发酵法生产虾青素的工艺研究

1 2 3 4 4 3 2 1 2 1 4 3 3 4 1 2 39192 32164 38132 33117 5 227165 10101 9198 8116 9158 8129 118 35114 30186 34162 33154 4 510164 2173 8179 7172 8166 8138 1107
13
14
15
16
K1
K2
K3
类
K4
胡 萝
∑Ki2
卜
Q
素 总
k1
量
k2
k3
k4
R
K1
K2
K3
K4
生
∑Ki2
物
Q
量 k1
k2
k3
k4
R
A
1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 43168 3817 35117 2615 5 344181 39130 10142 9168 8179 6163 4130 31184 33132 33180 35122 4 505154 1145 7196 8133 8145 8181 0185
表 4 实验结果分析
C
D
E
1 2 3 4 2 1 4 3 3 4 1 2 4 3 2 1 36104 35109 37137 35155 5 190151 0173 9101 8177 9134 8189 0157 3413 33108 33178 33100 4 500186 0128 8158 8127 8145 8125 0133
图 1 种龄 36 h 时的情况
图 2 种龄 48 h 时的情况
从图 1 和图 2 可以看出 ,种龄为 36 h 时 , 随着接种比的增大 ,类胡萝卜素总量也增大 , 当接种比为 10 %和 12 % ,培养时间为 48 h 时 ,达最大值 ;种龄为 48 h 时 ,随着接种比的 增大 ,类胡萝卜素总量先不断增大 ,到 8 %时 达最大值 6195μg/ mL ,以后又逐渐减少 ,所 以 ,以种龄为 48 h 、接种比为 8 %时的接种条 件较好 。 212 不同碳源对类胡萝卜素合成的影响
1 2 3 4 3 4 1 2 4 3 2 1 2 1 4 3 32111 34182 40191 36121 5 228128 10117 8103 8171 10123 9105 2120 27146 32122 3610 38148 4 568189 17129 6187 8106 910 9162 2175
11415 发酵液残糖的测定
用 3 , 52二 硝 基 水 杨 酸 比 色 法 ( DNS
3 第一作者 :博士研究生 ,讲师 。 收稿时间 :1999 - 06 - 12
32
食品与发酵工业 Food and Fermentation Industries Vol. 26 No16
法) [5 ] 。
表 2 不同氮源对类胡萝卜素合成的影响
序号
1 2 3 4
氮 源
蛋白胨 尿 素 硫酸铵 硝酸钠
类胡萝卜素总量 μg·mL - 1
7165 3156 6187 3168
虾青素 μg·mL - 1
5178 2168 5143 2179
由表 2 可以看出 ,蛋白胨所对应的类胡 萝卜素产量最高 ,达到 7165μg/ mL ,Biblioteka Baidu素所 对应的类胡萝卜素产量最低 ,硫酸铵比蛋白 胨稍低一点为 6187μg/ mL 。可能是由于蛋 白胨组分较复杂 ,营养较全面 ,所以产量较 高 。但蛋白胨价格较贵 ,硫酸铵较便宜 ,故选 硫酸铵作为氮源 。
虾青素 ,化学名称为 3 ,3’2二羟基2ββ, 胡萝 卜 素24 , 4’2二 酮 ( 3 , 3 ’2dihydroxy2β,β2 carotene24 ,4’2dione) ,分子式 C40 H52O4 ,是一 种重要的类胡萝卜素添加剂 ,具有独特的着 色功能和重要的生理功能 ,在饲料 、食品 、化 妆品及医药等领域中有着广阔的应用前景 。 目前主要有化学合成 、从甲壳类提取以及发 酵等方法生产[1 ] 。本文主要对虾青素摇瓶 发酵的接种量 、通气量和温度等及培养基各 主要组分等进行研究 ,以求得一个比较优化 的发酵工艺条件 。
214 培养基中主要成分及初始 p H 值的正 交实验
