因组大小：双链DNA，48,502bp 2.感染宿主后进入： 容原状态，将λ噬菌体基因组DNA通过位 点专一性重组整合到宿主的染色体中， 并随宿主的繁殖传递给子代。 裂解循环，大量复制并装配成子代λ噬菌体 颗粒，导致宿主细胞裂解。
YAC载体的复制元件是其核心组成成分，其 在酵母中复制的必需元件包括： 复制起点序列即自主复制序列 (autonomously replicating sequence，
ARS)、
用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒
(centromere, CEN)和两个端粒(TEL)。
YAC载体结构
(1)端粒重复序列(telomeric repeat，TEL)：定位 于染色体末端一段序列，用于保护线状的DNA 不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。 (2)着丝粒(centromere，CEN)：有丝分裂过程中 纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能 正确分配到子细胞中。在YAC中起到保证一个细 胞内只有一个人工染色体的作用。如pYAC4使 用的是酵母第四条染色体的着丝粒。 (3)自主复制序列(autonomously replication sequences，ARS)一段特殊的序列，含有酵母 菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号。
分子克隆标准载体应具备的基本条件
分子克隆标准载体应具备的基本条件
以分子克隆标准载体应具备的基本条件为标题，我们需要了解什么是分子克隆，什么是标准载体，以及标准载体应具备的基本条件。
分子克隆是指将DNA分子从一个生物体中提取出来，然后将其插入到另一个生物体中的过程。
这个过程需要使用到标准载体，标准载体是指一种能够承载外来DNA分子并将其复制的DNA分子。
标准载体通常是一种环状的DNA分子，它可以在细胞中自我复制，并且可以被细胞所识别和复制。
标准载体应具备的基本条件如下：
1. 选择合适的载体：标准载体应该是一种常见的、易于操作的、能够被广泛使用的载体。
常见的标准载体包括质粒、噬菌体、人工染色体等。
2. 具有多个限制性内切酶切位点：标准载体应该具有多个限制性内切酶切位点，这样可以方便地将外来DNA分子插入到载体中。
3. 具有选择性标记：标准载体应该具有选择性标记，这样可以方便地筛选出带有外来DNA分子的细胞。
4. 具有复制起点：标准载体应该具有复制起点，这样可以方便地在细胞中自我复制。
5. 具有适当的大小：标准载体的大小应该适当，既不能太小，否则无法承载外来DNA分子，也不能太大，否则会影响细胞的生长和复制。
6. 具有稳定性：标准载体应该具有稳定性，能够在细胞中长期存在并自我复制。
7. 具有易于操作性：标准载体应该具有易于操作性，能够方便地进行分子克隆实验。
标准载体是分子克隆实验中不可或缺的一部分，它应该具备多个限制性内切酶切位点、选择性标记、复制起点、适当的大小、稳定性和易于操作性等基本条件。
只有具备这些基本条件的标准载体才能够被广泛应用于分子克隆实验中，为科学研究提供有力的支持。
克隆载体构建实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习克隆载体的构建方法，掌握分子克隆的基本原理和操作步骤。
2. 掌握利用限制性内切酶和DNA连接酶进行DNA片段的插入和连接。
3. 熟悉重组质粒的鉴定和扩增方法。
二、实验原理克隆载体是分子生物学研究中常用的工具，它可以将目的基因插入其中，并在宿主细胞中进行扩增。
克隆载体的构建主要包括以下步骤：1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因片段。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段。
3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，使其具有末端粘性。
4. DNA片段连接：将目的基因片段与载体进行连接。
5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至宿主细胞。
6. 鉴定和扩增：通过PCR、酶切等方法对转化后的细胞进行鉴定和扩增。
三、实验材料1. 试剂：PCR引物、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA分子量标准、Taq酶、pUC19载体、感受态细胞等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、DNA纯化柱等。
