诊断酶学

三、连续监测法测定酶活性浓度 (一) 连续监测法的种类
1．直接法：在不终止酶促反应下，直接测定
反应体系中底物或产物理化特性的变化如吸 光度、荧光、旋光性、pH等，计算酶活性浓 度。 分光光度法应用最广泛，最成熟的一种
2．间接法： 1）在原来反应体系中加入一些试剂，只和 酶反应物迅速作用，产生可被仪器检出的物 质变化，但同时不和酶作用，也不影响酶活 性。例：是血清ChE的丁酰硫代胆碱测定法。 2）酶偶联法：应用最多，最广泛的，即 在原反应体系中加入另一些酶试剂，所进行 的酶促反应和被测酶反应偶联起来。
酶促反应动力学
酶促反应的影响因素及反应条件的选择
(一)酶浓度 病理情况下，酶浓度过高时，底物过早且过多 被消耗，影响酶活性测定。
(二) 底物的种类和浓度
研究酶的生理作用时，一般选择Km最小的最 适底物。 临床酶学测定时，先考虑有较高诊断价值的 底物。 一般酶测定时底物浓度最好为Km的10－20倍。
(二)酶偶联反应
最简单 (单底物反应只有一个工具酶)模式
为：
被测定酶(Ex)催化的反应称始发反应；产
生被检测物质产物C(如NADH)的反应称为指示
反应，相应的偶联酶(第二个酶)酶称指示酶 (Ei)。
(三)干扰因素
1．其他酶和物质的干扰： 2．酶的污染：因试剂用酶多从动物组织或细 菌Biblioteka 提取，易污染其他酶，如不除去将引起
重症肝炎（大量肝细胞坏死）血中ALT仅轻 度增高，临终时明显下降，但胆红素进行性升 高，即 “胆酶分离”。
非血浆特异酶，只要有少量细胞受损伤，
酶从细胞中释出，血液中酶明显升高。
2．酶的相对分子量：
各种酶从胞内释出的速度与酶的相对分 子量成反比。 3．酶的组织分布： 如临床常用的AST、ALT和CK三种酶分别
以心、肝和骨骼肌含量最丰富。
含酶量高且血流丰富的组织器官，病变时可
引起血清酶活性变化。
4．酶在细胞内的定位和存在形式：
定量测定。
间接法：将样品中无放射性的酶蛋白与放射
性标记的标准酶共同对有限量的抗体进行竞
争，根据其竞争程度来定量样品中的酶蛋白
量。
两种表示结果：
1）用酶活性浓度单位：U／L；
2）用质量浓度单位，：直接用ng／ml或pg／L报告。 临床医生应注意报告方式不同所带来的差异。
(二) 免疫化学测定的优缺点
2）测定酶的总活性和各同工酶或亚型组分的
活性。
电泳法注意事项： 用电泳法进行同工酶分析时，如显示的区带数与同 工酶数不一致时，要注意巨分子酶的存在。
原因主要有：
① 酶与免疫球蛋白形成的复合物； ② 酶与其他蛋白质形成的复合物； ③ 酶亚基或酶分子之间形成的聚合物，如CK-Mt聚合 物、LD亚基自身聚合等。
2．合成增多：
增生性疾病，如骨骼疾病时，因成骨细胞增
生，合成分泌更多的ALP。
恶性肿瘤，肿瘤细胞中酶的合成增加，如前 列腺癌细胞产生大量ACP。 酶的诱导作用，如巴比妥类、乙醇药物可诱 导肝γ-GT的合成，血清中的酶活性随之增 高。
(二) 酶释放增加
细胞酶的释放的影响因素： 1．细胞内外酶浓度的差异： 如肝细胞内LD大于细胞外液的3000倍以 上，红细胞中此酶亦大于血浆的200倍。
如临床症状不明显，血清酶活性不正常但临床表 现不典型，同工酶图谱异常时要警惕血清中有无巨分 子酶。
色谱法 常用柱色谱，方法费时繁琐，不适合临床同工酶常规 检测。 免疫分析法 同工酶的免疫化学性质也不同。 利用纯化的同工酶免疫动物制备特异性的抗血清。
抗原决定簇不同的同工酶可用特异的免疫反应来识别。
应用较多的免疫分析法有免疫抑制法、免疫沉淀法等。
一、概 述
正常人血中大部分酶一般在pg到ng水平。 常用的酶学测定方法： “酶活性浓度”。 按监测方法分类分为：量气法、分光光度法、 荧光法和放射性核素法、电极法和其他方法。 以分光光度法最为常用。
分光光度法：
50年代起采用
最大优点：扩大了测定范围，波长范围更宽。
结合工具酶的偶联反应，应用NAD(P)H和NAD(P)＋吸
许多因素可引起人血清中某些酶浓度的生理性变化。 如性别、年龄、饮食、锻炼或日周期节律、人 种、地理及其他环境因素等。 应注意生理差异对测定结果的影响。
1、性别：无差异，少数酶如CK、GGT，男>女。
2、年龄：血清中有些酶的活性常随年龄而变化。 例：CK、LD；年龄引起酶变化最明显的酶是ALP。 3、进食：不受饮食影响，故不必空腹采血。 高脂、高糖饮食后血清ALP活性升高。
测定误差。
3．非酶反应： 4．分析容器的污染： 5．沉淀形成：
四、工具酶
在酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓度或酶活 性浓度的酶。 常使用酶偶联体系测定，指示酶和辅助酶作为反应 系统中的试剂。 (一)常用工具酶及其质量要求 常用工具酶多为氧化还原酶类 工具酶纯度不必求过高，才能降低作为试剂的成本。 但减少或避免干扰测定的副反应。
