酪氨酸酶催化活性

综合实验辅导教材

酪氨酸酸酶的提取及催化活性的研究

一、实验目的

认识生物体中酶的存在和催化作用，了解从土豆中提取酶的方法和研究酶活性的一般方法，学会用现代分析手段研究催化反应，特别是生物化学体系中催化过程的基本思路和方法。

二、实验原理

许多复杂的有机物合成与分解反应需要在高温、高强酸碱或减压等苛刻条件下才能进行，而在生物体内，即使在十分温和的条件下，如常温、常压和近中性溶液中，许多复杂的化学反应却能顺利进行，其根本原因就是由于生物酶的存在。生物酶是一种生物催化剂，按照它的组成，可分为两类，一类是简单蛋白质，其活性取决于它的结构，如脲酶、淀粉酶等；第二类的结合蛋白质酶，它需要加入某些非蛋白质组分（称为辅助因子）后，才能表现出酶的活性。酶蛋白质与辅助因子结合形成的复合物称为全酶。例如酪氨酸酶是以铜离子为辅助因子的全酶。

通常反被酶作用的物质称为该酶的底物，一种酶催化特定的一个或一类底物的反应，具有很高的选择性和灵敏度，因而引起广大分析工作者的重视和兴趣。酶已作为一种分析试剂得到应用。特别是有生化、医学方面有很高的应用价值。例如生命物质和流体中的特殊有机成分，用其他方法测定有困难，用酶法分析却有其独到之处。

本实验从土豆中提取酪氨酸酶，并测定其催化活性。当土豆、苹果、香焦等的受损面接触空气后会产生深棕色的现象是人们都见过的，这是这类物质含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当暴露在空气中后，在氧气的参与下，会发生一系列反应。以下是主要的反应过程。

由于多巴转变成多巴红的反应速率较快，再转到下一步产物速率则慢得多，故可选择多巴转变为多巴红的反应速率的测定来判断催化反应的活性。因多巴红具有特殊的颜色，故可用分光光度法测定，在不同的时刻测定某特定波长下的吸光度，用吸光度对时间作图，从所得的直线斜率求酶的活性。

酶的活性计算方法：一般定义在优化的条件下（包括pH 值、离子强度、温度等），25℃时在1min 内转化1μmol 底物所需要催化剂的量为活性单位。通过下式可计算酶的活性：6

10⨯∆=

ktV

A a ，式中，

a 为所用溶液的酶的活性，A ∆为最大吸收波长吸光度的变化，t 为时间（min ），k 为多巴

红的摩尔吸收系数，V 为加入酶的体积，进而计算出原料（土豆）中酶的活性：m aV o /A 。式中A 为原料中酶的活性（注意此处A 不是吸光度A ），V 0为原料所得的酶溶液的总体积，m 为原料总质量。

三、所需主要试剂及仪器 1. 试剂及材料

酪胺酸：酪氨酸在中性水溶液中溶解度较小，因而配制过程中需加入一定量盐酸溶解。首先取一定酪氨酸配制0.1mol/L 酪氨酸储备液，在实验过程中稀释至20mmol/L ，使用时需要加入一定量的NaOH 调节其pH 接近中性。

磷酸盐配制的pH=7.2和pH=6.0的缓冲溶液（自己查阅有关手册配制）。

表 磷酸二氢钾－氢氧化钠缓冲液的配制

[10]

X mL0.2mol/L KH 2PO 4＋ y mL0.2mol/LNaOH 加水稀释至20mL

pH x

y 5.8

5

0.372 6.0 5 0.570 6.2 5 0.860 7.0 5 2.963 7.2

5

3.500

土豆：新鲜土豆 2. 仪器

分光光度计、离心机、研钵、食物研磨机、恒温水浴、纱布、计时秒表、冰箱等。 四、实验步骤

1. 酶的提取：取土豆，清洁后切碎，称取10克置于研钵中，加入7.5mL pH=7.2的磷酸缓冲溶液，用力挤压和研碎，用两层纱布滤出提取液，立即高心分离（3000rpm ）5min ，倾出上层清澈保存于冰箱中，提取液为棕色，在放置过程中不断变黑。

2. 多巴红的吸收光谱绘制：取0.4mL 已稀释过的土豆提取液，加2.6mLpH=6.0的缓冲溶液，加入2.0mL 多巴※

溶液，摇匀。反应约数分钟后，于分光光度计上扫描绘制多巴红的吸收光谱图。若在自动扫描分光光度计上，从混合开始，每间隔一分钟，扫描一次，观察吸光度随时间的变化情况。从多巴红的吸收光谱中找出最大吸收波长。（※注：没有多巴试剂，用酪氨酸代替）

3. 酶的活性测量

取2.5mL 酶提取液用pH=7.2的缓冲溶液稀释至10mL 比色管中，摇匀。取0.2-0.4mL(用量根据实际情况决定)，稀释过的提取液于10mL 比色管中，加入2.9mLpH=6.0的缓冲溶液，再加入2mL 酪氨酸溶液，同时开始计时，用分光光度计在480nm 处测定吸光度。开始6min 内每分钟读1个数，以后隔2min 读人个数，直至吸光度变化不大为止。

取0.2mL 、0.3 mL 、0.4 mL 稀释过的提取液重复上述实验，注意总体积为5mL （每次换溶液时只能用少量溶液洗比色皿），以吸光度对时间作图，从直线斜率求出酶的活性。

五、实验结果与讨论

1. 绘制不同酶加入量的动力学曲线：以吸光度为纵坐标，时间为横坐标，可得出在加入酶的作用下，酪氨酸转换的动力学过程，再由直线部分得出转换速率，即可计算酶的活性。

依次得出不同提取液的活性。

(1) 酸度条件试验：取0.40 mL稀释过的提取液，调节溶液至不同的pH值，考察pH对催化活性的影响。

(2) 抑制剂的影响：取0.40 mL稀释过的提取液，加硫代硫酸钠、或EDTA或铜试剂等试剂，考察各试剂对催化活性的抑制作用。同时同批作一个未加抑制剂的作为对照试验。

(3) 温度条件试验：取0.40 mL稀释过的提取液在不同的温度条件下进行操作，考察温度对催化活性的影响。

六、思考题

1.影响酶的活性因素有哪些？

2.提取物放置过程中为什么变黑？

3.加热后酶的活性为什么明显降低？