AmpC酶

AmpC酶

AmpC 酶是AmpCβ内酰胺酶的简称。是由肠杆菌科细菌或和绿脓假单胞菌的染色体或质粒介导产生的一类β内酰胺酶,属β内酰胺酶Ambler 分子结构分类法中的C 类和Bush Jacoby Medeiros 功能分类法中第一群,即作用于头孢菌素、且不被克拉维酸所抑制的β内酰胺酶。故AmpC 酶又称作为头孢菌素酶。

AmpC 酶按其产生的方式分为3 类:诱导高产酶、持续高产酶和持续低产酶。

(1) 诱导高产酶:AmpC 酶的合成往往与β2内酰胺类抗生素的存在有关。绝大部分肠杆菌科细菌和绿脓假单胞菌在正常条件下(即无β内酰胺类抗生素存在的条件下) 只产生少量的AmpC 酶。而当有诱导作用的β内酰胺类抗生素存在的条件下,AmpC 酶的产量明显增加,增加的范围在100～1 000 倍之间。

(2) 持续高产酶:另有一部分产AmpC 酶的菌株不论在有无β内酰胺类抗生素存在的条件下均可持续高水平产生AmpC 酶,其原因为去阻遏突变,即调控基因之一的ampD 基因发生突变,产生的有缺陷的AmpD 蛋白,不能与另一种调控蛋白—AmpR 蛋白结合形成复合物,AmpR 蛋白即以激活子状态发挥激活作用,引起AmpC酶的大量表达。质粒介导的AmpC 酶往往都属于此类AmpC 酶。产生这种AmpC 酶的细菌对临床的危害最大,是临床微生物实验室检测的重点。

(3) 持续低产酶:还有极少部分产AmpC 酶的菌株,不论在有无β内酰胺类抗生素的存在的条件下均持续低水平的产生AmpC 酶,其原因可能是另一种调节基因—ampR 基因发生突变, 产生有缺陷的AmpR 蛋白,不能在无β内酰胺类抗生素存在的条件下起到抑制子的作用,也不能在有β内酰胺类抗生素存在的条件下起到激活子的作用,故AmpC 酶得以持续低水平地表达。检测不同类型的AmpC 酶或检测产不同类型AmpC 酶的菌株,其方法也有所不同。

近年来,随着β内酰胺类抗生素、尤其是头孢菌素的广泛应用,产AmpC 酶的革兰阴性杆菌越来越多见,尤其是出现了(去阻遏) 持续高产AmpC 酶和质粒介导的AmpC 酶,导致耐药菌株广泛传播和临床对该类细菌感染的治疗困难,已引起临床的高度重视,故检测AmpC 酶具有非常重要的临床意义。

产AmpC菌株的检测

1)头孢西丁敏感试验：AmpC酶可以水解头孢西丁（FOX），即产AmpC酶的菌株对头孢西丁耐药。而超广谱β内酰胺酶（ESBLs）等其他β内酰胺酶一般不能分解头孢西丁，即产ESBLs的菌株对头孢西丁敏感。利用AmpC酶的这一特性，可以对产AmpC 酶的菌株进行初步筛选。

2)三维试验：三维试验也是利用AmpC酶可以水解头孢西丁的原理，先用冻融法或超声粉碎法将待检菌株中的β内酰胺酶提取出来（粗提），观察这种酶的粗提物对头孢西丁的抑制情况。如果粗提物中有AmpC酶存在，即可抑制头孢西丁的活性，使其周围对头孢西丁敏感的大肠埃希菌得以生长;反之，大肠埃希菌受头孢西丁的抑制则不能生长。

检测不同类型的AmpC酶或检测产不同类型AmpC酶的菌株，其方法也有所不同。已陆续报道了多种检测AmpC酶的方法，除改良的三维试验较为经典外，其他的检测方法还不成熟，尚在摸索，试验阶段，检测的结果也各不相同。现讲述如下。

