生物技术制药：基因组编辑技术新进展
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基因编辑技术的出现颠覆了传统的 基因组操作技术，在生物学研究和个体 化药物治疗研究中掀起了一场新的革命 。
在未来的发展中，基因编辑技术将 成为生命科学和生物医学等领域研究与 应用的重要工具。
21
参考文献
[1] 张金脉，任兆瑞．一种新的基因定点修饰技术[J]．生命科学，2013， 25（1）:44-46. [2] Heyer WD, Ehmsen KT, Liu J. Regulation of homologousrecombination in eukaryotes[J]. Annu Rev Genet,2014, 44:113-139. [3] Carroll D. Genome engineering with zinc-finger nucleases [J].Genetics, 2011, 188: 773-782 [4] 毛 超，陶永光.基因组编辑技术研究新进展[J].生命的科学,2015,35（1） 96-104. [5] 杨发誉，葛香连，谷峰.新型靶向基因组编辑技术研究进展[J].中国生物 工程杂志.2014,34（2）：98-110.
breaks DSBs) 激活细胞天然的修复机制，包括非同源末端 连接( NHEJ)和同源重组修复(HR) 两条途径。
2. 三种基因编辑技
术
1 人工核酸酶介导的锌指核酸酶技术
(zinc- finger nucleases，ZFNs)
2 转录激活因子样效应物核酸酶技术
(transcription activator- like effector nucleases，TALENs)
3
必要性
1. 研究背
随着基因组测序技术的发展，基因组编
景
辑技术成为将数据转化为基因功能和应
用信息的最主要手段之一。
可行性
高特异性及更具操作性的人工核酸酶的 出现和技术体系的完善，使定点基因敲 除、敲入变得简单且高效。
优势
与传统基因打靶技术相比，应用广、构 建时间短、成本低。
4
1. 技术原
理 借助特异性 DNA 双链断裂( DNA double-strand
3 RNA 引导的 CRISPR/ Cas 核酸酶技术 (CRISPR/ Cas RGNs)。
ZFNs技术
ZFNs核酸酶 = 锌指结构 + FokⅠ酶
• 锌指结构是由多个Cys和His残基通过Zn2+螯合而成的蛋 白质结构，能够与相应的DNA序列发生特异性的结合。
• FokⅠ酶：特异性地识别DNA分子上的靶位点并在下游进 行切割。形成二聚体时才具酶切活性。
基因组编辑技术新进展
Current Progress of Genome Editing Techniques
1
目录
2
基因组编辑技术
针对目的基因组进行定点改造
达到对未知功能基因进行研究和基因治 疗的目的。
利用该技术，可以精确地定位到基 因组的某一位点上，剪断靶标 DNA 片 段并插入新的基因片段，真正达成了 “编辑基因” 。
TALENs技 术
CRISPR/Cas技术
• Science杂志评为2013年十大科学突破之一。 • CRISPR/Cas系统：由RNA介导的，是细菌为抵抗外源
DNA片段入侵的免疫系统。 • 由Cas基因家族与CRISPR序列元件组成。CRISPR通常由
一个前导区(Leader)、重复序列区(Repeat) 和间隔区 (Spacer)所组成。
Pr-DNA
RNA-DNA
(12-20)x2bp
20bp
5'前是T
3'端是NGG
>30bp
23bp
TALE array蛋白
sg RNA 核糖核苷酸
“+ +”
“+”
FokⅠ酶
Cas9蛋白
双链断链：单链缺刻
“+ +”
“+”
“+ +”
“+”
单位点编辑
多位点编辑
“+”
“+”
小鼠、果蝇
小鼠、线虫
4. 应用
01
• 脊髓性肌萎缩病模型：Sma基因