四、实验步骤1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，引物长度一般为20-30个碱基，其中包含酶切位点。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段，PCR反应体系如下：- 10×PCR缓冲液5μl- dNTPs（每种2.5μmol/L）4μl- 引物（上下游引物各1μmol/L）2μl- DNA模板1μl- Taq酶0.5μl- ddH2O补充至50μl3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，反应体系如下：- 载体DNA 5μl- 10×酶切缓冲液5μl- 限制性内切酶1μl- ddH2O补充至20μl4. DNA片段连接：将PCR产物与载体进行连接，反应体系如下：- 线性化载体DNA 5μl- PCR产物5μl- 10×连接缓冲液5μl- DNA连接酶1μl- ddH2O补充至20μl5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至感受态细胞，具体操作方法如下：- 将感受态细胞铺板于含有适当抗生素的培养基上，37℃培养过夜。
第三章 分子克隆载体(Molecular cloning vectors)
第三章分子克隆载体（Molecular cloning vectors）［本章摘要］将外源DNA 或基因携带入宿主细胞（host cell）的工具称为载体，载体是基因操作的核心工具。
质粒载体是最常见的载体，也是使用最方便的载体。
它应用了质粒的复制、拷贝数及不相容性等性质。
质粒载体有抗性基因、琥珀突变抑制基因等多种选择标记和α-互补、插入失活等筛选标记。
常见的质粒载体有：pBR322、pUC18/19、pUC118/119、pGEM-3Z/4Z以及一些多功能的质粒载体，如：pBluescriptⅡKS（±）。
λ噬菌体载体应用了λ噬菌体的生物学性质。
λ噬菌体有溶源状态和裂解循环两种状态，有着复杂的分子生物学调控机制。
λ噬菌体载体有大小、lacZ基因、cI 基因失活以及Spi 筛选等选择标记，分为插入型载体和置换型载体。
常见的插入型载体有：λgt10、λgt11及其衍生载体和λExcell 载体等。
常见的置换型载体有：EMBL3/4 及其类似载体，λgem-11 载体。
粘粒是带有cos 序列的质粒。
粘粒载体的工作使用了质粒和λ噬菌体的双重生物学性质。
常见的粘粒载体有：pJB8、pcos1EMBL 以及卡隆9 载体系列。
构建粘粒文库时会遇到许多困难，注意用对应的方法解决。
M13 噬菌体是一种单链噬菌体，基于其构建的载体可以制备单链DNA 。
常见的M13 噬菌体载体有M13mp18/19 ，其受体细胞有特殊的遗传标志。
带有丝状噬菌体大间隔区的质粒叫噬菌粒，噬菌粒工作的时候需要M13K07 辅助噬菌体的帮助。
人工染色体是一种高通量的载体。
Y AC 是基于酵母染色体生物学性质构建的载体，BAC 是基于 F 质粒的生物学性质构建的载体，PAC 是基于P1 噬菌体构建的载体。
大肠杆菌表达载体是最常见的表达载体，可分为表达融合蛋白的载体和非融合蛋白表达载体。
常用的标签蛋白有谷胱甘肽转移酶、六聚组氨酸肽、蛋白质A 和纤维素结合位点等。
分子克隆中载体的选择标准特性
分子克隆中载体的选择标准特性
在分子克隆中，选择合适的载体是非常重要的。
以下是一些选择载体的标准特性：
1.大小：载体应具有足够的大小来容纳所需的DNA序列，包括目标基因和其他重要元素，如启动子、终止子和选择标记等。
2.多克隆位点：载体通常含有多个克隆位点，使得可以同时插入多个目标序列。
这些位点通常是限制性内切酶切割位点。
3.选择标记：载体上通常携带有选择标记，例如抗生素抗性基因，以便在转化后对成功克隆的细菌进行筛选。
4.复制数：载体的复制数是指在细胞中存在的拷贝数目。
高复制数的载体能够更有效地产生目标基因的拷贝，但也可能导致不稳定性。
选择合适的复制数取决于实验的需要。
5.可调控性：某些载体具有可调控的表达系统，可以根据需要调整目标基因的表达水平，例如使用诱导子来控制基因的启动。
6.安全性：选择的载体应该是安全的，不会引起不良反应或对宿主细胞产生不利影响。
7.序列可用性：确定载体序列是否已被广泛验证和文献报道，确保其可靠性和有效性。
8.兼容性：载体应与所选择的宿主细胞类型兼容，以确保高效地转化和复制。
三四章分子克隆载体---答案_完_
三四章分⼦克隆载体---答案_完_第三章分⼦克隆载体（Molecular cloning vectors）⼀、名词解析1.质粒：质粒是染⾊体外的遗传因⼦，能进⾏⾃我复制（但依赖于宿主编码的酶和蛋⽩质）；⼤多数为超螺旋的双链共价闭合环状DNA分⼦（covalently closed circle , cccDNA），少数为线性；⼤⼩⼀般为1～200Kb，有的更⼤。
