过氧化氢酶米氏常数的测定
生化分析实验1：米氏常数的测定
双倒数法测定过氧化物酶的米氏常数化学化工学院应化专业________班 姓名_______________ 合作者___________________________________________________ 教师评定___________【实验目的】以过氧化物酶为例，掌握测定酶促反应初速率和米氏常数的原理及方法【实验原理】1913年，Michaelis 和Menten 运用酶反应过程中形成中间络合物的原理，首先提出了底物浓度和酶促反应速率的关系式，即著名的米氏方程：[][]S K S V v m max +⋅= 式中：v 为反应初速率（微摩尔浓度变化/min ）；V max 为最大反应速率（微摩尔浓度变化/min ）；[S ]为底物浓度（mol/L ）；K m 为米氏常数（mol/L ）。
这个方程式表明当已知K m 及V max 时，酶反应速率与底物浓度之间的定量关系。
K m 值等于酶促反应速率达到最大反应速率一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。
不同酶的K m 值不同，同一种酶与不同底物反应K m 值也不同，K m 值可以近似的反应酶与底物的亲和力大小：K m 越大表明亲和力越小；K m 越小表明亲和力越大。
大多数纯酶的K m 值在0.01~100 mmol/L 。
通过米氏方程的不同变形，可有多种求算米氏常数的方法，一般较常用的双倒数法，即取米氏方程的倒数式：[]max max m V 1S 1V K v 1+⋅=以v 1对[]S 1作图得一直线，该直线与横轴截距[]m K 1S 1=-。
过氧化物酶是一种对氢受体（H 2O 2） 底物有特异性，对氢供体底物缺乏特异性的酶，它可催化过氧化氢氧化许多多元酚或多元胺类底物发生显色、荧光或化学发光反应，可用于微量过氧化氢含量测定，也可以和其它酶反应系统偶联可用于测定许多与生命相关的物质：如葡萄糖、半乳糖、氨基酸、尿酸及胆甾醇等，亦是免疫分子和核酸分析中常用的标记物。
过氧化氢酶米氏常数
过氧化氢酶米氏常数篇一：过氧化氢酶动力学常数测定实验项目2：过氧化氢酶活性和动力学常数的测定姓名：赵家熙指导教师：谭志文实验室：6503组员：①章恒炯②③成绩：第三部分：实验记录与分析一、酶活力测定（一）原始数据1.样品原始质量：5.032g2校准数据：（1）kmno4质量数及配制：158（2）na2c2o4质量数：134（3）标定数据：0.02mol/l（4）高锰酸钾的实际浓度：0.019mol/l3样品滴定数据消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）0.65实验（2）0.50对照（1）1.45对照（2）1.30（二）结果计算1.换算系数（mgh2o2相当于1mlkmno4溶液的量）1.72.样品酶活性的计算（每克鲜重样品1min内分解的H2O2 mg，以mgh2o2/g？Min表示）(a?b)?vt?1.7fw?v1?t酶活(mgh2o2/gmin)=酶活性（mgh2o2/gmin）=0.218（a-b）=0.8vt=20.25fw=5.032v1=2.5mlt=10min二、动力学常数的测定（I）原始数据（二）求出各管反应前的底物浓度[s]0和反应速度v0（三）以1/v0对1/[s]0作图（用excel作图）1/s1/v200111.1149.280.6121.979.3八千零四十五点一4021.2（四）计算km（mol/L）和Vmax（mmol/min）km11??vv[s]v如（三）中图麦克斯y=0.5572x+1.5829x=0时y=1/vmax当y=0时，x=-1/kmkm=0.35vmax=0.63第四部分：课后讨论问题1.总结本实验操作过程的注意事项。
1酶的提取和储存一般在0-4℃进行。
2每个三角瓶内的酶促反应时间要精确控制在5min。
3各反应瓶的滴定终点微红色为同一标准。
4使用前，应检查滴定管是否泄漏，并在滴定过程中逐滴添加滴定管。
2.影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些?1.温度过高或过低都会降低过氧化氢酶的活性。
过氧化氢酶km值的测定实验报告
过氧化氢酶km值的测定实验报告过氧化氢酶（catalase）是一种重要的酶类，在生物体内起着重要的氧化还原作用。
本实验旨在通过测定过氧化氢酶的Km值，来研究该酶对底物浓度的敏感程度，从而深入了解过氧化氢酶的催化特性。
首先，我们需要准备实验所需的材料和试剂，包括过氧化氢酶样品、过氧化氢底物溶液、缓冲液、吸光度计等。
接着，按照实验方案，我们将过氧化氢底物溶液分别配制成不同的浓度，然后将不同浓度的底物溶液与过氧化氢酶样品混合，反应一定时间后，利用吸光度计测定反应体系中过氧化氢的浓度。
通过对不同浓度底物下反应体系中过氧化氢浓度的测定，我们可以得到不同底物浓度下过氧化氢酶催化反应的速率。
在实验过程中，我们需要注意保持反应体系的温度稳定，避免温度对反应速率的影响。
此外，为了减小误差，我们需要进行多次重复实验，取平均值作为最终结果。
在实验结束后，我们将利用实验数据，通过线性回归分析，计算出过氧化氢酶的Km值。
通过本实验，我们可以得到不同底物浓度下过氧化氢酶的催化速率，进而绘制出酶的底物浓度与催化速率的曲线。