培养 基 中 各 组 分 之 间 有 一 定 的 内 在 关
系 ,为寻求它们之间的最相适应的配比关系 ,
在单因素实验的基础上 ,作以下正交实验 ,以
进一步完善培养基中各组分的功能 ,提高类
胡萝卜素总量 、虾青素和生物量 。
表 3 因素和水平的安排
贵 ,后面的实验就选葡萄糖作为碳源 。
表 1 不同碳源对类胡萝卜素合成的影响
序号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
碳 源
葡萄糖 果 糖 蔗 糖 甘露醇 麦芽糖 阿拉伯糖 乳 糖 半乳糖 甘 油 蜜二糖 木 糖 菊 糖 山梨醇
类胡萝卜素总量 μg·mL - 1 6188 6154 6156 7134 3141 3153 2154 1125 2134 1190 2113 1185 1102
式中 A : 吸光度 ; V a : 类胡萝卜素溶液
的体积 ( mL ) ; V b : 分析时所用发酵液体积
(mL) ; E : 消光系数 (0116) ; G : V bmL 发酵
液的细胞干重 ( CD W ) (g) 。
11414 虾青素量的测定
HPL C 法 ,根据 Pilar Calo ,稍有改进[3 ] 。
生素 、氨基酸和嘌呤 ,这些都是法夫酵母生长
所必需的[7 ] 。为了在一定的条件下取得比
较好的效果 ,在做培养基不同组分的试验时 ,
酵母膏的量都是恒定的 。从表 1 可以看出 ,
甘露醇对类胡萝卜素的合成最有利 ,其次是
葡萄糖 ,果糖和蔗糖也可以 ,这与其他的研究
者所得出的结果有差异 。因甘露醇价格较
因素
A
B
C
D
E
p H 初始值 葡萄糖 (N H4) 2SO4 KH2PO4 酵母膏
水平
%
%
%
%
1
5
2
014
012 012
2
6
4
016
013 014
3
7
6
018
014 016
4
8
8
110
015 018
以培养基 B 为基本培养基 ,选取 p H 初 始值 、葡萄糖 、硫酸铵 、磷酸二氢钾和酵母膏 为考察因素 ,每个因素各取 4 个水平 ,按正交 表 L16 (45) 安排实验 。因虾青素在类胡萝卜 素总量中的比例基本上在 78 %左右 ,为方便 起见 ,就以类胡萝卜素总量和生物量为指标 。 因素和水平的安排见表 3 ,实验结果分析见 表 4 、表 5 、表 6 及图 3 。 通过极差分析和方差分析 ,发现类胡萝
11412 菌体生物量的测定
干重法[2 ] 。
11413 类胡萝卜素总量的分析
二甲基亚砜 (DMSO) 法 :根据 Pilar Calo ,
稍有改进[3 ] 。计算公式如下[4 ] :
类胡萝卜素总量 (μg/ g CD W )
=
A ×V a E ×G
或 类胡萝卜素总量 (μg/ mL) =
A ×V a E ×V b
碳源是培养基的主要成分之一 ,它是细
胞和各种代谢产物的主要元素 ,同时又是异
养微生物生长的能源来源[6 ] 。法夫酵母对
不同碳源的利用情况不一样 ,而不同的研究
者所得到的结果也不一样 。Johnson 于 1979
年发现法夫酵母 UCD672210 利用纤维二糖
所产类胡萝卜素总量最高[7 ] 。而季文明发
1 材料与方法
111 菌 种 本实 验 室 保 藏 的 法 夫 酵 母 ( Phaf f ia
rhodoz y m a) 4 - 26 。 112 培养基
培养基 A :葡萄糖 10 g/ L ,酵母膏 3 g/ L , 蛋白胨 5 g/ L ,麦芽汁 (10°Bx) 3 g/ L 。
培养基 B (发酵培养基) :葡萄糖 20 g/ L , (N H4 ) 2 SO4 2 g/ L , KH2 PO4 1 g/ L , MgSO4 · 7 H2O 015 g/ L , CaCl2·H2O 011 g/ L ,酵母膏 2 g/ L 。 113 培养条件
2 结果与讨论
211 种龄和接种量的选择 种子液质量的优劣对发酵生产起着关键
作用 ,不同的微生物以及不同的振荡培养过 程的接种浓度差异可以是十分显著的 ,且各 自存在一最适浓度 ,因此必须在预试验中确 定[2 ] 。将法夫酵母菌株 4 - 26 从斜面接一环 到摇瓶 ,分别培养 36 、48 h 作为种子 ,接种量 分别取 2 %、4 %、6 %、8 %、10 %、12 % (相对 于摇瓶装液量) ,培养时间取 36 h 和 48 h 两 种情况 ,结果见图 1 和图 2 。
