荧光分光光度计及其应用_李淑玲

荧光分光光度计及其应用李淑玲地矿部岩矿测试技术研究所　北京　100037 摘要　评述了近年来荧光分光光度计的发展,介绍了国内荧光分光光度计的研制及生产情况,综述了荧光分析技术的应用。

关键词　荧光分光光度计　发展　应用　综述 近年来,我国在荧光分光光度分析技术领域的研究取得了许多新的进展。

如荧光总发光光谱技术、荧光探针、光纤荧光传感器、激光诱导时间分辨发光技术、荧光薄层扫描技术、动力学荧光法等。

因此,对荧光分光光度计的要求不断提高。

目前国内生产荧光分光光度计的厂家较少,国外厂商提供的都是中高档的荧光分光光度计。

研制和生产性能可靠的国产荧光分光光度计具有重要意义。

1　基本原理当激发光照射某些物质时,处在基态的分子吸收激发光后跃迁为激发态,这些激发态分子在因转动、振动等损失一部分激发能量后,以无辐射跃迁下降到低振动能级,再从低振动能级下降到基态,在此过程中激发态分子将以光的形式释放出它们所吸收的能量,这种光称之为荧光,所得到的光谱称为荧光光谱。

荧光光谱能够反映荧光物质的特性。

荧光分光光度计是基于物质的这种性质而对其进行定性及定量分析的一种分析仪器。

荧光定量分析的数学处理比分子吸收光谱复杂。

一般来讲,荧光强度I f等于分子所吸收辐射的光强度I a与量子效率的积[1],即I f= f·I a= f I0(1-10-εbc)。

如果荧光物质的浓度足够低,则I f=2.3f I0εbc=kc。

这就是荧光定量分析的理论公式,式中ε、b、c分别是摩尔吸光系数、液池厚度及被测物质的浓度。

2　荧光分光光度计的基本结构荧光辐射是从样品发生的,其在所有方向发射都相同,原则上可以从任何角度进行观测。

但从仪器设计和应用的观点来看,90°角度是最方便且是目前使用较为广泛的方式。

荧光分光光度计的基本结构是:光源※单色器或滤光片※样品池※单色器或滤光片※检测器。

目前荧光分光光度计的常用光源为氙灯,单色器多用光栅,检测器主要用光电倍增管,普通荧光分光光度计的激发和发射波长一般在200～900nm。

3　荧光分光光度计的分类3.1　滤光片式荧光计3.1.1　单光束滤光片荧光计单光束滤光片荧光计的工作原理是第1滤光片允许紫外线(激发光)通过,第2滤光李淑玲　女,副研究员,近年从事激光喇曼光谱分析技术应用研究。

中国分析测试协会九五分析仪器发展调查项目资助。

片可以透射荧光辐射,但它吸收了任何能向光电池散射的光,对于这类仪器来讲,光电管及灯的稳定性要求比较高,否则会引起较大测量误差。

3.1.2　双光束滤光片荧光计贝克曼比例荧光计属于此种类型仪器,它是采用一种特殊设计的汞蒸气灯,具有斩光器作用,使样品和标准各接收60Hz的相同辐射脉冲并为短的暗间隔所分开,从而保持一个恒定的参比水平。

这类仪器消除了由于线路电压波动所引起的变化,具有较高的稳定性。

3.2　荧光分光光度计3.2.1　单光束荧光分光光度计在荧光光谱定量分析中,滤光片式荧光计由于有较高的辐射照到样品上而具有较高的灵敏度,但因它易引起光谱干扰而逐渐被荧光分光光度计所取代。