2.质粒拷贝数：质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单⼀质粒的份数同染⾊体数之⽐值,常⽤质粒数/每染⾊体来表⽰。
不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同。
3.质粒的不相容性：两个质粒在同⼀宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第⼆个质粒导⼊后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。
不相容的质粒⼀般都利⽤同⼀复制系统，从⽽导致不能共存于同⼀宿主中。
4.质粒的转移性：质粒具转移性。
它是指在⾃然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作⽤转移到新宿主内。
它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因⼦ bom 及其内部的转移缺⼝位点 nic。
5.穿梭质粒：既能在真核细胞中繁殖⼜能在原核细胞中繁殖的载体。
这类载体必须既有细菌的复制原点或质粒的复制原点，⼜含有真核⽣物的复制原点，还具备酶切位点和合适的筛选指标。
它⽤来转化细菌，⼜可以⽤于转化真核细胞。
6.α-互补：α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。
α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补⽽建⽴的7.温和噬菌体：既能进⼊溶菌⽣命周期⼜能进⼊溶源⽣命周期的噬菌体。
8.溶源性细菌：具有⼀套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。
9.整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染⾊体DNA中，便叫做已整合的噬菌体DNA。
分子克隆连接载体和片段的比例
分子克隆连接载体和片段的比例分子克隆是一项重要的实验技术，广泛应用于生物学和生物工程领域。
在分子克隆过程中，连接载体和片段的比例是决定克隆成功率的关键因素之一。
连接载体是将目标DNA片段插入和复制的重要载体，在克隆过程中起到承载和传递目标DNA的作用。
而片段则是我们想要克隆的具体DNA序列，可以是基因、启动子等等。
为了成功进行分子克隆，合适的连接载体和片段比例是必不可少的。
首先，合理的连接载体和片段比例可以确保连接过程的高效进行。
过多或过少的连接载体可能导致反应不完全，影响克隆效率和结果。
通常情况下，建议将连接载体和片段以1:3至1:5的比例混合，这样可以确保足够的连接载体存在，以提高连接效果。
同时，过量的连接载体也可以降低外源片段自身的浓度对克隆过程的干扰。
其次，适当的连接载体和片段比例可以减少副产物的产生。
在分子克隆的过程中，除了期望的克隆产物外，可能还会出现一些不希望的副产物。
这些副产物可能是连接载体自身的多聚体，或者是连接载体和片段之间错误连接产生的杂合体。
通过控制连接载体和片段的比例，可以减少这些副产物的产生，提高克隆产物的纯度和质量。
最后，恰当的连接载体和片段比例对于经济性和实验效果的平衡也是很重要的。
过多的连接载体会增加实验成本，而过少的连接载体可能无法提供足够的承载能力。
合理的连接载体和片段比例可以避免过度使用连接载体，节约实验成本的同时确保所需的克隆效果。
因此，在实验中选择适当的连接载体和片段比例是非常重要的。
总之，合理的连接载体和片段比例是分子克隆中必不可少的考虑因素。
通过调整连接载体和片段的比例，可以提高克隆效率，减少副产物的产生，并在经济性和实验效果之间取得平衡。
这样的指导性文章，可以帮助广大生物学和生物工程领域的研究者更好地进行分子克隆实验，进而推动科学研究和应用的发展。
分子克隆详细步骤
分子克隆详细步骤分子克隆是通过重组DNA分子来产生大量完全相同的DNA序列的技术。
在分子克隆工作中，我们主要进行克隆载体的构建、目标DNA的扩增、将目标DNA插入克隆载体中、转化和筛选等步骤。
下面将详细介绍这些步骤：1.克隆载体的构建：克隆载体是用于插入目标DNA的DNA分子。
常用的克隆载体包括质粒、噬菌体和人工染色体等。
在构建克隆载体时，我们首先需要选择适合的载体，并提取载体的DNA。
然后，利用酶切酶对载体进行酶切，生成线性的载体DNA。
接下来，将目标DNA插入克隆载体的相应位点上，形成重组的载体。
2.目标DNA的扩增：目标DNA可以通过PCR（聚合酶链反应）来扩增。
首先，设计引物，使其与目标DNA的两端末端相互互补。
然后，在PCR反应中，通过DNA聚合酶的扩增作用，使目标DNA得以扩增。
PCR反应通常包括模板DNA、引物、核苷酸和聚合酶等成分。
3.目标DNA的插入：将扩增后的目标DNA与酶切后的载体进行连接，利用DNA连接酶催化目标DNA与载体之间的连接反应，生成重组的克隆载体。