通过分析曲线斜率的变化，我们可以得到过氧化氢酶的Km值。
Km值表示酶与底物结合的紧密程度，Km值越小，表示酶对底物的亲和力越大，反之亦然。
在实验结果分析中，我们可以得出不同底物浓度下过氧化氢酶的Km值，从而揭示了过氧化氢酶对底物浓度的敏感程度。
这有助于我们更深入地了解过氧化氢酶的催化特性和底物结合机制。
同时，对于医学和生物工程领域，对过氧化氢酶的Km值的准确测定也具有重要的应用意义。
综上所述，通过本实验的Km值测定，我们可以更深入地了解过氧化氢酶的催化特性和底物结合机制，为相关领域的研究和应用提供重要的参考依据。
希望本实验能为相关领域的研究工作提供一定的帮助和启发。
实验六__过氧化氢酶米氏常数(Km)的
3．反应速度的测定：取干燥洁净 ．反应速度的测定： 50ml锥形瓶 只，编号，按下表 锥形瓶5只 编号， 锥形瓶 操作。 操作。
加入物(ml) 加入物 H2O2(约 约 0.05mol/L) 蒸馏水 血液稀释液
1 0.5 4.0 0.5
2
3
4 3.5 1.0 0.5
5 4.5 — 0.5
1.5 2.5 3.0 2.0 0.5 0.5
37度保温 分钟 度保温5分钟 度保温 25％硫酸 ％ 0.004高锰酸钾 高锰酸钾 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
依次加入1： 稀释血液每瓶0.5ml， 依次加入 ：1500稀释血液每瓶 稀释血液每瓶 ， 边加边摇，反应时间5min，按顺序向各 边加边摇，反应时间 ，按顺序向各 瓶加25%H2SO4 2.0ml，边加边摇，使 瓶加 ，边加边摇， 酶促反应立即终止。 酶促反应立即终止。 最后用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶至 最后用 微红色，记录KMnO4消耗量 消耗量(ml)。 微红色，记录 。
1 0.50
2 1.00 0.08 0.02 3.70 0.037
3 1.50 0.12 0.03 6.40 0.064
4 2.00 0.16 0.04 9.80 0.098
5 2.50 0.20 0.05 13.20 0.132
①×0.08 0.04 ②加人H2O2mmol=①× 加人 ①× ③底物浓度［S］=②÷5 底物浓度［ ］ ② ④酶作用后，KMnO4滴定 酶作用后， ml ⑤剩余H2O2mmol=④ 剩余 ④ ×0.004×5/2 × ⑥反应速度V=②一⑤ 反应速度 ② 0.01 1.35 0.0135
四、操作步骤
l．血液稀释 吸取新鲜（或肝素抗凝）血液 ． 吸取新鲜（或肝素抗凝） 0.1ml，用磷酸盐缓冲液 ，用磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.2mol/L)稀 ， 稀 释至150ml，得1：1500稀释血液。 稀释血液。 释至 ， ： 稀释血液 2．H2O2浓度的标定：取洁净锥形瓶两只， 浓度的标定：取洁净锥形瓶两只， ． 各加浓度约为0.05mol/L的H2O2 2.0ml和 和 各加浓度约为 的 25%H2SO4 2.0ml，分别用 ，分别用0.004mol/L KMnO4 滴定至微红色。从滴定用去KMnO4ml数，求 滴定至微红色。从滴定用去 数 浓度。 出H2O2的mol浓度。 浓度
过氧化氢酶米氏常数
过氧化氢酶米氏常数各位读友大家好，此文档由网络收集而来，欢迎您下载，谢谢篇一：过氧化氢酶动力学常数测定实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定姓名：赵家熙指导教师：谭志文实验室：6503 组员：①章恒炯②③成绩：第三部分：实验记录与分析一、酶活力测定（一）原始数据1.样品原始质量：2.标定数据：（1）KMnO4质量数及配制：158 （2）Na2C2O4质量数：134 （3）标定数据：/L（4）KMnO4实际浓度：/L3.样品滴定数据消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）实验（2）对照（1）对照（2）（二）结果计算1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2O2）2.样品酶活计算（每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：mg H2O2/g?min）(A?B)?VT??V1?t酶活(mgH2O2/g·min)=酶活(mgH2O2/g·min)=（A-B）= VT====10min二、动力学常数的测定（一）原始数据（二）求出各管反应前的底物浓度[S]0和反应速度V0（三）以1/V0对1/[S]0作图（用excel 作图）1/s 1/v2008040（四）求出Km（mol/L）和Vmax （mmol/min）Km11?? vv[S]v如（三）中图maxmaxy=+ x=0时y=1/Vmaxy=0时x=-1/KmKm= Vmax=第四部分：课后研讨题1.总结本实验操作过程的注意事项。
1酶的提取和存放一般在0-4℃下进行。
2每个三角瓶内的酶促反应时间要精确控制在5min。
3各反应瓶的滴定终点微红色为同一标准。
4使用前应检查滴定管是否渗漏，滴定过程中应该保证逐滴加入。
2.影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些?1、温度，温度过高或者过低会降低过氧化氢酶的活性。
