生物切片和显微标本制作技术

生物切片和显微标本制作技术

生物切片和显微标本制作技术是组织学、胚胎学、生理学及细胞学等学科研究观察细胞、组织的生理、病理形态变化的一种主要方法。大多数的生物材料，在自然状态下是不适合显微观察的，也无法看到其内部结构。因为材料较厚，光线不易透过，以致不易看清其结构，另外细胞内的各个结构，由于其折射率相差很小，即使光线可透过，也难以辨明。但在经过固定、脱水、透明、包埋等手续后就可把材料切成较薄的片，再用不同的染色方法就可以显示不同细胞组织的形态及其中某些化学成份含量的变化，就可以在显微镜下清楚地看到其中不同的区域组分状态，切片也便于保存，所以是教学和科研中常用的方法。

显微标本制作有许多不同的方法，一般可分为非切片法与切片法两大类：非切片法有涂片、铺片、压片、磨片、整装片等；切片法又包括石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法等。

显微标本制作技术虽是生物学中很基本的操作技术，但由于生物材料的个体差异、化学试剂的多样性，因此操作技术相当细致而复杂，方法也很多，每一步骤的失误都可导致整体的失败，因此需要耐心细致，不断总结经验，才能得到较好的结果。

实验用品

1、器械

电热温箱：体积较小，温度调节一般在60-75℃

显微镜：用于观察染色情况，及检查切片效果

切片机：切片用，通常为了能够得到连续切片，多用转动切片机切片刀：为切片机必备配件

磨刀机：磨刀用

电热温台：为了展平蜡带或烤干制片

天平：配溶液用

玻璃器皿：染色缸、烧杯、量桶、试剂瓶、滴液管等

其它：剪子、镊子、解剖针、毛笔、刀片、小木块等

2、常用试剂

2.1 常用固定剂

包音氏固定液：由苦味酸饱和水溶液75毫升、甲醛（40%）25毫升、冰醋酸5毫升配制。该固定液适用于无脊柱动物，其渗透力强，组织收缩小，不易变形。

海利氏液：由重铬酸钾2.5克、氯化汞6克、蒸馏水100毫升、40%甲醛液5毫升配制。该液适用于骨髓，脾，肝等适血器官的固定。

卡诺固定液：由纯酒精15毫升、冰醋酸5毫升配制。该液渗透迅速，可用作植物组织或细胞的固定，亦适用于动物组织，但不易时间太长，防止组织过度硬化。

约翰森固定液：由福尔马林5毫升、丙酸5毫升、50% 酒精90毫升配制。该液用于固定植物根尖、茎尖，有较好的效果，通常固定24小时，也可做保存液。

2.2 常用脱水剂

酒精、正丁醇、叔丁醇、丙酮等。

2.3 常用透明剂

二甲苯、甲苯、氯仿、丁香油等。

2.4 常用粘贴剂

明胶粘贴剂：明胶1克、蒸馏水100毫升、石炭酸2克、甘油15毫升

蛋白粘贴剂：新鲜蛋白25毫升、甘油25毫升、石炭酸0.5克

2.5 包埋剂

石蜡、火棉胶、明胶等

2.6 封固剂

阿拉伯树胶、加拿大树胶

2.7 常用染剂

代氏染液：苏木精4克、95%酒精25毫升、10%铵明矾水溶液400ml，瓶口用纱布封盖，置向阳处，3-4天后加入甘油100毫升、甲醇100毫升，该液两月后成熟，色彩蓝紫色，时间越长效果越好，为生物制片技术中最常用的核染剂，染色后，一般用0.1% 盐酸水溶液褪去染色，称为分色。

伊红水溶液：0.1-1% 伊红又称曙红，是酸性染料，一般与苏木精共同使用，主要染细胞质、胶原纤维及肌纤维。

番红-固绿对染：固绿染液由0.5%的95%酒精溶液配制，番红染液由1%的50%酒精溶液。制备植物石蜡切片常用固绿--番红对染，结果是木质化的细胞壁及细胞核染成红色，薄而且纤维素的细胞壁和胞质染成绿色。