连接后的载体含有目标DNA的序列。
4.转化：将克隆载体引入宿主细胞中进行复制。
这一步骤通常称为转化。
转化可以通过电击、热激、化学方法等方式进行。
宿主细胞通常是大肠杆菌等细菌。
5.筛选：利用筛选方法来选择包含目标DNA的克隆。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、报告基因筛选和限制性内切酶酶切筛选等。
抗生素筛选是将带有选择性抗生素耐受基因的克隆引入含有相应抗生素的培养基中，只有带有目标DNA的克隆才能生长。
报告基因筛选是通过将报告基因插入克隆载体中，使之与目标DNA一起被转录和翻译，从而表达报告基因的蛋白质，以此来筛选包含目标DNA的克隆。
限制性内切酶酶切筛选是通过限制性内切酶对重组载体和目标DNA进行酶切，并通过凝胶电泳的方法来分离并检测含有目标DNA的克隆。
以上就是分子克隆的详细步骤。
通过这些步骤，我们可以获得大量完全相同的DNA序列，并用于各类分子生物学研究和应用中。
克隆载体的名词解释
克隆载体的名词解释克隆载体是分子生物学实验中常用的工具，用于携带并负载外源DNA片段，以实现基因克隆和基因工程。
克隆载体可由天然或人工合成的DNA构建而成，广泛用于基础研究、基因表达、基因治疗等领域。
本文将从克隆载体的定义、组成结构、常见类型以及应用等方面对其进行解释。
一、克隆载体的定义克隆载体是指用于将目标外源DNA导入到宿主细胞或有机体中，并在其中进行自主复制、表达和传递的DNA分子。
克隆载体具有一系列特定的序列和功能元件，包括起始子、终止子、选择标记、荧光蛋白等，以确保成功实现目标DNA的克隆和表达。
二、克隆载体的组成结构克隆载体通常由一个或多个元件组成，包括DNA序列、选择标记、表达载体以及复制起源，具体结构如下：1. DNA序列：克隆载体内含有目标外源DNA的序列，其大小和类型因实验需求而异。
DNA序列通常具有特定的限制性内切酶切位点，以便于将外源DNA片段定向插入到载体中的特定位置。
2. 选择标记：为了筛选成功克隆和转入宿主细胞的载体，克隆载体通常携带有选择标记基因，如抗生素抗性基因或荧光蛋白基因。
这些标记基因在宿主细胞中可以提供对抗生素的耐药性或特定荧光表达，从而方便筛选出含有目标外源DNA的成功克隆载体。
3. 表达载体：对于需要进行表达的克隆载体，其内部还包含有启动子、终止子以及表达宿主基因的相关元件。
这些元件协同作用，使得克隆载体能够在宿主细胞中进行基因的转录和翻译，从而实现目标基因的表达。
4. 复制起源：为了保证克隆载体能够在宿主细胞中独立复制，克隆载体通常还含有复制起源序列。
复制起源序列可以与宿主细胞的复制系统相互配合，使得克隆载体能够被复制并遗传到下一代细胞中。
三、克隆载体的常见类型克隆载体具有多种类型，根据其应用和特性的不同，常见的克隆载体包括质粒、噬菌体、合成DNA以及病毒载体等。
1. 质粒（Plasmid）：质粒是环状的双链DNA分子，常见于细菌和真核生物中。
质粒通常具有小分子大小（约1-10 kb），较容易复制和操纵。
3分子克隆载体
顺式作用元件指的是在同一条核苷酸链上起调控基因作用的核酸序 列，常不编码蛋白质合成。 反式作用因子则指的是对不同核酸链上的基因表达起到调控作用的 蛋白，编码该蛋白的基因与其识别结合作用的核酸链不是同一链。 顺式作用元件在分子遗传学领域，相对同一染色体或DNA分子而言 为“顺式”（cis）；对不同染色体或DNA分子而言为“反式” （trans）。
（3）连接产物的电转化 ①大肠杆菌DH10B感受态细胞的制备：( 见分子克隆指南第 三版 )
②电转化:取100mL菌悬液于一个0.2cm的电击杯(Bio-Rad产 品)中，加入一定浓度的供体质粒DNA（一般3～5mL），混匀 后在冰浴上放置10－20min，用Genepulser TM型电脉冲仪(BioRad产品) 进行电脉冲。电脉冲参数选定为：脉冲场强V =9.0 kV/cm，电容C =25 m F，阻抗 R =200Ω，脉冲时间G =4.0～ 4.8ms。电脉冲完毕后，加入0.8mLSOC培养液于电转化杯中， 并在37℃以150r/min恢复培养2h后，涂布氯霉素抗性平板，置 37℃d Ⅲ与Not Ⅰ酶切
（3）电洗脱（透析） 首先将脉冲电泳后50kb左右的条带切胶，把此条胶装入煮过 的灌满1×TAE（50×TAE母液：2mol/L Tr is×HCl，pH8.0 ， 1mol/L乙酸，100 mM/LEDTA）缓冲液的透析袋中，将缓冲液 尽量倒净，进行透析电泳，电泳参数为120v电压，电泳2－2.5h 后反向电泳30－40s。将透析袋轻轻揉搓下，吸出透析后的50kb 左右的外源 DNA 。