最早,单光束荧光分光光度计作为紫外可见分光光度计的一个附件仪器,从光源到探测器只有一束测量光。

在测量时,参比和样品交替进行,因而较易引起测量误差。

3.2.2　双单色器单光束荧光分光光度计这类荧光分光光度计是90°角照射样品,结合两个光栅单色器的单光束仪器。

它是由氙灯发出激发光,经过激发单色器分出的单色光照射到样品上,然后使发射单色器接收荧光到检测器。

3.2.3　双单色器双光束荧光分光光度计这类仪器将从光源来的辐射在穿过第一个单色器照射到液池之前分成两路,这可用斩波器或光束分离器来完成。

分光后一部分辐射通过液池及第二个单色器照在检测器上,而另一束辐射从液池及第二单色器的侧旁经过照在检测器上。

如果以斩波器来分光,则可使用一个单独检测器轮流测定来自两光束的辐射;如果使用光束分离器,则需要第二个检测器来测量参比光束的强度。

在这两种情况下,荧光光谱都由测得的来自样品的发射强度与作为波长函数的参比光束强度的比值组成。

PE公司LS_5型及日立公司FRS_100型荧光分光光度计分别属于上述两种情况。

还有一类双光束荧光分光光度计是将从光源辐射的光分为两束,一束通过液池而另一束用作参比。

第二束往往要通过一个参比溶液或在测定前作强度衰减,在许多仪器中采用了零点测定法,即利用衰减器将参比光束在检测器上的响应值调节到与样品的发射在检测器上的响应值相同,然后读得衰减器上此时所调定的值,可利用同一检测器交替测量这两光束,或以不同的检测器同时测定。

第三类双光束荧光分光光度计是以美国Turner公司生产的210型荧光分光光度计为代表。

它具有激发光光源和参比灯的两道光束,交替地照射于测量辐射器上,参比灯在固定波长的强度是可变的,由光平衡系统调节参比灯的能量使其与激发光的能量相同,从参比灯发出的另外一束光通过衰减器到达光电倍增管检测器。

衰减器是由一个与发射单色器联结的传动轮所驱动,这使得光电倍增管的光谱感应与发射单色器的光谱特性的组合得到补偿,因此交替照射于光电倍增管上的是一束经过校正的能量恒定的光束和一束由试样发射的荧光,在整个扫描的波长范围内记录两道光束在每一波长的比率所得到的曲线就是绝对荧光光谱。

3.2.4　激发和发射均为双单色器的荧光仪Spex公司的Fluorolog_2系列仪器的激发和发射均为双单色器,这种仪器减少了杂散光的干扰,对于生物样品等光散射比较强的样品测定十分有利。

这类仪器灵敏度非常高,稳定性十分好。

4　荧光分光光度计的发展由于荧光分光光度计灵敏度高、特异性强,因此应用范围较为广泛。

但由于它对样品有一定要求,所以目前还不属于实验室的常规仪器,一般用于科研工作,目前使用的荧光分光光度计以国外中高档仪器为主。

4.1　国外荧光分光光度计目前进入中国市场的外国厂商主要有日立公司、岛津公司以及美国的PE公司等。

这些公司的仪器性能指标如表1所示。

表1　国外最新荧光分光光度计性能指标比较参数项日立F_4500PE LS_50B岛津RF_5301PC光源150W氙灯8.3W/50Hz氙灯8.9W/60Hz氙灯150W氙灯扫描范围λex、λem200～900nmλe x200～800nmλem200～900nmλex、λem220～900nm分辨率1.0nm2.5nm1.5nm波长精度±2nm±1.0nm±1.5nm最少取样量0.6m L2mL2m L从表1可以看到使用脉冲作为光源是PE公司LS_50B的特点,该光源的使用可降低氙灯的功率,节约能源,延长使用寿命。

而波长扫描速度的改观在日立公司仪器中具有明显的优势。

另外日立公司推出的F_4500型荧光分光光度计采用水平光束测量,样品量只需0.6mL,这对痕量分析大有益处。

虽然荧光分光光度计近年来在光学系统和检测系统方面没有明显改观,但是随着计算机软件的飞速发展,荧光分光光度计的应用软件系统不断完善,各大公司均提供了许多用户欢迎的应用软件,使仪器的操作及数据处理自动化程度提高。