苏丹ш染液：苏丹ш0.3-0.5克、70%酒精100毫升，此染液主要用于染淀粉粒。

实验步骤

1 、非切片法

即不用切片机，不经切片手续而制成切片的方法，根据材料性质的不同，有不同的处理方法，该类方法操作简单快捷，其中铺片法、封藏法可使原有组织结构不被破坏，涂片法、压片法弥补了用包埋、切片法所不可能观察清楚的不足，因此是显微标本制作的中常用的手段。

1.1 涂片法

主要用于血液、精液、尿液、痰液、微生物等不能切片成薄片的液态颗粒性材料，可在载玻片上涂成单层细胞，再经固定，脱水，染色等手段制成永久标本。

1.2 铺片法

主要用于动、植物组织的表皮层观察，可活体取待观察动、植物组织，用尖镊子撕去一层表皮，迅速平铺在载玻片上。如洋葱表皮细胞的铺片制备。

1.3 压片法

一些较幼嫩，柔软的材料可将其置载玻片上，用小解剖刀将其分散，加染料一滴，再盖上盖玻片，用拇指垂直用力挤压，使组织散成一薄片，再进行观察，如植物根尖观察染色体，花粉粒观察发育阶段等。

1.4 离析法

该方法是利用化学试剂使组织的细胞间质溶解，使细胞能分散成单个个体。经染色、脱水、透明即可观察其个体形态，适用于肌肉、叶片、茎等部位。

1.5 磨片

用于很坚硬的组织，如骨和牙。

2 、切片法

切片法是必须依靠手或切片机将组织切成薄片来进行观察的方法。为了能清晰地观察到动、植物的组织结构及细胞形态，必须先经过一系列步骤将组织内渗入某些支持物质，使组织变硬以利于切成薄片，根据所用支持剂的种类不同，可分为徒手切片法、石蜡切片法、火棉胶切法、冰冻切片法等类型，切成薄片后还需要去蜡，染色、脱水、透明等步骤，将其制成永久标本。

下边以石蜡切片为例，介绍显微标本制作方法。

2.1 取材

根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、干枯。所采集材料应立即放入固定剂，并编号，注明采集时间、地点、名称、组织部位，所取组织块要大小适当，即要能说明问题，又要考虑固定剂的穿透能力。一般组织学取材稍大，细胞学取材稍小，植物组织取材稍小，动物组织取材要稍大。

2.1.1动物的麻醉和杀死

从活的动物体上采取材料不象采集植物材料那么容易，因为在不施加麻醉的情况下，有的动物会收缩（如蚯蚓、水蛭），有的会骚动（如蛙、鼠），使我们无法下手。但制片所需的材料又要求越新鲜越好，尤其是细胞学方面的研究对材料的新鲜程度要求更严。因此，要割取生活着的动物组织，在一般情况下，就要对动物施行麻醉，然后再割取材料加以固定。但是所用的麻醉药品，必须以不影响细胞结构为原则。

若是一般的组织学制片，要求不太严格的话则可将动物先杀死然后速取其组织进行固定。蛙、蟾蜍、鼠等较小的动物，可用断头法杀死，即用普通剪刀剪断颈部。较大的动物，如天竺鼠、免、猫等可用木槌猛击头后部，使其昏倒，或用50毫升的注射器从耳静脉向心脏注入空气，使动物发生急性空气栓塞痉挛而死。

上述动物若需麻醉后取材，则可用脱脂棉球蘸氯仿或乙醚、置于动物的鼻尖部，令其吸入麻醉。大动物（狗、猴等）应用氨基甲酸乙酯作静脉注射麻醉。剂量一般为每千克动物体重用1克。麻醉后的动物也需放血后进行取材固定。

昆虫等小动物可投入充满氯仿或乙醚蒸气的大口瓶中，令其麻醉。若要杀死，可将其投入含氰化钾的毒瓶中。

2.1.2动物组织块的切割