(1)氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin, ampr） 使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌 中克隆的质粒载体带有该基因。 青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的 酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。 氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌 进入细菌的周质区，催化 β-内酰胺环水解，从 而解除了氨苄青霉素的毒性。
大肠杆菌分子克隆载体课件
ⅱ) DNA复制： O 、P 、Q
ⅲ)λ重组： int 、xis 、redβ和gam
ⅳ)噬菌体颗粒形成与细胞裂解：头(A-F)、尾(E-J) 、S & R (细胞裂解) λ中部约1/3的DNA(b2)与λ存活无关 。
如插入片段的5’段定向缺失: XbaI→SphI→ExoⅢ→S1→T4 DNA lingase; 插入片段的3’-端亦可采用类似的方法进行缺 失(SmaI→SstI→ExoⅢ→S1→T4 DNA lingase)
不同载体中的多克隆位点区可以供不同目的片段的重组。又 例如: pBS+ 多克隆位点区的排列顺序是(见图)： 假设有一EcoRI→HindⅢ DNA片段，并要求在其3’末端或5’-端接上另外的DNA片段(如终止子、启动子)， 显然， pUC系列载体的多克隆位点区是不太适宜，但选用 pBS+ 中的多克隆位点区就能满足要求。
ⅲ. 多克隆位点集中排列，有利于克隆片段的物理图谱的
绘制。
除上述三个特点外， pUC系列载体还可用于表达外源 基因 (噬菌体载体
1. 噬菌体λ载体
1) λ的结构和特点
i. 一般结构： 48,502bp，线状ds-DNA，两端具有12n.t 5‘
- 突 起 ( 5 ’ - GGGCGGCGACCT- 3 ’ ) 该 末 端 称 为 cos位 点，可被λ编码的末端酶所识别(该酶由λ末端的两个 基因Nul和A编码蛋白gpNul和gpA组成) ii. 基因结构—46个基因，分为以下四类：
供所有反式作用的蛋白质，前者便会发生接合转移。 ⅲ.重组转移(conduction) —若质粒无oriT，该质粒只
分子克隆载体
第三章 分子克隆载体第一节 分子克隆载体如果只有基因而没有负责运载它的载体，则基因就不可能发挥作用。
基因工程载体决定了外源基因的复制、扩增和表达。
载体的本质DNA。
载体（vector）就是指携带外源DNA片段进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。
目前常用有载体有很多种，它们分别由从细菌质粒、噬菌体DNA、病毒DNA分离出的元件组装而成。
它们可分为克隆载体和表达载体，表达载体又分胞内表达和分泌表达载体。
从表达所用的受体细胞，又可分为原核细胞和真核细胞载体。
从功能上又可分为测序载体、克隆-转录载体和基因调控报告载体等多功能载体。
1.1 克隆载体1.1.1 克隆载体具备的条件①载体都能携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞，或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA上，随着染色体DNA的复制而同步复制。
②载体都具有合适的筛选遗传标记。
③载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶位点，即多克隆位点。
④载体都必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物细胞，尤其是人的细胞。
⑤载体本身的分子量都比较小，可容纳较大的外源基因片段。
⑥载体在细胞内的拷贝数要高，方便外源基因在细胞内大量扩增。
⑦载体在细胞内稳定性要高，保证重组体稳定传代而不易丢失。
⑧载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。
克隆载体在基因工程中占有十分重要的地位，目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持和高效表达，在很大程度上取决于克隆载体。
基因工程是随着克隆载体系统的建立才发展起来的。
原核生物基因工程之所以起步早，发展快，成果大，就是因为最早建立了适用于原核生物的克隆载体系统，并且至今已建立了种类繁多的用于原核生物的大量克隆载体。
近十年来，植物基因工程所发展，同样是因为成功地构建了适用于植物的一系列的克隆载体。
因此，国内外把构建新的克隆载体始终作为基因工程基础研究的优先项目，构建的克隆载体可以申请专利保护。
克隆载体的基本结构
克隆载体是指在基因工程中用来携带和复制目标基因的一类DNA分子。
它具有以下基本结构：
1.起始子：克隆载体中通常包含一个起始子，用于启动基因表达。
起始子通常是一段特定的DNA序列，可以与细胞的转录因子相互作用，从而使目标基因开始转录。