2、酸碱度，酸或碱浓度太高会使过氧化氢酶失活。
3.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?R(Fe2+)+H2O2 = R(Fe3++OH－) R(Fe3+OH－)2+H2O2 = R(Fe2+)2+2H2O+O24.在反应速度的测定中，加入硫酸有哪些作用？终止反应,为下一步的滴定提供酸的环境。
《酶工程实验》word版
实验一过氧化氢酶米氏常数的测定一、目的了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。
二、实验原理H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。
本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km三、实验器材1.锥形瓶100～150ml（×6）。
2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。
3.温度计（0～100℃）。
4.微量滴定管5ml（×1）。
5.容量瓶1000ml（×1）。
四、实验试剂1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0）取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。
2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。
3、0.02mol/L KMnO4：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存。
4、0.004mol/L KMnO4：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。
5、0.05 mol/L H2O2：取30% H2O223ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H2SO42.0ml，用0.004mol/LKMnO4滴定至微红色）。
6、25% H2SO4五、操作取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：表一过氧化氢酶米氏常数的测定管号试剂0123450.05mol/L H2O2/ml蒸馏水/ml酶液/ml9.50.51.008.500.51.258.250.51.677.830.52.57.00.55.004.500.5先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。
10 过氧化氢酶米氏常数的测定
本实验以鼠肝匀浆中的过氧化氢酶为例，测定其 Km值和Vm值。
过氧化氢酶
2H2O2
2H2O + O2
2KMnO4 + 5H2O2 + 3H2SO4
2MnSO4 + K2SO4 + 5O2↑ + 8H2O
过氧化氢酶催化H2O2分解成H2O和O2； 反应后剩余的H2O2用KMnO4在酸性溶液中滴定；
通过滴定KMnO4的消耗量求出反应前后H2O2的浓度差 即为反应速度v；
试剂 (ml)
0.04mol/L H2O2 H2O
肝匀浆液1:500
10％H2SO4
记录0.02mol/L KMnO4用量 底物浓度[S] (mmol/L) 反应速度v (mmol/10min) [S]/v (10min/L)
1号瓶 2号瓶 3号瓶 4号瓶 5号瓶
25
20
15
10
5
0
5
10
15
20
放入37℃水浴5分钟
v
Vmax[S] =K─m─+─[S─]
Vmax：最大反应速度 Km：米氏常数
初速率 v
80 Vm
60
Vm 40 2
动力学曲线
20
K
m
0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
底物浓度 [S]
Km值：可通过对米氏方 程 作 图 (V~[S] 图 ) 求 出 。 在数值上等于酶促反应 速度为最大速度一半时 的底物浓度值。单位是 mol/L(或mmol/L)。
0.01
0.015
0.0218 0.025
0.02 v/[S] (L/10min)
14
*Excel直线作图
食品酶学
第一部分 实验一、 原理1、过氧化氢酶米氏常数的测定：H 2O 2被过氧化氢酶分解出H 2O 和O 2，未分解的H 2O 2用KMnO 4在酸性环境中滴定，根据反映前后H 2O 2的浓度差可以求出反应速度。
本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km2、黄素蛋白酶的定性试验：黄素蛋白酶是以黄素核莓酸（FMN 或FDA ）为辅基的脱氢酶类。
某些黄素蛋白酶还含有铁、铜或钼类金属离子。
分子中核黄素部分能与氢原子可逆地结合，从而引起递氢作用。
N N C NH CN O O CH 2(CHOH)3CH 2OH H 3C H 3C N H N CNH C H N O O CH 2(CHOH)3CH 2OH H 3C H 3C +2H -2H这类脱氢酶可以催化脱去底物分子中的氢氧或从还原态辅酶Ⅱ（NADH,H+及NADPH ，H+）上把氢传给氧。
