一株纤维素降解菌的筛选与鉴定

关键词 纤维素降解菌；筛选；鉴定；酶活 中图分类号 Q93-331 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）02-0034-02
Screening and Identification of Cellulose Degradation Bacteria LI Yan-hong
（College of Life Science，Southwest University，Chongqing 400715） Abstract 12 cellulose-degrading bacterias were enriched and isolated from the leaves of the humus layer covering the soil and a high-degrading bacteria （ X10 ） was selected from these. The optimal culture conditions of the bacteria were as follows ： took the culture medium containing glucose+micrite cellulose （1∶1）as carbon sources，peptone+beef （1∶1）as nitrogen sources，pH 7.5，under 30 ℃ ，with the culture time was 40 h，the cellulose-degrading enzyme activity was up to 67.44 U.Through its 16s rRNA sequencing，the homology of bacteria and Microbacterium oxydans were 99%.The selection of cellulose-degrading bacteria provided a new source of bacteria for the efficient production of cellulase. Key words cellulose degradation bacteria；screening；identification；enzyme activity
农业基础科学
现代农业科技 2012 年第 2 期
一株纤维素降解菌的筛选与鉴定
李Байду номын сангаас红
（西南大学生命科学学院，重庆 400715）
摘要 从落叶覆盖的腐殖层土壤中富集、分离得到 12 株纤维素降解菌，从中筛选出一株高效降解菌 （X10），研究其最适宜的培养条件 为：配制以葡萄糖+微晶纤维素（1∶1）为碳源、以蛋白胨+牛肉膏（1∶1）为氮源的培养基 ，pH 值 7.5，30 ℃下 培养 40 h，测 得纤 维素 降 解酶 酶活 可达到 67.44 U。通过对其 16s rRNA 测序鉴定，该菌与氧化微杆菌（Microbacterium oxydans）有 99%的同源性。纤维素降解菌的选育可为高效 生产纤维素酶提供新的菌种来源。
纤维素是自然界中储存量最大、分布最广泛的可再生 天 然 碳 水 化 合 物[1]，其 主 要 存 在 于 秸 秆 、木 材 等 高 等 植 物 的 细 胞 壁 中 ，每 年 通 过 光 合 作 用 可 生 产 纤 维 素 逾 10 亿 t[2]。然 而纤维素难以降解，导致其利用具有一定的局限性。目前， 降解纤维素最有效、最经济的方法是生物降解法，即通过细 菌、放线菌以及真菌等生物产生的纤维素酶来催化降解纤 维素。因此，寻找和驯化产生高效纤维素酶的微生物是有效 降解纤维素的前提条件。该研究从土壤中筛选降解纤维素 的菌株，并对其产酶条件进行研究，以为纤维素的降解和合 理利用提供一定的资源。 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 样品 来 源 。样 品 取 自 重 庆 市 缙 云 山 落 叶 覆 盖 的 腐 殖 层土壤。 1.1.2 培 养 基 。LB 培 养 基 、刚 果 红 培 养 基 [3]、羧 甲 基 纤 维 素 培 养 基[4]。 1.2 试验方法 1.2.1 纤维 素 降 解 菌 的 初 筛 和 纯 化 。纤 维 素 降 解 菌 的 初 筛 和 纯 化 按 照 卢 月 霞 等 [5]的 方 法 进 行 。 1.2.2 纤维 素 降 解 菌 的 复 筛 。分 别 将 纯 化 后 的 单 菌 落 点 样 于刚果红培养基中，每个平板点 1 个菌种，且只点 3 个样， 降 解 圈 直 径 （D）与 菌 落 直 径 （d） 比 值 的 大 小 可 以 直 接 反 应 纤 维 素 酶 活 的 相 对 大 小[6]。因 此 ，筛 选 降 解 圈 直 径 与 菌 落 直 径 比 值 最 大 的 菌 落，即 为 纤 维 素 高 效 降 解 菌 ，用 CMC 培 养 基 作斜面培养，4 ℃保存。 1.2.3 16s rRNA 测序。使用小量细菌基因组 DNA 抽提试剂 盒 对 纤 维 素 降解 菌 进 行 基 因 DNA 提 取 ，以 此 为 模 板 ，以 通 用引物 8F 和 1495R 进行 PCR 扩增 16s rRNA。PCR 体系为 ： D.W 14.5μL，Buffer（Mg2+free）2.5 μL，Mg2+1.5 μL，dNTP 2 μL， 上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，模板 2 μL，Taq 酶 2 U。反 应
收稿日期 2011-11-28
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条件 ：95 ℃预 变 性 5 min，94 ℃变 性 1 min，56 ℃退 火 1 min， 72 ℃ 延 伸 1.5 min，35 个 循 环 ， 扩 增 结 束 后 72 ℃ 延 伸 10 min。 扩增后的 PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶电泳 （100 V，30 min）进行分析，将在 1 000～2 000 bp 出现较亮条带的样品送 去宝生物公司进行测序。 1.2.4 纤维素酶酶活的测定。按照李慧 君 等[7]的 方 法 进 行 粗 酶的提取，同时通过 DNS 显色检测酶活，葡萄糖标准曲线的 绘制以及酶活 的 检 测 具 体操 作 参 照 GB 20287-2006[8]。酶 活 力单位（U）：1 mL 原样酶液，1 min 产生 1 μg 葡 萄 糖 定 义为 1 个酶活力单位。 1.2.5 降解菌培养条件的优化 。研究不用培养温度 、pH 值、 碳源、氮源对其产酶的影响，并在各因子最适条件下培养该 菌，检测其产酶酶活。 2 结果与分析 2.1 纤维素降解菌的筛选与纯化