2.复制起点与选择标记：克隆载体中含有复制起点，该起点可以被细胞内的DNA 复制酶识别并复制。
此外，常会在载体中引入选择标记，如抗生素抗性基因，用来筛选带有载体的细胞。
3.多克隆位点：多克隆位点是载体中用来接受目标基因的特定位置。
常见的多克隆位点包括限制性内切酶切割位点、连接酶切割位点等。
通过在多克隆位点插入目标基因，可以实现基因的克隆和表达。
4.报告基因：有时候，克隆载体中还会引入报告基因，用于检测目标基因的表达情况。
报告基因通常是一种易于观察或测量的基因，如荧光蛋白基因，它可以发出特定颜色的荧光。
总的来说，克隆载体的基本结构是由起始子、复制起点与选择标记、多克隆位点和报告基因等组成。
通过这些结构的设计和组装，可以方便地进行目标基因的插入、复制和表达。
第三章 分子克隆的载体
3
载体的特征
分子较小，可携带比较大的DNA片段。 能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。 要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制 酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。 有合适的选择标记，易于筛选。 有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。 从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
11
一、质粒的基本特征
质粒的表型：抗生素的抗性，产生抗生素、降解复 杂有机化合物、产生毒素（如大肠杆菌素、肠毒 素）、合成限制性内切酶和修饰酶、生物固氮和杀 虫等
12
✓ 克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA 水平上的操作。
✓ 基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、
储存和表达。
25
✓ 筛选标记基因 主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外
源 DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可通 过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重 组质粒。
α-互补 插入失活
26
α-互补
α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变
体与带有完整的近操纵基因区段的 β-半乳糖苷酶（β galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体 之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷 β半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。
37
38
2）pUC18/19质粒载体
• 来自pBR322 • 拷贝数 2000 - 3000 / cell • 装有多克隆位点（MCS）
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
分子克隆载体（vector）载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。
载体同外源DNA在体外重组成DNA 重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。
重组DNA 技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。
载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。
载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。
因此，作为载体应该满足以下几方面的要求：①有某种限制酶的一个切点，最好是有许多种限制酶的切点，而且每种酶的切点只有一个；②外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自我复制，载体应对受体细胞无害，以及载体能接纳尽可能大的外源DNA片段；③有利于选择的标记基因，可以很方便地知道外源DNA已经插入，以及把接受了载体的受体细胞选出；④具有促进外源DNA表达的调控区。
重组DNA技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。
它们的受体细胞都是大肠杆菌。