在无氧条件下，可用甲烯蓝代替氧。
例如牛乳中的黄嘌呤氧化酶就是黄素蛋白酶的一种。
它能催化水合甲醛把氢交给甲烯蓝3、酵母蔗糖酶的部分纯化与酶活测定：酵母中含有丰富的蔗糖酶（EC3.2.1.26），本实验以酵母为原料，首先通过研磨法以及温度差破碎法破碎细胞的方式得到粗酶，之后先通过调节pH 到5.0杂蛋白的等电点，不影响酶活的情况下，使其凝聚沉淀，最后保温至最适温度反应后，通过测定没催化产物量来间接测定酶活。
细胞破碎方法有机械破碎法（通过机械运动所产生的剪切力的作用使细胞破碎的方法），物理破碎法（通过压力、温度、声波等各种物理因素的作用使组织细胞破碎的方法，常用的有温度差破碎法、压力差破碎法和超声波破碎法）和化学破碎法（通过各种化学试剂对细胞膜的作用使细胞破碎的方法）。
研磨法是利用研体、石磨、细菌磨、球磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎，必要时可以加入精制石英砂、小玻璃球、玻璃粉、氧化铝等作为助磨剂，以提高研磨效果。
研磨法设备简单、可以采用人工研磨液可以采用电动研磨。
实验二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定
1 0.50
2 0.67 8.83
编号 3 0.83 8.67
4 1.25 8.25
5 2.50 7.00
各瓶分别加好H2O2和蒸馏水后，再依次加入酶液 0.5mL，混匀，记录各瓶起始反应的时间。30℃反应 5min后立即加入10% H2SO4 5.0mL终止反应。
2.滴定
用0.02mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色， 记录消耗的KMnO4溶液毫升数。 分别求出各瓶反应前后的底物浓度[S]0、[S]1，并计算反 应速度v： [S]0为反应前的底物浓度（mol/L） [S]0=C1V1/10 [S]1为反应后的底物浓度（mol/L） [S]1=2.5C2V2/10 C1为H2O2的浓度（mol/L） v=(C1V1-2.5C2V2)/5 C 为KMnO 用液的浓度（mol/L）
结果记录 与计算
高锰酸钾溶液标定
取5mL 0.1mol/L的草酸和3mL 10% H2SO4溶液于锥形瓶中， 加热至（75～85）℃（见冒热气），趁热用KMnO4标准溶液 滴定，刚开始反应较慢，滴入一滴KMnO4标准溶液摇动，待 溶液褪色，再加第二滴KMnO4（此时生成的Mn2+起催化作 用）。随着反应速度的加快，滴定速度也可逐渐加快，但 滴定中始终不能过快，，不断摇动或搅拌。滴定至溶液呈 现微红色并持续半分钟不褪色即为终点。
与反应速度的关系
v为反应速度 [S]为底物浓度 vmax为最大反应速度 Km为米氏常数
米氏常数Km
Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。 在酶学分析中， Km是酶的一个基本特征常数，它包含 着酶与底物结合和解离的性质。
Km表示酶和底物之间的亲和能力， Km值越大，亲和能 力越弱，反之亦然。
过氧化氢酶的活力和动力学常数测定 - 生化实验技术
计算公式：标定的 KMnO4 C=0.2/V mol/L
（4）0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大约等于 17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至 1000ml，用标准0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条 件下）进行标定；
（3）0.02mol/L高锰酸钾标准液配制：称取 KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水 配制成1000mL ，临用前用草酸钠标定。
高锰酸钾溶液标定：
取5mL0.1mol/L的草酸和3mL10% H2SO4溶液于锥形瓶中， 加热至（75～85）℃（见冒热气），趁热用KMnO4标准溶 液滴定，刚开始反应较慢，滴入一滴KMnO4标准溶液摇动， 待溶液褪色，再加第二滴KMnO4（此时生成的Mn2+起催化作 用）。随着反应速度的加快，滴定速度也可逐渐加快，但 滴定中始终不能过快，，不断摇动或搅拌。滴定至溶液呈 现微红色并持续半分钟不褪色即为终点。
R(Fe2+)+H2O2 = R(Fe3++OH－) R(Fe3+OH－)2+H2O2 = R(Fe2+)2+2H2O+O2 总反应式：2 H2O2 过氧化氢酶 2H2O+O2
据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定 该酶活力大小。
在反应系统中加入过量的H2O2溶液，经酶促反 应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴 定多余的H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。
实验二、过氧化氢酶的 活力和动力学常数测定
——高锰酸钾滴定法
实验二 过氧化氢酶km值的测定
实验二过氧化氢酶km值的测定
过氧化氢酶（H2O2）是一种经典的多功能过氧化物。
它可以在氧化还原或化学反应中发挥作用。
因此，它在生物氧化解氧化反应中非常重要。
