免疫学实验课件

【实验结果】 孕妇尿格呈均匀浑浊乳状液，无凝集， 妊娠试验阳性；正常尿格出现白色细小凝集 物，随时间延长凝集物变成小块状，妊娠试 验阴性。待检尿若为乳状液，妊娠试验阳性； 若出现凝集，则妊娠试验阴性。
【注意事项】 1．试验所用诊断试剂用前应充分 摇匀，而且应在有效期内使用。 2．加样用的滴管及混匀用的牙签 不能共用。 3．加样不宜太多，玻片应始终保 持水平，以防两格之反应液相混。
【实验结果】 记录受检者红细胞凝集情况，根 据ABO血型鉴定表(下表)，判断受检 者的血型。
ABO血型鉴定表 抗A分型试剂侧
+ — + —
抗B分型试剂侧
— + + —
血型 A B AB O
“＋”表示红细胞凝集，“－”表示红细胞未凝集
二、间接凝集反应
将可溶性抗原或抗体先吸附于适当大小 的颗粒性载体表面（这种载体与免疫无关）， 然后与相应抗体或抗原结合，在适量的电解质 存在下，出现特异性凝集现象，称为间接凝集 反应。 根据载体的不同可将间接凝集反应分为： 间接血细胞凝集试验、间接乳胶凝集试验（及 间接乳胶凝集抑制试验）和金黄色葡萄球菌协 同凝集试验等。
【实验材料】 1.表皮（白色）葡萄球菌菌液（浓度 6~10亿/ml)。 2.肝素溶液（25U/ml）；甲醇，碱性 美蓝（或瑞氏）染液。 3.血红蛋白吸管，凹玻片，载玻片， 采血针，微量加样器，湿盒，显微镜，恒 温培养箱，75%酒精，棉签，香柏油，二甲 苯等。
【实验方法】 1、用微量加样器，吸取肝素20ul加入洁净凹玻片 凹孔内。 2、用酒精棉签消毒手指后，刺破皮肤，以血红蛋 白吸管取血40ul，立即放入盛有肝素的凹玻片凹孔内， 并充分混匀。 3、用微量加样器取葡萄球菌菌液20ul加入上述凹 玻片凹孔内，充分混匀。 4、将凹玻片置于湿盒内，30℃温箱中30min，其间 每隔10min摇匀一次。 5、取一小滴上述混合液，置于载玻片上，用另一 载玻片推成薄血片，待干。 6、滴加甲醇固定3min，水洗。 7、加碱性美蓝染色1~2min，水洗，印干。 8、置油镜下观察吞噬和未吞噬的白细胞并计数。
【实验材料】 1．ABO血型鉴定试剂盒 内含抗A 分型试剂和抗B分型试剂各1支。 2．一次性采血针1枚、洁净玻片2 块、75％酒精、灭菌棉签。 3．84消毒液
【实验方法】 1．取洁净载玻片1块，并标记（如图） B 2．将抗A、B分型试剂分别加 A 抗 抗 1滴于标记有A、B的玻片两侧。 A B
3．用酒精棉签消毒被检者手指尖端，以 采血针刺破皮肤，稍加挤压，使血液流出。 用另一载玻片一端取适量血液加入抗抗A分型 试剂，并混匀；用另一端再取适量血液加入 抗抗B分型试剂，并混匀。用干棉签止血。 4．观察红细胞有无凝集发生。如有凝集， 可见红细胞凝集成块；无凝集，红细胞呈均 匀分散。判定结果后把玻片放入消毒液中。
【实验材料】 1．肝素溶液 用生理盐水将肝素配成125～250 U/ml的溶液，置4 ℃下保存备用。 2．淋巴细胞分层液 市售或自配，20 ℃时密度 应为(1.077±0.001) g/L。 3 ． Hanks 平 衡 盐 溶 液 （ HBSS ） 或 磷 酸 盐 缓 冲 液 （PBS）pH 7.2～7.4。 4．完全RPMI-1640培养液。 5．15 ml或50 ml锥底离心管。 6．水平离心机，显微镜。 7．玻璃吸管，滴管，细胞计数板等。 8．2％台盼蓝染液。