① 外分泌酶：来源于消化腺或其他外分泌腺的酶。
如胰淀粉酶、胰蛋白酶和前列腺酸性磷酸酶等。
在血液中含量与相应的分泌腺的功能及疾病有关。
② 细胞酶：存在于各组织细胞中进行代谢的酶类。
随着细胞的新陈代谢，有少量酶释入血液。
只有小部分来源于特定组织，有器官专一性。
二、血清酶的去路
1．血清酶的半寿期：酶失活至原来活性一半 时所需时间称为酶的半寿期(T1／2)。 代表酶从血中清除的快慢。
缺点：无法知道整个酶促反应中是否都是零级反 应。
2．连续监测法：
连续测定酶反应过程中某一反应产物或底 物的浓度随时间变化的多点数据，求出酶反 应初速度，间接计算酶活性浓度。 优点：方法简单，可将多点的测定结果连接 成线，容易找到成直线的区段，观察到是否 偏离零级反应，因而可选择线性反应期来计 算酶活性，不需终止反应。
同工酶及其亚型测定
一、概
念
同工酶：催化功能相同而结构不同的一类酶。
同工酶是同一种属中由不同基因或等位基因所 编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体。
“亚型”，也称为同工型:某些酶或同工酶从 组织进入体液后，进一步变化为数个不同类型。
由于翻译后修饰的差异所形成的多种形 式的一类酶。
二、分析方法
临床同工酶的分析: 1）分离出某酶的各同工酶组分；
收光谱差异建立的测定各种脱氢酶活性浓度的方法，
可应用于各种血清酶活性的测定。
自动生物化学仪和配套用试剂盒。
荧光法和放射性核素法：
荧光法或放射性核素法灵敏度较高，适用酶
浓度很低的标本。
通过荧光光度计测定，根据荧光强弱的变化
换算出酶的活性。
例：还原型的NAD(P)H有强烈的荧光， 所有以NAD(P)＋为辅酶的氧化还原酶类均可用 荧光法进行测定。
测定酶活性推荐3种温度；如250C，30℃和37℃。 我国推荐温度为37℃。 酶制剂应保存在冰箱中，取出后应恢复至室温 立即应用，以免发生变性。
(五) 激活剂与抑制剂
临床酶学测定中广泛应用金属离子等激活剂
来提高测定的灵敏度。
在设计和选择酶测定方法时，应避免抑制剂 对酶促反应的影响。 如脲酶测定，先通过透析、凝胶色谱或 超滤等方法将尿中一些小分子抑制剂与酶分 开。
(2) 肌酶谱：用于对骨骼肌疾病的诊断和监护。可供
选择的酶有CK、LD、AST及其各自同工酶。若能再加
CK-MM亚型则更为理想。
(3)肝酶谱：用来判断有无肝实质细胞损伤、肝内外
胆汁淤积等肝胆疾病。
（4）肿瘤酶谱：具有器官特异性的有ACP及其同工酶、 ALP及其同工酶、γ-GT及其同工酶、AFU、AMY及其同
(二)工具酶参与的指示反应
最常用两类分光光度法：
1）利用较高特异性的氧化酶产生过氧化氢
(H202)，再加氧化发色剂比色；
2）利用氧化-还原酶反应使其连接到NAD(P)
－NAD(P)H的正／逆反应后，直接通过分光光 度法或其他方法测定NAD(P)H的变化量。
六、酶活性浓度的单位
(一)酶活性单位
惯用单位，国际单位， Katal单位
工酶、LPS等；非器官特异性的有ALT、CK同工酶、
ALD同工酶、LD同工酶等。
（5）胰酶谱：主要用于急性胰腺炎的诊断和鉴别诊断。 有AMY及其同工酶等。
一、转氨酶(ALT，AST)及其同工酶
AST同工酶：细胞质(ASTs)、线粒体(ASTm)； ALT同工酶：细胞质(ALTs)、线粒体(ALTm)； 组织分布： AST含量：心 > 肝 > 骨骼肌 > 肾。
二、酶活性浓度的测定
按反应时间将酶活性浓度测定方法进行分类，可分 为：定时法、连续监测法。
1．定时法：
早期测定酶活性浓度的方法
测定一段这段时间内底物的减少量或产物的生成
量，计算酶促反应平均速度。
优点：比较简单，因测定时酶促反应已终止，故
比色计或分光光度计无需保温设备，显色剂的选择
也不考虑对酶活性的影响。
血 清 酶
一、血清酶的来源
1、血浆特异酶：作为血浆蛋白的固有成分，
在血浆中发挥特定的催化作用的酶。
如与凝血、纤溶有关的酶等。以酶原形式分 泌入血。 多数在肝脏合成，肝功能减退时，血浆中这 些酶活性降低。 另外：ChE、铜氧化酶(铜蓝蛋白)、卵磷脂胆 固醇酰基转移酶(LCAT)和脂蛋白酯酶等。
2、非血浆特异酶：
2．血清酶的失活和排泄：
酶主要是在血管内失活或分解的。
三、血清酶变化的病理机制 (一) 酶合成异常
1．合成减少：
肝损害时，如：血清中ChE常和清蛋白的浓度相平行;
肝病时因LCAT合成的减少而使血清中该酶浓度降低，
并且比血清清蛋白的减少更为灵敏。
酶基因变异，如肝豆状核变性患者，血中铜氧化酶
可明显下降。
临床常用血清酶、同工酶