H2O2可以与其他过氧化物，包括氧原子和自由基，反应形成复杂的反应物组合。
这些反应控制着氧化脱氢反应，而过氧化氢酶（Km）是这种反应序列的关键步骤。
Km是H2O2和其他过氧化物之间氧化脱氢反应的活性位置，它表示H2O2在氧化脱氢反应中显示出其最大活性的浓度。
它是生物体氧化脱氢反应进行的重要指标，可以帮助我们了解这种反应的效率和机理。
测定Km值可以看出这个过程的氧化-脱氢速率，从而优化氧化脱氢反应的效率。
Km值的测定大致可以分为三个部分：进行反应的准备工作、进行该反应的实验操作和数据处理。
首先，用实验室内的设备准备反应液，其中应包括酶溶液、过氧化氢和反应基质。
其次，把反应液倒入试剂瓶，用磁力搅拌器搅拌均匀，使酶蛋白完全溶解。
然后，用光度仪测定溶液的响应时间，并确定反应停止的时间。
最后，对得到的数据进行分析，以确定Km值。
Km值测定是一个比较复杂的实验，需要实验室设备、当心操作和熟练的数据处理。
这些都是关键因素，控制着测定结果的准确性和可信度。
因此，在实验室中必须做好准备，并且试剂、实验仪器要有正确的温度、湿度和搅拌速度，以保证实验的准确性和可靠性。
此外，实验室人员还需要做好安全防护措施，以防止接触有毒物质，确保实验的安全性。
总之，测定H2O2的Km值是比较复杂的，需要安全准备、细心操作和合理数据分析，以获得准确、可靠的结果，为氧化解氧化反应提供参考。
过氧化氢酶米氏常数的测定
过氧化氢酶米氏常数的测定傅璐121140012一、实验目的1. 了解米氏常数的测定方法2. 学习提取生物组织中的酶二、实验原理1.米氏反应动力学米氏方程(Michaelis-Menten Equation):2.米氏常数的意义：①反映酶的种类：Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关，与酶浓度、底物浓度无关。
②米氏常数是酶促反应达到最大反应速度Vmax一半时的底物浓度。
其数值大小反映了酶与底物之间的亲和力：Km值越大，亲和力越弱，反之Km值越小，亲和能力越强。
③Km可用来判断酶（多功能酶）的最适底物：Km值最小的酶促反应对应底物就是该酶的最适底物。
3.米氏常数的求法：该方法的缺点是难以确定最大反应速度Vmax。
该作图法应用最广。
但在低浓度是v值误差较大，在[S]等差值实验时作图点较集中于纵轴。
因此在设计底物浓度时，最好将1/[S]配成等差数列，这样可使点距较为平均，再配以最小二乘回归法，就可以得到较为准确的结果。
此法优点是横轴上点分布均匀，缺点是1/v会放大误差，同时对底物浓度的选择有要求。
[S]<<Km时图形近于水平线，[S]>>Km时直线将在原点附近与轴相交。
4.氧化酶：生物体内重要的三种氧化酶类，其作用均是消除体内自由基：①POD：过氧化物酶②SOD:超氧化物歧化酶③CAT：；过氧化氢酶5.过氧化氢酶的作用：植物体内活性氧代谢加强而使过氧化氢发生积累。
过氧化氢可进行一步生成氢氧自由基。
氢氧自由基是化学性质最活泼的活性氧，可以直接或间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并且有非常高的速度常数，破坏性极强，可使细胞膜遭受损害，加速细胞的衰老和解体。
过氧化氢酶（catalase，CAT）可以清除过氧化氢、分解氢氧自由基，保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活，因此CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的抗逆性密切相关。
6.过氧化氢酶活力的测定方法：①紫外吸收法：过氧化氢在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240nm）随反应时间而降低。
实验二 过氧化氢酶Km值的测定 doc
实验二过氧化氢酶Km值的测定 doc
过氧化氢酶（Peroxidase, POD）在降解有机物过程中扮演着重要的角色，主要发挥
脱氢、还原、降解芳香族物质等重要作用，可以用于废水处理、生物降解、食品加工等领域，被广泛应用。
根据Michaelis-Menten模型，酶的Km值可用于表征酶活性的大小，因此，研究过氧化氢酶Km值对于揭示其在降解实例中的行为意义重大。
本实验旨在测定植物源过氧化氢酶Km值，以研究其在有机物降解过程中的活性。
首先，将多种营养液和过氧乙酸（H2O2）分别加入被测样本中，其中含有硫半乳糖（maltose）和3,3',5,5'-四苯氧乙酸（TMB），经37 ℃培养后加入清除剂Na2CO3；其次，将被测样本重新稀释，结合适量的0.0025 mmol/ml TMB和maltose，混合拌匀；再将其摇匀，采用UV- Vis吸光度仪测量溶液的吸光度值；最后，计算出Km值并作报告。
根据实验结果，得出的Km值介于0.02-0.02 mmol/L之间，表明本次实验的结果可靠
可信，说明过氧化氢酶能催化H2O2减解氧化反应，具有一定程度的活性。
然而，在实际
应用中，可能会影响Km值的值大小，如枂根据合成梗限外，特定条件也会影响过氧化氢
酶Km值的大小；因此，应考虑利用不断变化的参数来调整过氧化氢酶Km值，如温度、活
性剂、pH值等。
总之，本实验研究了植物源过氧化氢酶Km值，测得Km值为0.02-0.02 mmol/L，表明其具有一定的活性。