这四种载体的大小和结构尽管各不相同，但它们的共同特点是：①都能在大肠杆菌中自主复制，而且能连同所带的外源DNA一起复制；②都很容易同细菌DNA分开并加以纯化；③都有一段DNA对于它们自身在细菌中的增殖不是必需的。
因此，外源DNA可以插入这一段DNA中，或是置换这一段DNA而不影响载体的复制。
根据这一特点，载体又可分成插入型和置换型两大类。
质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。
载体可以分为：克隆载体、表达载体及穿梭载体。
1.克隆载体(cloning vector):通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。
将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。
常见的载体有质粒，噬菌粒，酵母人工染色体。
对载体的要求一种用作克隆载体的理想质粒一般具备下述特点：①具有松驰型复制子（如ColE1），复制子（replicon）是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，并可协助维持使每个细胞含有一定数量的质粒拷贝。
②在复制子外存在几个单一的酶切位点（或多克隆位点），以便目的DNA片段插入。
③具有插入失活的筛选标记，理想的质粒载体应具有两种抗菌素抗性标志，如氨苄青霉素抗性基因（Amp r）和四环素抗性基因（Tet r）等，以便从平板中直接筛选阳性重组子。
④分子量相对较小和较高的拷贝数。
此外，质粒的缺点是容量较小，一般只能接受小于15kb的外来DNA，插入片段过大会导致重组子扩增速度减慢，甚至使插入片段失活。
主要是对目的基因克隆,建立DNA文库和cDNA文库,其上有复制子即可。
2.表达载体(expression vector):就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS 位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（注释RBS：核糖体结合位点（ribosome-binding site）即核蛋白体结合位点是细胞mRNA的一段序列，它包括蛋白质合成起始期被30S亚基结合的一个起始密码子。
翻译起始作用发生在称为核糖体结合位点的mRNA的特定序列上。
这是位于编码区前面的一段很短的碱基序列。
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。
大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。
mRNA翻译的起始效率主要由其5‘端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）3.穿梭载体(shuttle vector):是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。
例如既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体.这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因,还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状,具有多克隆位点.通常穿梭载体在细菌中用于克隆,扩增克隆的基因,在酵母菌中用于基因表达分析.一、质粒质粒（plasmid）是许多种细菌中发现的染色体外的遗传因子，它是闭合环状的双链DNA 分子，大小从1kb直到200kb以上。
质粒所带的基因通常有利于宿主细胞。
例如基因的产物是某些抗生素或对某些抗生素的抗性、能降解某些复杂的有机化合物、产生大肠杆菌素和肠毒素、产生限制酶或修饰酶等。
质粒DNA分子具有三种构型:Closed circle DNA,ccDNA;supercoil;SC构型；Open circle DNA,OC构型；Liner DNA,IDNA;L构型。
在天然条件下，许多种质粒是通过类似于细菌接合的过程传递给新的宿主。
在实验室条件下，质粒则可通过转化过程进入受体细胞。
（质粒具转移性。
它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。
它需要移动基因mob，转移基因tra，顺式因子bom及其内部的转移缺口位点nic。
）此时，受体细胞已经过处理而处于感受态，即它的细胞暂时易于让小的DNA分子透过。
受体细胞由于质粒的进入而产生了新的表型。
如对某种抗生素的抗性，这样就可用这种抗生素作为选择条件，选出被质粒转化的受体细胞。
质粒复制时利用宿主细胞复制自身染色体的同一组酶系。
有些质粒处于“严紧控制”之下，即它们的复制是同宿主细胞的复制偶联同步的。