• 帕金森病(PD)的模型：Nurrl基因
4.3 疾病的基因治疗
• 艾滋病治疗
ZFNs技术 CCR5基因
• 帕金森病治疗
ZFNs技术 iPS细胞的SNCA基因
• 着色性干皮病治疗
TALENs技术 XPC突变基因
5. 展望
目前，基因编辑技术的研发还处 于起步阶段，存在的主要问题有：构建 复杂、价格昂贵、脱靶效应等。
CRISPR系统分型
• Ⅰ型CRISPR/Cas系统
Cas3蛋白为核心
• Ⅱ型CRISPR/Cas系统
Cas9蛋白为核心 crRNA、反式激活crRNA(tracrRNA) 及RNase III
• Ⅲ型CRISPR/Cas系统
Cas6蛋白为核心
CRISPR/Cas技术原 理
小结
两大关键步骤
11. 利用构建好的人工内切核酸酶与目的DNA片段
POINT
基因功能 的研究
02
POINT
疾病动 物模型 的建立
03
POINT
疾病的基 因治疗
17
4.1 基因功能的研究
表2 不同模式生物中基因组编辑技术的应用
4.2 疾病动物模型的建 立
• 粥样硬化病模型：ApoE和LdlR基因
• 糖尿病模型：（1）ZFNs技术；PPARγ基因
（2）G6pc基因
TALE蛋白
术
蛋白质的N端一般含有转运信号，C端含有转录激活结构域
(AD)和核定位信号(NLS)。
中心重复区由12~30个重复单元组成，每个单元除12和13 位重复可变双氨基酸残基(RVD)序列外，其他序列完全相同。
RVD序列决定了TALE蛋白的识别特异性：
HD(His-Asp)识别C NG(Asn-Gly)识别T NI(Asn-Ile)识别A NN(Asn-Asn)识别G或A
靶向序列 靶向元件 脱靶难度 切割元件 断链特点 构建难度 技术难度
优势 细胞毒性 实际案例
ZFNs
Pr-DNA (3-6)x3x2bp 3bp为一单位
>18bp ZF array蛋白
“+ + +” FokⅠ酶
“+ + +” “+ + +” 单位点编辑 “+ + +” 大鼠、拟芥南
TALENs
CRISPR/Cas
2个ZFNs分子同时与DNA结合
ZFNs技术
Baidu Nhomakorabea结合位点的间隔区进行切割
启动NHEJ或HR修复机制
形成DNA双链断裂区
TALENs技
• 2012年Science选为年度十大科学突破之一
术
• TALENs核酸酶=TALE蛋白+FokⅠ酶 • TALE蛋白是由N端序列、中心重复区和C端序列组成。
TALENs技
相结合并且特异性切割基因组DNA，形成双链 断裂结构(DSB)。
22. 利用非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)系
统来对形成双链断裂结构进行修复，从而实现 对目的基因组的编辑。
3. 特点比较
类别 识别特点
靶向特点 断裂特点 操作难度 其他特点
表1 不同基因组编辑技术比较
分类
识别序列模式 识别序列长度 识别序列特点
在未来的发展中，基因编辑技术将 成为生命科学和生物医学等领域研究与 应用的重要工具。
21
参考文献
[1] 张金脉，任兆瑞．一种新的基因定点修饰技术[J]．生命科学，2013， 25（1）:44-46. [2] Heyer WD, Ehmsen KT, Liu J. Regulation of homologousrecombination in eukaryotes[J]. Annu Rev Genet,2014, 44:113-139. [3] Carroll D. Genome engineering with zinc-finger nucleases [J].Genetics, 2011, 188: 773-782 [4] 毛 超，陶永光.基因组编辑技术研究新进展[J].生命的科学,2015,35（1） 96-104. [5] 杨发誉，葛香连，谷峰.新型靶向基因组编辑技术研究进展[J].中国生物 工程杂志.2014,34（2）：98-110.