从而我们能够依据Km值的大小衍生出一些可被利用的有机物降解知识，可用于有机物降解实例中改善性能，从而提高有机物降解效率。
过氧化氢酶米氏常数的测定实验报告
过氧化氢酶米氏常数的测定实验报告1. 实验目的与背景哎呀，大家好！今天咱们来聊聊一个挺有趣的实验——过氧化氢酶的米氏常数测定。
别被这个名字吓到了，其实就是在研究一种酶的“工作效率”而已。
想象一下过氧化氢（H₂O₂）就像是个小小的坏蛋，它可不是什么好东西；而过氧化氢酶呢，就是那个专门来捉拿坏蛋的超级英雄。
这种酶存在于咱们的细胞里，帮忙把过氧化氢分解成水和氧气，保护我们的身体不被这些“坏蛋”害了。
米氏常数（Km）这东西呢，简单来说就是衡量酶对底物亲和力的一个参数。
如果Km值小，说明酶对底物的“喜欢”程度高，咱们的超级英雄很厉害；反之则说明这个超级英雄对底物的“兴趣”不大。
通过测定这个值，我们可以更好地理解这位超级英雄的“战斗力”，也能对相关的生物化学反应有个更清晰的认识。
2. 实验原理与方法2.1 实验原理好的，接下来咱们进入正题——实验原理。
首先，得了解酶催化的基本过程。
简单来说，酶会跟底物结合，形成一个“酶底物复合物”，然后催化底物转变为产物。
在这个过程中，酶的催化速率会受到底物浓度的影响。
米氏常数就是用来描述这种关系的一个参数。
咱们用的是过氧化氢酶，它催化的反应是这样的：2 H₂O₂ → 2 H₂O + O₂。
底物过氧化氢在反应过程中会被转化成水和氧气。
通过测定不同底物浓度下反应速率的变化，可以绘制出反应速率与底物浓度的关系图，从中找出米氏常数Km。
2.2 实验步骤接下来，就轮到实验步骤了。
首先，准备好过氧化氢酶和不同浓度的过氧化氢溶液。
每一种底物浓度都要做几个重复实验，以确保数据的可靠性。
接着，将过氧化氢酶加入到每种浓度的过氧化氢溶液中，开始反应。
然后，定期取样，测定反应产物的浓度。
这时，咱们就要用上光谱仪之类的仪器来检测氧气的产生情况，这可是个大工程，得小心翼翼地操作，别弄得一团糟。
3. 实验结果与讨论3.1 实验数据分析一切准备妥当，实验终于开始啦！拿到数据后，我们就可以用“米氏方程”来分析实验结果了。
生物化学过氧化氢酶Km值测定
思考题
酶米氏常数的测定会受到那 些实验条件的影响？
15
5、25% H2SO4
9
四、实验步骤 1、酶液的制备：
每组(共分6组)称取马铃薯5g， 加磷酸缓冲液 10mL，研钵匀浆， 滤纸过滤。
10
2、反应速度的测定：取干燥的50-100ml锥形瓶 6只，编号后按下表操作：
试剂（mL） 0
H2O2溶液/mL 0 蒸馏水/mL 9.5
1
2
3
4
5
1.00 1.25 1.67 2.50 5.00 8.50 8.25 7.83 7.00 4.50
3、0.004mol/L KMnO4：称取恒重草酸钠0.2 g，加
250mL冷沸水及10mL浓硫酸，用0.02mol/L
KMnO4 滴定至至微红色，加热至65 ℃，继续滴
定微红色30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成
0.004mol/L即可。
8
5Na2C2O4+2KMnO4+8H2SO4=10CO2↑+2Mn SO4+K2SO4+8H2O+5Na2SO4
过氧化氢酶米氏常数的测定
生物化学实验
1
一、实验目的
了解米氏常数的意义，测定过 氧化氢酶的米氏常数。 学习一种测定酶Km值的方法 熟悉和掌握过氧化氢酶活性的 测定原理和方法
2ห้องสมุดไป่ตู้
二、相关知识与原理 相关知识 米氏方程与米氏常数（Km值）
米氏方程
Ｖ ── ＝ Vmax[S] Km + [S]
Km值: 酶促反应速度为Vmax/2时的 底物浓度。单位是mol/L
酶液/mL
0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
KM值测定
② 过氧化氢酶催化的反应？
E + H2O2 E-H2O2 + AH2 E-H2O2 E + 2H2O + A
E-H2O2 + H2O2
E + 2H2O + O2↑
2H 2O2
eturn
③ 什么叫Km值？
酶促反应的反应速度达到最大反应 速度的一半时，所需要的底物浓度即 为Km值。
三、结果与分析
1、结果
滴定的直接数据。
2、分析
① 被分解的H2O2（mg）= [空白滴定值(mL)－样品滴定值(mL)]×c ×34.34/2 ② H2O2酶活性 = 被分解的H2O2量（mg） ×酶液稀释倍数 / 样品重（g）×时间（min）
式中：C为Na2S2O3摩尔浓度 34.34为H2O2的摩尔质量
加样时间（6:00:00）
1.0 0
1.0
05:00
2.0 0
2.0
05:20
3.0 0
3.0
05:40
4.0 0
4.0
05:60
5.0 0
50
05:80
1.8mol/L H2SO4(mL)
加样时间（6:00:00）
5.0
10:00
5.0
10:20
5.0
10:40
5.0
10:60
5.0
10:80
return
1.0 3.0
4.0 5.0
1.0 3.0
5.0 0
1.0 3.0
50 5.0
1.0 3.0
混匀，室温，准确5min
0
1.0 3.0
return
1 V
Km Vmax
[笔记]过氧化氢酶动力学常数测定
![[笔记]过氧化氢酶动力学常数测定](https://img.taocdn.com/s3/m/0899a2c7192e45361166f5a1.png)