第 26 卷 第 6 期 徐学明等 :发酵法生产虾青素的工艺研究
33
有很大差别 ,不同氮源对菌体的生长和产物
的合成有很大影响[2 ] 。为探求不同氮源对
法夫酵母的类胡萝卜素合成的影响 ,将以下
几种氮源分别代替培养基 B 中的硫酸铵 ,并
使培养基具有相同的含氮量 。摇瓶发酵 ,结
果如表 2 所示 。
图 3 因素极差分析
卜素总量和生物量的最优培养基组成并不一 始值 、葡萄糖和酵母膏是影响类胡萝卜素合
致 ,相对而言 ,类胡萝卜素总量比生物量重要 一些 ,因此 ,确定的最优培养基组成为 :p H 初 始值 5 ,葡萄糖浓度 4 % , ( N H4) 2 SO4 014 % , KH2 PO4 012 % ,酵母膏 016 %。其中 ,p H 初
成和菌体生长的重要因素 。 215 通气量的影响
在发酵工业生产上如何保证发酵中氧的 供给 ,以满足生产菌对氧的需求 ,使氧的供需
34
食品与发酵工业 Food and Fermentation Industries Vol. 26 No16
因素
实验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
第 26 卷 第 6 期 徐学明等 :发酵法生产虾青素的工艺研究
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发酵法生产虾青素的工艺研究 3
徐学明 金征宇
(无锡轻工大学食品学院 ,无锡 ,214036)
吕玉华
(上海农科院饲料检测所 ,上海 ,201106)
摘 要 通过对 P1 rhodozy m a 4 - 26 的虾青素摇瓶发酵条件包括接种比 、通气量和温度等 , 以及培养基主要组分的优化 ,得到最优培养基及培养条件 。在此条件下发酵 72 h ,虾青素量 可达 13145μg/ mL 或 1 465μg/ g CDW , 较优化前提高 1148 倍 。 关键词 虾青素 法夫酵母 发酵 优化
B
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 3011 49118 32197 3118 5 422194 58184 7153 12130 8124 7195 4177 25142 3610 38116 34158 4 594114 23160 6136 910 9154 8165 3119
虾青素 μg·mL - 1
5144 5104 5110 5171 2156 2165 1188 0195 1176 1143 1159 1141 0179
213 不同氮源对类胡萝卜素合成的影响 氮是构成微生物细胞蛋白质和核酸的主
要元素 ,氮的来源可分为无机氮和有机氮 。 就微生物的总体而言 ,从分子态氮到复杂的 含氮化合物都可利用 ,但就某一类微生物来 看 ,由于合成能力的差异 ,对氮营养的需要仍
现法夫酵母 NDD2131 对甘油的利用最好[4 ] 。
本文所用的菌株 4226 是经过多次诱变处理
的突变株 ,可能会发生某些变化 ,为寻找既能
高产虾青素又廉价的碳源 ,以各种不同的碳
源分别代替培养基 B 中的葡萄糖 ,进行摇瓶
发酵 ,结果见表 1 。酵母膏中一般含有 812 %
左右的碳水化合物 ,但也含有大量的 B 族维
类胡萝卜素总量
X1i/μg·mL - 1 9145
12184 1213 9109 8148 1316 6198 9164 6186 14117 7103 7111 5131 8157 6166 5196 ∑X1i = 144105
装 液 量 25 mL/ 250 mL 摇 瓶 , 接 种 量
8 % ,转速 220 r/ min ,温度 22 ℃,培养时间 2
～3 d 。
114 实验方法
11411 种子培养方法
从斜面上挑一环菌体于 25 mL 培养基
A/ 250 mL 摇瓶中 ,22 ℃,220 r/ min 旋转振荡
培养 48 h 。