breaks DSBs) 激活细胞天然的修复机制，包括非同源末端 连接( NHEJ)和同源重组修复(HR) 两条途径。
2. 三种基因编辑技
术
1 人工核酸酶介导的锌指核酸酶技术
(zinc- finger nucleases，ZFNs)
2 转录激活因子样效应物核酸酶技术
(transcription activator- like effector nucleases，TALENs)
3
必要性
1. 研究背
随着基因组测序技术的发展，基因组编
景
辑技术成为将数据转化为基因功能和应
用信息的最主要手段之一。
可行性
高特异性及更具操作性的人工核酸酶的 出现和技术体系的完善，使定点基因敲 除、敲入变得简单且高效。
优势
与传统基因打靶技术相比，应用广、构 建时间短、成本低。
4
1. 技术原
理 借助特异性 DNA 双链断裂( DNA double-strand
3 RNA 引导的 CRISPR/ Cas 核酸酶技术 (CRISPR/ Cas RGNs)。
ZFNs技术
ZFNs核酸酶 = 锌指结构 + FokⅠ酶
• 锌指结构是由多个Cys和His残基通过Zn2+螯合而成的蛋 白质结构，能够与相应的DNA序列发生特异性的结合。
• FokⅠ酶：特异性地识别DNA分子上的靶位点并在下游进 行切割。形成二聚体时才具酶切活性。
基因组编辑技术新进展
Current Progress of Genome Editing Techniques
1
目录
2
基因组编辑技术
针对目的基因组进行定点改造
达到对未知功能基因进行研究和基因治 疗的目的。
利用该技术，可以精确地定位到基 因组的某一位点上，剪断靶标 DNA 片 段并插入新的基因片段，真正达成了 “编辑基因” 。
TALENs技 术
CRISPR/Cas技术
• Science杂志评为2013年十大科学突破之一。 • CRISPR/Cas系统：由RNA介导的，是细菌为抵抗外源
DNA片段入侵的免疫系统。 • 由Cas基因家族与CRISPR序列元件组成。CRISPR通常由
一个前导区(Leader)、重复序列区(Repeat) 和间隔区 (Spacer)所组成。
Pr-DNA
RNA-DNA
(12-20)x2bp
20bp
5'前是T
3'端是NGG
>30bp
23bp
TALE array蛋白
sg RNA 核糖核苷酸
“+ +”
“+”
FokⅠ酶
Cas9蛋白
双链断链：单链缺刻
“+ +”
“+”
“+ +”
“+”
单位点编辑
多位点编辑
“+”
“+”
小鼠、果蝇
小鼠、线虫
4. 应用
01
• 脊髓性肌萎缩病模型：Sma基因
• 帕金森病(PD)的模型：Nurrl基因
4.3 疾病的基因治疗
• 艾滋病治疗
ZFNs技术 CCR5基因
• 帕金森病治疗
ZFNs技术 iPS细胞的SNCA基因
• 着色性干皮病治疗
TALENs技术 XPC突变基因
5. 展望
目前，基因编辑技术的研发还处 于起步阶段，存在的主要问题有：构建 复杂、价格昂贵、脱靶效应等。
CRISPR系统分型
• Ⅰ型CRISPR/Cas系统
Cas3蛋白为核心
• Ⅱ型CRISPR/Cas系统
Cas9蛋白为核心 crRNA、反式激活crRNA(tracrRNA) 及RNase III
• Ⅲ型CRISPR/Cas系统
Cas6蛋白为核心
CRISPR/Cas技术原 理
小结
两大关键步骤
11. 利用构建好的人工内切核酸酶与目的DNA片段
POINT
基因功能 的研究
02
POINT
疾病动 物模型 的建立
03
POINT
疾病的基 因治疗
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4.1 基因功能的研究
表2 不同模式生物中基因组编辑技术的应用
4.2 疾病动物模型的建 立
• 粥样硬化病模型：ApoE和LdlR基因
• 糖尿病模型：（1）ZFNs技术；PPARγ基因
（2）G6pc基因
TALE蛋白
术
蛋白质的N端一般含有转运信号，C端含有转录激活结构域
(AD)和核定位信号(NLS)。
中心重复区由12~30个重复单元组成，每个单元除12和13 位重复可变双氨基酸残基(RVD)序列外，其他序列完全相同。
RVD序列决定了TALE蛋白的识别特异性：
HD(His-Asp)识别C NG(Asn-Gly)识别T NI(Asn-Ile)识别A NN(Asn-Asn)识别G或A
靶向序列 靶向元件 脱靶难度 切割元件 断链特点 构建难度 技术难度
优势 细胞毒性 实际案例
ZFNs
Pr-DNA (3-6)x3x2bp 3bp为一单位
>18bp ZF array蛋白
“+ + +” FokⅠ酶
“+ + +” “+ + +” 单位点编辑 “+ + +” 大鼠、拟芥南
TALENs
CRISPR/Cas
2个ZFNs分子同时与DNA结合
ZFNs技术
Baidu Nhomakorabea结合位点的间隔区进行切割
启动NHEJ或HR修复机制
形成DNA双链断裂区
TALENs技
• 2012年Science选为年度十大科学突破之一
术
• TALENs核酸酶=TALE蛋白+FokⅠ酶 • TALE蛋白是由N端序列、中心重复区和C端序列组成。
TALENs技
相结合并且特异性切割基因组DNA，形成双链 断裂结构(DSB)。
22. 利用非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)系
统来对形成双链断裂结构进行修复，从而实现 对目的基因组的编辑。
3. 特点比较
类别 识别特点
靶向特点 断裂特点 操作难度 其他特点
表1 不同基因组编辑技术比较
分类
识别序列模式 识别序列长度 识别序列特点