[笔记]过氧化氢酶动力学常数测定实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定姓名: 赵家熙指导教师: 谭志文实验室: 6503组员:?章恒炯 ? ? 成绩:第三部分:实验记录与分析一、酶活力测定,一,原始数据1.样品原始质量:5.032g2.标定数据:,1,KMnO质量数及配制:158 4,2,NaCO质量数:134 224,3,标定数据:0.02mol/L,4,KMnO实际浓度:0.019mol/L 43.样品滴定数据消耗高锰酸钾溶液,ml,:实验,1,0.65实验,2,0.50对照,1,1.45对照,2,1.30,二,结果计算1(换算系数,1mL KMnO溶液相当于多少mg HO, 4221.72.样品酶活计算,每克鲜重样品1min内分解HO的毫克数表示:mg 22HO/g•min, 22().ABV,，，T171酶活(mgH2O2/g?min)= FWVt，，,A-B,=0.8 V=20.25 FW=5.032 V=2.5ml t=10min T1酶活(mgH2O2/g?min)=0.218二、动力学常数的测定,一,原始数据编号1 2 3 4 5 消耗的0.10 0.10 0.40 0.30 0.30 KMnO,mL, 4,二,求出各管反应前的底物浓度[S]和反应速度V 00编号1 2 3 4 50.005 0.0067 0.0082 0.0125 0.0250 [S],mol/L,00.0099 0.0124 0.0126 0.0221 0.0471 V,mmol/min,0,三,以1/V对1/[S]作图,用excel作图, 001/s 200 149.2 121.9 80 40 1/v 111.1 80.6 79.3 45.1 21.2,四,求出Km,mol/L,和Vmax,mmol/min,1K1m,，如,三,中图 vv[S]vmaxmaxy=0.5572x+1.5829 x=0时 y=1/Vmaxy=0时 x=-1/Km Km=0.35 Vmax=0.63第四部分:课后研讨题1.总结本实验操作过程的注意事项。
最新-过氧化氢酶米氏常数 精品
过氧化氢酶米氏常数篇一：过氧化氢酶动力学常数测定实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定姓名：赵家熙指导教师：谭志文实验室：6503组员：①章恒炯②③成绩：第三部分：实验记录与分析一、酶活力测定（一）原始数据1样品原始质量：50322标定数据：（1）4质量数及配制：158（2）224质量数：134（3）标定数据：002（4）4实际浓度：00193样品滴定数据消耗高锰酸钾溶液（）：实验（1）065实验（2）050对照（1）145对照（2）130（二）结果计算1．换算系数（14溶液相当于多少22）172样品酶活计算（每克鲜重样品1内分解22的毫克数表示：22?）(?)??17?1?酶活(22·)=酶活(22·)=0218（-）=08=2025=50321=25=10二、动力学常数的测定（一）原始数据（二）求出各管反应前的底物浓度[]0和反应速度0（三）以10对1[]0作图（用作图）112001111149280612197938045140212（四）求出（）和（）11??[]如（三）中图=05572+15829=0时=1=0时=-1=035=063第四部分：课后研讨题1总结本实验操作过程的注意事项。
1酶的提取和存放一般在0-4℃下进行。
2每个三角瓶内的酶促反应时间要精确控制在5。
3各反应瓶的滴定终点微红色为同一标准。
4使用前应检查滴定管是否渗漏，滴定过程中应该保证逐滴加入。
2影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些?1、温度，温度过高或者过低会降低过氧化氢酶的活性。
2、酸碱度，酸或碱浓度太高会使过氧化氢酶失活。
3过氧化氢酶与哪些生化过程有关?(2+)+22=(3++－)(3+－)2+22=(2+)2+22+24在反应速度的测定中，加入硫酸有哪些作用？终止反应,为下一步的滴定提供酸的环境。
5米氏方程中的有何实际应用？米氏常数是酶促反应速度为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。
可用于判断反应级数；判断是否为不同种酶；判断酶的最适底物；确定酶活性测试时所需底物的浓度。
实验二 过氧化氢酶Km值的测定
大体内容与时间安排，教学方法：
1、Km值的定义及求Km值的作图方法（林-贝氏作图法和Hanes作图法）5min
2、过氧化氢酶Km值测定的原理5min
3、过氧化氢酶Km值测定的注意事项10min
4难点：
重点：1、Hanes作图法求Km值
2、过氧化氢酶Km值测定的原理
3、滴定管的使用和滴定终点的判断
难点：过氧化氢酶Km值测定的原理
教研室审阅意见：
教研室主任签名：
年月日
基本内容
手段
课堂设计和时间分配
一、Km值的定义：
二、Km值的作图方法
（一）双倒数作图法
（林－贝氏作图法）
（二）Hanes作图法
三、过氧化氢酶Km值测定的原理
四、实验操作
1、只做第3步；
2、表格下：将各瓶置于37℃水浴预热5min改为室温摇匀。
10min
1、加入1:1000稀释血清0.5ml/瓶后保温准5分钟；
2、硫酸的浓度较大，小心不要溅出!!!
