液相色谱使用中样品预处理注意的几个环节

液相色谱使用中样品预处理注意的几个环节高效液相色谱具有分离效率高、分析速度快和应用范围广等特点,特别适合于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分离分析。

目前高效液相色谱已成为化学、生化、医学、工业、农业、环保、商检和法检等学科领域中重要的分离技术,是分析化学家和生物化学家手中用于解决他们面临的各种实际分析和分离课题必不可少的工具之一。

虽然在检测分析中使用了昂贵的、性能优越的高档精密仪器,但是由于在样品的前处理,标准溶液的制备,样品液的测定,分析中的污染,仪器常见故障等等问题上的不注意,而引起大的系统误差,使整个测定分析失败。

现就液相色谱分析的应用中样品预处理注意的几个环节,作简要分析,以达到更好的检测效果。

1 样品预处理方法样品预处理应包括进样前的一切操作。

除了称重、溶解、稀释等步骤外,样品需要: ①过滤; ②萃取; ③衍生化(柱前衍生) ; ④液相色谱(低压柱层析) 。

这些操作可以是手工进行或实行自动化操作。

样品预处理的目的是除去干扰物、增加检测器灵敏度(富集) 、保护色谱柱等。

样品预处理同时也是为了避免色谱分离故障,其中样品萃取是关键的一步,要从大量的干扰物中萃取出微量组分难度极大。

有些样品经预处理后还不能作进样分析,需进行衍生化处理,使一些无紫外吸收或无荧光的组分,经过衍生化后能用紫外和荧光检测器检测,这样既提高了灵敏度,又改善了分离度(质量变化) 。

样品预处理的同时也会带来一些问题,如样品损失、样品被污染、衍生化反映不完全或多种反应物生成等。

衍生反应常会影响试验的精确度,或者在整个样品预处理过程中带来误差。

用于液相色谱分析的样品溶液必须均匀而无颗粒,有颗粒会损坏进样器并阻塞柱头。

处理好的样品在准备上柱前应对准光线摇动,检查样品溶液中有无颗粒。

只要看到颗粒、混浊或乳化,就应过滤一下,过滤膜要能截留住015μm 以上的颗粒,样品过滤的过程中可能引起:样品被污染,因过滤吸附降低样品组分的含量,样品溶剂挥发引起误差。

萃取的目的是从共溶的样品介质中分离出被分析的组分,或者减少损坏柱的物质(如蛋白质等)和干扰物。

一般采用有机溶剂萃取,要求萃取用的溶剂毒性低、挥发性好、杂质少、对待测样品有良好的溶解度且又与水不相混溶。

常用的有乙醚、醋酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、苯或者两种以上的混合溶剂。

萃取后一般可直接进样,有时需要浓缩或吹干浓缩,再用定体积的液体或流动相溶解进样。

这样增加了样品浓度,提高了灵敏度,同时避免了溶剂峰对样品峰的干扰。

在萃取是要考虑样品分子的溶解能力。

除了脂溶性和水溶性组分外,还有用脂溶性的组分制成水溶性的盐。

萃取方法如下:1.1 水溶性样品(1) 酸性组分及生成的盐萃取方法:有机溶剂萃取杂质后调成酸性,再加有机溶剂萃取或进样,或在N2 流下吹干,用适当的溶剂解后进样。

(2) 碱性组分及生成的盐萃取方法:有机溶剂萃取杂质后调成碱性,再加有机溶剂萃取或进样,或在N2 流下吹干,用适当的溶剂溶解后进样。

(3) 中性组分萃取方法:有机溶剂萃取杂质后,直接用反相色谱法分析。

1.2 脂溶性组分萃取方法:有机溶剂萃取或进样,或在N2 流下吹干,用适当的溶剂溶解后进样。

2 分析中的污染一般检测的环境、容器、试剂都是影响测定结果的因素。

2.1 环境污染仪器室的有害气体、气溶液、灰尘等等都能造成污染,影响检测结果,这种污染很难校正。

因此,仪器室与其他实验室应隔离,保持清洁,仪器室内应安装空调,注意防潮、防腐、防震、空气相对湿度应小于70 %为宜。

2.2 容器实验室常用的器皿有玻璃类、瓷类、石英类、塑料类等,在进行分析时,应按照待则样品的要求来选则器皿,不管使用哪种器皿,容器的洗条清洁都是很重要的,也是取得好的检测结果的基本保证。

2.3 试剂在液相色谱分析中,所选用的试剂必须是色谱纯、优级纯或分析纯,如果用含量有杂质的试剂,则会出现杂峰而影响测定结果。

3 标准溶液的配置在配置标准溶液时,先要配置现定浓度的内标溶液,在标准溶液和样品溶液中最好使用同一批次配制的内标溶液以减少误差。

(1) 配制标准溶液的物质应当是色谱纯的、性质稳定。

(2) 常用的标准溶液应存放在棕色溶液瓶中低温保存。

(3) 在配制维生素类标准品时,要放置在棕色容量瓶中或避光放置以免分解。

4 样品预处理过程中的主要故障与解决办法(1) 色谱图中出现无关的峰,原因有可能是样品过滤器带来污染,解决方法如下:①将过滤器浸泡在样品溶剂中并进样试验; ②改变过滤器类型; ③采用交替清洗技术。