4.2　国内荧光分光光度计的应用与研制70年代末期以来,国内高等院校及科研单位逐渐引进了中高档荧光分光光度计。

笔者统计了1996年《分析化学》杂志刊载荧光分析方面的文章表明,国外仪器使用率高达85%以上。

常用的仪器型号为日立540、日立RF_3010、岛津RF_5000,日立及岛津公司的荧光分光光度计在国内市场中占有绝对优势。

中国科学院系统研究单位在70年代引进国外荧光仪器3台,80年代引进13台, 1990～1995年引进6台。

由此情况可见国内引进仪器形势。

国外高档仪器的引进,对我国荧光分析技术的发展起到明显的推动作用。

国内荧光分光光度计的研制起步较晚,多为自行装配,而商品化的仪器不多,已形成商品化的仪器有:天津光学仪器厂生产的WFD系列产品,厦门分析仪器厂生产的GFY系列以及与厦门大学合作研制的YF 型系列产品。

另外上海第三分析仪器厂先后生产几种型号荧光分光光度计,如970MC型荧光分光光度计,目前国内厦门大学化学系对荧光仪的研制和开发做了大量工作;国内有一些单位研究激光荧光光谱仪,如核工业部化工冶金研究所研制的时间分辨激光荧光光谱仪,灵敏度比普通荧光光度计高十几倍;中国科学院安徽光学精密机械研究所研制的时间分辨荧光生化(免疫)分析仪,采用镧系元素标液生化分析,其灵敏度、特异性、稳定性均可与同位素标液方法相媲美。

南开大学开发一种便携式荧光光谱仪采用光纤采样输入,CCD阵列接收,笔记本微机数据处理技术,特别适合于在线和野外工作。

光纤荧光传感器的应用给荧光分析仪器注入活力,而电荷转移检测器的引入大大改善了荧光分析仪器的性能。

5　荧光分光光度计的应用5.1　无机分析荧光分析法由于灵敏度高、动态线性范围宽等优点,在一些领域中应用广泛。

在无机元素分析中,主要是通过待测元素与有机试剂(或荧光试剂)生成配合物或发生荧光猝灭效应来测定元素的含量。

目前可以通过荧光分析测定70多种金属离子和阴离子,如Ag、Al、As、Au、Be、Bi、Ca、Cu、Ge、Ga、Hf、Hg、In、Ir、Li、Mg、M n、Nb、Ni、Os、Pb、Pt、Ru、Sb、Sc、Si、Sn、Sr、Ta、Tl、Th、Ti、V、Y、W、Zn、Ce、Dy、Eu、Gd、La、Lu、Sm、Cd、Cr (Ⅵ)、Se、Te、Re等。

增效试剂在无机物荧光分析中的应用仍是一个十分活跃的研究领域。

稀土元素的荧光体系、催化动力学荧光分析、新荧光试剂及荧光探针试剂的合成均是目前研究的热点,而将分离手段与荧光光度法相结合,将有效地提高分析方法的适应性,如氢化物与荧光法、色层法与荧光法相结合,这将是微量技术与痕量分析相结合提高分析方法的灵敏度、改善选择性和拓宽荧光分析法应用领域的最佳途径。

5.2　有机物分析近年来有机物荧光分析研究在我国发展迅速,年文献量不断增加。

主要应用领域有中西药和临床、食品营养和添加剂等试样。

激光诱导荧光法诊断恶性肿瘤,显微荧光法研究药物与细胞的相互作用,DNA编序及含量的荧光法测定均是目前受到关注的热点问题。

5.3　荧光分析技术研究近年来,荧光分析技术在我国有了长足的发展。

激光诱导和时间分辨荧光法在提高分析灵敏度和改善选择性方面具有独到之处;三维荧光光谱可以同时利用不同发光物质间荧光波长和荧光寿命的差别,增加分析方法的信息量。

林竹光等将AppleⅡ微机与日立659_103荧光光度计联接,设计了一套多功能软件,除了可以得到常规荧光光谱、导数荧光光谱以外,还可以得到三维荧光光谱及等高图。

还有人把阿达玛变换多通道成像技术与荧光显微镜结合起来,可以得到阿达玛变换三维荧光图象。

这些荧光技术的研究,将对我国荧光分光光度计的研制和开发起引导作用。