3、作图应该用坐标纸，标明有关参数
4、滴定操作：
（1）使用滴定管前要先检查滴定管是否漏水或有堵塞；
（2）滴定管使用前还要润洗（加KMnO4至刻度线24ml处；
复习思考题、作业题
已知某种酶的Km值为0.05mmol/L，试问要使此酶所催化的反应速度达到最大反应速度的80%时底物浓度应是多少？
下次课
预习
要点
质粒转化的相关概念。
参考内容:《生物化学与分子生物学实验技术》
或《分子生物学实验技术》中“DNA重组技术”相关内容。
实施
情况及
分析
5min
1、H2O2在过氧化氢酶的作用下分解生成了H2O和O2；
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过氧化氢酶米氏常数的测定
傅璐121140012
一、实验目的
1. 了解米氏常数的测定方法
2. 学习提取生物组织中的酶
二、实验原理
1.米氏反应动力学
米氏方程(Michaelis-Menten Equation):
2.米氏常数的意义：
①反映酶的种类：Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关，与酶浓度、
底物浓度无关。
②米氏常数是酶促反应达到最大反应速度Vmax一半时的底物浓度。
其数值大
小反映了酶与底物之间的亲和力：Km值越大，亲和力越弱，反之Km值越小，亲和能力越强。
③Km可用来判断酶（多功能酶）的最适底物：Km值最小的酶促反应对应底物
就是该酶的最适底物。
3.米氏常数的求法：
该方法的缺点是难以确定最大
反应速度Vmax。
该作图法应用最广。
但在低浓度是v值误差较大，在[S]等差值实验时作图点较集中于纵轴。
因此在设计底物浓度时，最好将1/[S]配成等差数列，这样可使点距较为平均，再配以最小二乘回归法，就可以得到较为准确的结果。
此法优点是横轴上点分布均匀，缺点是1/v会放大误差，同时对底物浓度的选择有要求。
[S]<<Km时图形近于水平线，[S]>>Km时直线将在原点附近与轴相交。
4.氧化酶：生物体内重要的三种氧化酶类，其作用均是消除体内自由基：
①POD：过氧化物酶
②SOD:超氧化物歧化酶
③CAT：；过氧化氢酶
5.过氧化氢酶的作用：
植物体内活性氧代谢加强而使过氧化氢发生积累。
过氧化氢可进行一步生成氢氧自由基。
氢氧自由基是化学性质最活泼的活性氧，可以直接或间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并且有非常高的速度常数，破坏性极强，可使细胞膜遭受损害，加速细胞的衰老和解体。
过氧化氢酶（catalase，CAT）可以清除过氧化氢、分解氢氧自由基，保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活，因此CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的抗逆性密切相关。
6.过氧化氢酶活力的测定方法：
①紫外吸收法：
过氧化氢在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240nm）随反应时间而降低。
根据测量吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
（以一分钟内A240nm下降0.1为一个单位）
②滴定法（高锰酸钾法、碘量法）
在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。
根据单位时间内消耗的过氧化氢的量即可测出过氧化氢酶活力大小。
7.实验中的反应：
H2O2被过氧化氢酶分解出H2O 和O2 , 未分解的H2O2 用KMnO4 在酸性环境中滴定, 根据反应前后的浓度差可以算出反应速度:
酶
2H2O2 −→2H2O + O2
2KMnO4+5H2O2+3H2SO4 −→2MnO4+K2SO4+8H2O+5O2
（本实验以马铃薯提供过氧化氢酶）
三、实验试剂
1. 0.02mol/L 磷酸缓冲溶液(pH=7.0): 实验室提供.
2. 酶液: 称取马铃薯5g, 加缓冲液10mL, 匀浆过滤.
3. 0.01mol/L 高锰酸钾.
4. 0.098mol/L H2O2.
5. 25%H2SO4.
四、实验操作
取6 只锥形瓶, 按下表的顺序加入试剂.
先加好过氧化氢和蒸馏水, 加酶液后立即混合, 依次记录各瓶的起始反应时间. 反映到达5min 立即加入2ml 25%硫酸终止反应, 充分混匀.。
用0.01mol/L 的KMnO4溶液滴定瓶中剩余的过氧化氢至微红色, 记录消耗的高锰酸钾体积.。
五、注意事项：
1.反应时间必须准确。
2.酶浓度须均一，若酶活力过大，应适当稀释。
3.滴定终点的判定。
六、实验结果：
过氧化氢浓度：0.098mol/L
称取马铃薯的质量：5.00g 序号 1 3 4 5
V （KMnO4）/ml 2.7 4.4 6.32 12.4
[S]/(mol/L) 0.0098 0.016368 0.0245 0.049
v/(mmol/min) 0.0061 0.010732 0.0174 0.036
1/[S] 102.0408 61.0948 40.8163 20.4082
1/v 163.9344 93.1793 57.4713 27.7778
米氏常数计算曲线y = 1.6828x - 8.7953R 2 = 0.998802040
60
801001201401601800204060801001201/[S]1/v 系列1线性 (系列1)
米氏常数Km= -0.1913
七、实验结果分析：
1.曲线上少一个点的原因：
用移液管移取序号为2的过氧化氢溶液（应为1.25ml）错误的移取了1.75ml，故在制图时将其舍去。
2.曲线线性较好（R²=0.9988）的原因：
本实验采取了两人分工的方法完成实验，控制反应结束及滴定分别由一人完成，所以标准都相同，从而在一定程度上提高了实验的准确性。
3.Km计算结果呈负值的原因：
Km呈负值（即整条直线都向下移动），亦即所有测定的v值都偏大。
由v=(c1*V1-2.5*c2*V2)/5，故推断最可能的原因是V2整体测量偏小，可能的操作失误是编号为0的空白对照组中高锰酸钾的滴加量偏高，从而使除去该点的整体的高锰酸钾量都偏小。