(2) 一些或全部化合物的峰比预期的小,尤其是低浓度的样品,原因可能是样品过滤器表面吸附下降,解决方法如下:①改变过滤器类型; ②严格按相同条件处理所用样品; ③采用交替清洗技术。

(3) 回收率太低或差,原因可能是萃取不完全,解决方法如下:①增加萃取时间,使用热溶剂; ②修改清洗方法。

(4) 色谱峰变宽,柱寿命缩短,原因可能是样品带来的干扰与污染,应改进清洗方法。

(5) 精度差,原因可能是回收不完全,解决方法如下:①改进或替换衍生化、分离、萃取或其他条件; ②用自动化处理装置提高精度。

总之,对分析仪器来说,避免故障的最主要的做法是正确的操作和调节,切忌盲目操作,对核心部位如离子室、微电流放大器等减少震动和碰撞,保证绝缘,并减少各种系统误差要注意以上要点,但还要注意日常的仪器保养,色谱柱子的维护,仪器室保持清洁,这样才能使液相色谱处于最佳工作状态,在分析中发挥其重要的作用。

液相色谱流动相的性质要求一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。

选好填料（固定相）后，强溶剂使溶质在填料表面的吸附减少，相应的容量因子k降低；而较弱的溶剂使溶质在填料表面吸附增加，相应的容量因子k升高。

因此，k值是流动相组成的函数。

塔板数N一般与流动相的粘度成反比。

所以选择流动相时应考虑以下几个方面：①流动相应不改变填料的任何性质。

低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。

碱性流动相不能用于硅胶柱系统。

酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。

②纯度。

色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。

③必须与检测器匹配。

使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。

当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。

④粘度要低（应<2cp）。

高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。

最好选择沸点在100℃以下的流动相。

⑤对样品的溶解度要适宜。

如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。

⑥样品易于回收。

应选用挥发性溶剂。

高效液相色谱柱的使用与维护高效液相色谱(HPLC)是20世纪60年代后期发展起来的分离分析技术，是现代分离测定的重要手段。

问世以来，因其具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度好、能分析高沸点但不能气化的热不稳定生理活性物质的特点而被广泛应用于生物化学、药物及临床分析。

高效液相色谱是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂，缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入待测样品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后依次进入检测器，色谱信号由记录仪、积分仪或色谱工作站记录。

色谱柱是高效液相色谱的心脏，在高效液相色谱仪的使用中，保持色谱柱的柱效、容量和渗透粉性，延长柱子的使用寿命非常重要。

因此对高效液相色谱柱的维护是关键。

1 色谱柱的构造色谱柱由柱管、压帽、卡套(密封环)、筛板(滤片)、接头、螺丝等组成。

柱管多用不锈钢制成，压力不高于70㎏/㎝2时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。

为提高柱效，减小管壁效应，不锈钢柱内壁多经过抛光。

还有使用熔融硅或玻璃衬里的，用于细管柱。

色谱柱两端的柱接头内装有筛板，是烧结不锈钢或钦合金，孔径0.2-20 μm(5-10μm)，取决于填料粒度，目的是防止填料漏出。

色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类，尺寸规格也不同:(I)常规分析柱(常量柱)，内径2-5mm(常用4.6mm，国内有4mm和5mm )，柱长10-30cm ;(2)窄径柱，又称细管径柱、半微柱，内径1 -2mm ,柱长10-20cm;(3)毛细管柱(又称微柱)，内径0.2-0.5mm;(4)半制备柱，内径>5mm;(5)实验室制备柱，内径20-40rnm，柱长10-30cm;(6)生产制备柱内径可达几十厘米。

柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应。

2色谱柱的使用和维护在日常分离分析工作中，色谱柱的正确使用和维护十分重要，色谱柱使用是否得当，直接影响色谱柱的寿命，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。

在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。

(1)柱子在装卸、更换时，动作要轻，接头拧紧要适度。

必须防止较强的机械振动，以免柱床产生空隙。

(2)如果仪器用来做常规分析，样品种类有限，但分析次数多，则不妨为每一类常规分析配置一根专用柱，这样有助于延长柱子的寿命。

(3)避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。

温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况;柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。

(4)应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。

(5)如使用柱温控制装置时，应注意在通人流动相后才能升温。

(6)一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。

否则反冲会迅速降低柱效。

(7)选择使用适宜的流动相，以避免固定相被破坏。

有时可以在进样器前面连接一个预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。

液相色谱柱再生1、色谱柱的使用说明：（1）色谱柱使用前注意事项：色谱柱的储存液无特殊说明，均为评价报告所示的流动相。

在使用前，一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。

在反相色谱中，如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，应先用10％左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出，堵塞色谱柱。

（2）流动相：流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯，配流动相的水最好是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。

如果将所配得流动相再经过0.45μm 的滤膜过滤一次则更好，尤其是含盐的流动相。

另外，装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。

以常规硅胶为基质的键合相填料通常的PH值适用范围是2.0-8.0，BDS C18适合于碱性化合物，PH值适用范围为2.0-10.0。