【实验原理】 人类ABO血型抗原主要有A和B两种，根 据红细胞表面这两种抗原的有无可把血型分 为四种。据此，将抗A和抗B抗体分别与待测 红细胞混合，抗A或（和）抗B抗体与红细胞 表面上的相应抗原结合而引起红细胞凝集， 据其凝集情况便可判定出受试者的血型。
ABO血型的划分
红细胞表面Ag A型 B型 AB型 O型 A B A、B —、— 血清中Ab 抗B 抗A —、— 抗A、抗B
二、对流免疫电泳 【实验原理】 带电的胶体颗粒可在电场中移动，移动 方向与胶体颗粒所带电荷有关。多数蛋白质 抗原在碱性缓冲液中带负电荷，在电泳时从 负极向正极移动。抗体属球蛋白，在碱性缓 冲液只带微弱的负电荷，而且相对分子质量 较大，电泳力较小，在琼脂电渗力作用下反 而由正极向负极移动。这样就使抗原和抗体 定向对流，在两孔间相遇时发生反应，并在 比例合适处形成肉眼可见的白色沉淀线。这 种将双向琼脂扩散和电泳技术结合在一起的 方法称为对流免疫电泳 。
间接凝集抑制试验——妊娠试验
【实验原理】 可溶性抗原致敏的乳胶颗粒与相应抗体作用可 使乳胶颗粒凝集，此为间接乳胶凝集试验。若使抗 体先与可溶性抗原作用，再加入该抗原致敏的乳胶 颗粒，则乳胶凝集被抑制，此为间接乳胶凝集抑制 试验。 孕妇尿中绒毛膜促性腺激素（HCG）含量明显增 高。HCG与抗HCG抗体先作用后，再加入HCG致敏的乳 胶颗粒，不出现凝集反应，此为妊娠试验阳性；非 孕妇尿中HCG含量不足以消耗掉抗HCG抗体，抗体与 后加入的HCG致敏乳胶结合呈现凝集现象，则妊娠试 验阴性。
【实验材料】 1．妊娠诊断试剂盒：内含抗血清 （抗HCG）、乳胶抗原（HCG致敏） 各一支 2．待检尿、孕妇尿、正常尿。 3．有格玻片和毛细吸管等。
【实验方法】 1．在玻片的第1、第2和第3格内分别 加1滴正常尿、待检尿及孕妇尿。 2．每格内加入妊娠诊断试剂抗血清1 滴。轻轻摇动1~2 min使其充分混匀。 3．每格加入乳胶抗原1滴，轻轻摇动 玻片3~5 min后观察结果，记录各标本有无 凝集现象。
【实验结果】 台盼蓝染液检查活细胞不着色，死细胞 染成蓝色。计数200个细胞，计算活细胞百分 率，一般活性应在95％以上。
【注意事项】 1．与血液样品接触时应注意安全防护，避免血 源性传染病传染。 2．操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避免损 伤细胞活性及细胞丢失。 3 ． 细 胞 分 层 液 在 室 温 下 应 为 (l.077±0.001) g/L；应避光4 ℃下保存，取出后逐渐升至室温后混 匀，方可使用。使用中应避免细菌污染。 4．稀释血液可降低红细胞的凝集，提高淋巴细 胞收获量，但如果要保留血浆成分作其他实验用时， 则不能稀释血液，以免影响血浆成分。
【实验材料】 1．电泳缓冲液：pH 8.6巴比妥-盐酸缓 冲液。 2．抗体：抗AFP。 3．抗原：AFP阳性血清、待检病人血清。 4．1％琼脂 用pH 8.6巴比妥-盐酸缓冲 液配制，冰箱保存备用。 5．电泳仪、电泳槽、载玻片、打孔 器、10 ml吸管、移液器、移液头。
【实验方法】
Ag Ab Ag Ab
【实验思考】 1．单向扩散与火箭电泳、双向 扩散与对流免疫电流比较各有何特 点？ 2．对流免疫电泳中，抗原为何 放阴极端，抗体为何放阳极端？
外周血单个核细胞的分离
【实验目的】 1．熟悉免疫细胞分离的常用 方法。 2．掌握外周血单个核细胞分 离方法的原理、操作规程。
