疏水作用层析

第二部分 药学生化实验

实验一. 疏水作用层析

【实验目的】

通过实验了解疏水作用层析的原理与方法。

【实验原理】

疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography ，HIC ）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。疏水作用层析的基本原理如图所示。

溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。

Phenyl-Sepharose TM

6 Fast Flow 是疏水性层析介质的一种，这种层析介质是以交联琼脂糖为支持物，交联琼脂糖支持物与苯基共价结合。苯基作为疏水性配体，可以与疏水性物质发生疏水作用。Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow 结构示意图如下。

O CH 2CH CH 2O OH

【实验材料】

1．实验器材

层析柱（1.6X20cm ）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计

2．实验试剂

（1）疏水层析介质：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow

（2）溶液A ：0.1M Na 2HPO 4, pH7.0

+ W

P ：固相支持物

L ：疏水性配体

S ：蛋白质或多肽等生物大分子

H ：疏水补丁

W ：溶液中水分子

P

（3）溶液B：0.1M Na2HPO4,pH7.0，1.7M (NH4)2SO4

（4）蛋白质样品溶于溶液B

【实验操作】

1. 层析介质准备：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow疏水层析介质保存在20%乙醇中，取出层析介质后，倾出乙醇溶液。加入溶液A，溶液的体积约占总体积的1/4。

2. 装柱：将层析柱洗净，固定在铁架台上，层析柱下口用螺旋夹夹紧。加入溶液B，打开下口让溶液流出，排出残留气泡，柱中保留高度约2厘米的溶液。将准备好的层析介质轻轻搅匀，用玻璃棒引流，沿层析柱内壁将层析介质缓慢加进柱中。等到层析介质在柱中沉积高度超过1厘米时，打开下口。柱床高度达到6-8厘米时关闭下口，装柱尽可能一次装完，避免出现界面。

3. 柱平衡：用溶液B平衡1-2个床体积。注意始终保持层析介质处于溶液中，不要干柱。

4. 上样：取样品加入平衡好的层析柱，并收集层析柱下口流出组分，调节流速为1ml/min,每管3ml。

5. 洗涤：用溶液B洗涤1个床体积，洗去上样不吸附组分。收集层析柱下口流出成分。

6. 洗脱与收集：梯度混合器左面装入250ml溶液A，右面装入250ml溶液B。按照100%-0%1.7M (NH4)2SO4梯度洗脱500ml，收集洗脱液。

7. 检测：取各收集管样品，280nm处测定紫外吸收。

8. 疏水层析介质清洗与保存：层析介质先用水清洗，然后用0.5MNaOH洗脱，最后用水洗至中性。处理好的层析介质放在20%乙醇中，4℃保存。

【实验结果】

以各个收集管的管号为横坐标，280nm处紫外吸收值为纵坐标作图，得到洗脱曲线。分析实验结果并讨论。

【思考题】

疏水作用层析与反相层析有什么不同？

Experiment 13 Hydrophobic Interaction Chromatography

【Purpose 】

To understand the principle and method of hydrophobic interaction chromatography .

【Principle 】

Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC) is a versatile method for the purification and separation of biomolecules based on differences in their surface hydrophobicity.

Proteins and peptides usually sequester hydrophobic amino acids in domains away from the surface of the molecule. However, many biomolecules considered hydrophilic have sufficient hydrophobic groups exposed to allow interaction with hydrophobic ligands attached to the chromatographic matrix.

As shown in the following figure, substances are separated on the basis of their varying strength of their hydrophobic interaction with hydrophobic groups attached to the uncharged matrix.

Hydrophobic interaction between a biomolecule and the matrix is enhanced by high ionic strength buffers. This technique is usually performed in the presence of moderately high concentrations of salts in the adsorption buffer. Elution is achieved by a linear or step wise decrease in concentration of the salt.

Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow is one of the HIC medium. In Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow, phenyl groups as HIC ligand which have interaction with hydrophobic biomolecules are coupled to the cross-linked agarose matrices via glycidyl ether bonds (shown in the following figure)。

O CH 2CH CH 2O

OH

【Materials 】

1. Apparatus:

（1）Column （16/20）

（2）Pump

（3）Gradient maker

+ W

P ：Polymer matrix

L ：Ligand attached to polymer matrix

S ：Solute molecule

H ：Hydrophobic patch on surface of solute molecule

W ：water molecules in the bulk solution

P