转基因拟南芥培养

材料：GFP转基因拟南芥种子及幼苗 试剂：MS培养基(wild type) ；
MS卡那抗性培养基(GFP-MAP65)； 75％乙醇； 10％NaClO；
无菌水。

种子消毒及播种实验流程


种子春化（ 加蒸馏水放入4℃冰箱中过夜）； 75％乙醇润洗一遍，再用75％酒精消毒1min （混匀，尽量将液体吸净，动作要快）；
GFP转基因拟南芥的培养 及荧光观察
GFP报告基因
发现： 绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein， GFP） 水母中发现发光蛋白（20世纪60年代）
GFP报告基因
性质： 238氨基酸组成的单链多肽 在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光
有什么用呢?
蛋白质在活细胞中的准确定位及动态变化观 察（分泌蛋白的分选、亚细胞定位）

10％NaClO润洗一遍，再用10％NaClO消毒 10min （混匀，尽量将液体吸净，动作要快）； 无菌水洗五遍，用牙签将种子点在培养基表 面（每皿4-5颗种子 尽量均匀）； 封膜，做好标记，平放于培养架上培养。


注意事项： 严格无菌操作！ 消毒过程动作要快！ 枪头不要重复使用，物品不要拿出超净 台！ 点种时每个位置尽量只点一颗种子！ 操作时尽量避免说话和人员走动！ 注意小组内的配合和小组间的协调！

卡 那 培 养 基 上 筛 选 转 基 因 幼 苗 GFP
生 长 一 个 月 左 右 的 转 基 因 植 株 GFP
体式荧光显微镜观察GFP转基因植株
生 长 两 个 月 左 右 的 转 基 因 植 株 GFP
Confocal荧光显微镜观察GFP-tubulin 在气孔保卫细胞中的定位
材料与试剂

目的基因
目的基因tubulin 拟南芥叶片表皮细胞、保卫细胞中微管骨 架的分布情况 根部细胞
目的基因与载体简介

导入农杆菌自我复制 浸染花粉转入拟南芥
pGMAP65-1::GFP植物表达载 导入成功? 体的构建
KAN 1 EcoRV PstI StuI MAP65-1
pGMAP65-1-GFP 8658bp
NOS GHale Waihona Puke BaiduP
tubulin
转染成功?
35Spromotor
BamHI H3 XbaI

如何判定载体转化成功，植株内是否有目 的基因的表达？ ——载体及植株的筛选
卡那霉素抗性培养基筛选

卡那霉素: 抗生素 影响植物细胞叶绿体和线粒体的蛋白合成, 引起植株黄化死亡.
卡那霉素能对转基因植物进行筛选实质上 是通过卡那霉素抗性基因起作用的。转基 因植物由于含有卡那霉素抗性基因而抑制 了卡那霉素的作用，所以通过卡那霉素,转 化体就很容易从非转化体中筛选出来。