【实验原理】 人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）包括淋 巴细胞和单核细胞。单个核细胞的体积、 形态和比重与外周血其他细胞不同。因此 利用一种介于1.075～1.090之间而近于等 渗的聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque） 混合分离液作密度梯度离心，离心后不同 比重的血细胞在分离液中呈梯度分布。从 而分离出PBMC。
【概述】 在一定浓度的电解质溶液中，颗粒性抗 原与相应抗体结合后，出现肉眼可见的凝集 块，称为凝集反应。凝集反应是一种定性的 检测方法，也可以进行半定量检测。凝集反 应可分为直接凝集反应和间接凝集反应。由 于凝集反应方法简便，目前在临床检验中仍 被广泛应用。
一、直接凝集反应 细菌、细胞等颗粒性抗原，在适当电解质参与 下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接凝集 反应 。常用的凝集试验有玻片法和试管法两种。 玻片凝集试验——ABO血型鉴定 玻片凝集试验为定性试验，一般用已知抗体作 为诊断血清，与受检颗粒抗原，如菌液或红细胞抗 原各加一滴在玻片上，混匀，数分钟后即可用肉眼 观察凝集结果，出现凝集颗粒的为阳性。此法简便， 快速，适用于从病人标本中分离得到的菌种的诊断 或分型，也可用于红细胞ABO血型的鉴定。
【实验方法】 1．采集静脉血若干毫升（随需要而定）， 注入盛有肝素的无菌小瓶中（每ml全血加0.1 ml 肝素溶液），加盖后立即轻轻摇匀，使血液 抗凝。 2．用吸管加入等体积的室温HBSS或PBS，使 血液等倍稀释。（此步骤亦可省去） 3．吸取淋巴细胞分层液（每10 ml稀释血加 5 m1分层液）置于15 m1或50 m1离心管中，然 后将离心管倾斜45°角，将稀释血液在距分层 液界面上1 cm处沿试管壁缓慢加至分层液上面。 应注意保持两界面清晰，勿使血液混入分层液 内。
【实验思考】 1．记录血型鉴定试验、乳胶妊娠诊断 试验的材料、方法及结果判定（可用图示 或表格方式表示）。 2．直接凝集试验与间接凝集试验有何 不同？ 3．在各凝集试验中都设有相应对照， 有何意义？若对照出现异常如何分析及解 决？
沉 淀 反 应
【实验目的】 1．掌握对流免疫电泳的基本原理、方 法。 2．熟悉琼脂单向扩散，双向扩散的基 本原理、方法、结果分析及临床用途。 3．了解火箭免疫电泳的基本原理、方 法。
【实验结果】
吞噬细菌的中性粒细胞数 吞噬百分率 100 % 观察记录的吞噬细胞总数
被吞噬的细菌总数 吞噬指数 观察记录的吞噬细胞总数
【实验思考】 1、在吞噬细胞中发现细菌时， 如何区别吞噬的细菌和粘附在吞噬 细胞表面的细菌？ 2、简述机体非特异性免疫的概 念及特点。
凝集反应
【实验目的】 1．了解凝集反应的原理、基本类型及其 临床意义。 2．掌握玻片凝集实验、间接凝集实验的 实验方法和结果分析。
标记孔 沉淀线
1．制板 2．打孔 3．加样 将抗原加入琼脂板上有标记孔侧 的小孔中，抗体加入另一侧小孔中，以加满为 度，不可溢出孔外。(如图示) 4．电泳 将加好样品的琼脂板置电泳槽上， 抗原侧置阴极端，抗体孔侧置阳极端。搭好桥 后，接通电源，控制电压6～10 V/cm板长，电 泳约30～60 min。 5．关闭电源，取出琼脂板，观察结果。