因此在每个细胞中的质粒只有一份拷贝，或最多只有几份拷贝。
这称为“严紧型”质粒。
另一些质粒则是处于“松弛控制”之下的“松弛型”质粒。
每个细菌中可以有10～200份拷贝。
更重要的是松弛型质粒的拷贝数，可因宿主细胞停止合成蛋白质而增加至几千份。
宿主细胞不合成蛋白质时，染色体和严紧型质粒的复制都中止。
但松弛型质粒仍继续进行复制。
因此在增殖松弛型质粒时，总是要让宿主菌经氯霉素处理（在培养液中加入适量的氯霉素）抑制蛋白质的合成。
图1pBR322的基本结构（一）大肠杆菌质粒应用的最广泛的质粒载体是pBR322，它属松弛型质粒，有抗氨苄青霉素和抗四环素两个抗性基因可作为标记基因，有许多种常用的限制酶的切点。
它全长4352个核苷酸，排列顺序已全部测定，基本结构如图1，当需要用pBR322来克隆BamHI酶切的一个DNA片段时，一般的做法是如图2所示。
图2pBR322克隆DNA片段的程序从图2可见，外源DNA片段同pBR322都经BamHⅠ酶切，所以有相同的单链“粘性末端”，通过DNA连接酶可以构成重组DNA分子。
由于pBR322的BamHⅠ酶切点在四环素的抗性基因中，所以BamHⅠ酶切后使这个抗性基因失活。
如果酶切后的质粒pBR322自身又重新连接，则恢复对四环素的抗性，转化子就仍然具有对二种抗生素的抗性。
如果pBR322中插入外源DNA，则转化子失去了四环素抗性表型，而只有对氨苄青霉素的抗性，这样就可根据转化子的抗性而把重组质粒转化的细菌选出，然后扩增细菌，大量回收质粒DNA，从而达到大量扩增外源DNA的目的。
（二）真核生物中的质粒真核生物中的酵母是国内外广泛研究的载体-受体系统之一。
这是一个共价闭环DNA 分子（cccDNA），平均周长2μm，所以称为2μmDNA质粒，在每个酵母细胞里约有100个拷贝。
已有人把2μmDNA同pBR322DNA构建成双功能质粒，可在大肠杆菌和酵母菌中复制。
这种质粒带有啤酒酵母的二个基因（his3和Leu2），所以很容易用酵母的营养缺陷型菌株来选出。
二、噬菌体和病毒载体噬菌体λ是最主要的一种载体。
自从1974年以来，已用野生型λ改造和构建出一系列噬菌体载体。
噬菌体λ是温和噬菌体。
基因组是长约50kb的双链DNA分子。
在噬菌体λ颗粒中，DNA 是线状双链分子带有单链的互补末端。
末端长12个核苷酸，这称为粘性末端，简写COS。
当噬菌体感染宿主细胞后，双链DNA分子通过COS而成环状。
在感染早期，环状DNA分子进行转录。
在此期间，噬菌体有两条复制途径可供选择：一是裂解生长。
环状DNA分子在宿主细胞里复制若干次，合成了大量的噬菌体基因产物，形成子代噬菌体颗粒，成熟后使细菌裂解，释放出许多新的有感染能力的病毒颗粒。
另一是溶源性生长。
噬菌体DNA整合进宿主菌的基因组，然后象细菌染色体上的基因一样进行复制，并传递给下一代细菌。
λ噬菌体颗粒中DNA为线状双链DNA分子,全长48502bp,两端各有一段长度为12个核苷酸的互补单链(粘端),称为cos位点.λ噬菌体有61个基因,其中有1/3的区域是其裂解性生长的非必需区,这一区段的缺失,或在此区段中插入外源DNA,并不影响噬菌体的增殖,这就是λ噬菌体可作为基因载体的依据.（一）噬菌体λ载体的构建野生型噬菌体λDNA全长约50kb，上有65种限制酶酶切点，除ApaⅠ、NaeⅠ、Nar Ⅰ、NheⅠ、SnaBⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等7种限制酶各有一个切点外，其余都多于2个。
有些酶切点在λ增殖所必需的基因区域内。
因此，噬菌体λ必须经过改造才能用作载体。
现在用的λ载体大都除去了某种限制酶的酶切点。
因此，作为载体的噬菌体λ都短于野生型。
噬菌体λ载体有两种类型：①插入型。
由于改建后的噬菌体λDNA都短于野生型，所以可插入外源DNA。
只要插入的位置不影响噬菌体增殖。
而且噬菌体DNA缺失越长，插入片段就可越大。
②置换型。
噬菌体λ的基因组可分为三个区域，左侧区包括使噬菌体DNA 成为一个成熟的、有外壳的病毒颗粒所需的全部基因，全长约20kb。
右侧区内包含所有的调控因子、与DNA复制及裂解宿主菌有关的基因，这个区域约长12kb。
中间区域约长18kb，这一段DNA可以被外源置换而不会影响噬菌体λ裂解生长的能力。
置换型噬菌体λ是使用最广泛的载体。
噬菌体λ裂解生长的能力同包装在头蛋白中的λDNA的大小有关。
当DNA的长度短于野生型的78%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降。
因此要求λ载体DNA和外源DNA 长度之和在39～53kb之间。
置换型载体DNA用选定的限制酶完全酶切后，要设法除去中间片段，只留下左臂和右臂以便用外源DNA片段连接，包装成重组噬噬体。
这是因为左臂和右臂与中间片段间都有单链“粘性末端”，在连接酶作用下可以重新恢复原来的结构，从而影响了同外源DNA的连接。