2.1 头孢西丁敏感试验AmpC酶可以水解头孢西丁（FOX），即产AmpC酶的菌株对头孢西丁耐药。而超广谱β内酰胺酶（ESBLs）等其他β内酰胺酶一般不能分解头孢西丁，即产ESBLs的菌株对头孢西丁敏感。利用AmpC酶的这一特性，可以对产AmpC酶的菌株进行初步筛选。

具体操作方法:（1）纸片扩散法:按美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）的纸片扩散（K-B）法进行。FOX纸片的含量为30μg。判断标准为抑菌环<18mm，表示待检菌株对FOX耐药。（2）稀释法:手工的（微量）肉汤稀释方法参照NCCLS的方法进行;也可用MicroScan等微生物分析仪进行分析，操作方法按其操作规程进行。判断标准为MIC>16μg/ml表示待检菌株对FOX耐药。对FOX耐药的菌株，应怀疑产AmpC酶可能。但是Coudron等利用该标准检测肺炎克雷伯菌，大肠埃希菌和奇异变形杆菌AmpC酶时发现28株头孢西丁抑菌环<18mm的肺炎克雷伯菌中，只有4株产AmpC酶，有2株产AmpC酶的大肠埃希菌的抑菌环分别为17mm和18mm。故此方法仅仅作为初步筛选。需做三维试验或纸片协同试验等试验，进行进一步的确定。

2.2 三维试验三维试验也是利用AmpC酶可以水解头孢西丁的原理，先用冻融法或超声粉碎法将待检菌株中的β内酰胺酶提取出来（粗提），观察这种酶的粗提物对头孢西丁的抑制情况。如果粗提物中有AmpC酶存在，即可抑制头孢西丁的活性，使其周围对头孢西丁敏感的大肠埃希菌得以生长;反之，大肠埃希菌受头孢西丁的抑制则不能生长。

具体操作方法:（1）制备β内酰胺酶的粗提物:将待检菌株接种在M-H肉汤或胰蛋白大豆胨水中增菌，离心收集细菌，用0.01mmol/L的磷酸盐缓冲液或PBS（pH7.0）冲洗后制成一定浓度的细菌液，再用冻融法（-70℃快速冷冻、室温或37℃水浴快速解决，反复5次）或超声粉碎法（4℃，超声粉碎）破碎菌细胞，使其菌体内的酶释放出来，再离心（12，000r/min，1h）去除细菌碎片，收集上清液即为β内酰胺酶的粗提物。取部分上清液接种M-H平板常规培养，证实无活菌存在。再用头孢硝噻吩纸片确定有β内酰胺酶的存在。（2）三维试验:将大肠埃希菌标准菌株ATCC25922按NCCLS的K-B法涂布在M-H

平板上，在平板的中央贴一张FOX纸片，从距离纸片5mm处用无菌刀片在平板的琼脂上向外缘方向（离心方向）切一裂隙（一块平板可切4～5条裂隙），每一裂隙中加入25～30μl的一种待检菌株的β内酰胺粗提物（注意β内酰胺酶粗提物不可溢出裂隙），35℃培养18～24h，观察裂隙的内侧端（头孢西丁纸片的抑菌环内）周围有无细菌生长。

判断标准:裂隙的内侧端周围有细菌生长、导致头孢西丁纸片的抑菌环有缺失者为阳性，表明该裂隙内的β内酰胺酶为AmpC酶，也就是说这种待检细菌产AmpC酶。

缺点是需增菌、破碎菌细胞并提取酶的粗提物，操作繁琐、费时，难以在临床微生物实验室常规应用。

2.3 AmpC酶表型筛选试验根据AmpC酶对大部分头孢菌素、尤其是三代头孢菌素耐药的特性，选用多种头孢菌素纸片对产AmpC酶的菌株进行表型筛选。可选用亚胺培南（IP）、头孢吡肟（FEP）、头孢他啶/克拉维酸（CTD/Cla）、头孢噻肟（CTX）和头孢噻肟/克拉维酸（CTX/Cla）5种抗生素纸片进行筛选试验。

具体操作方法按NCCDS的K-B法进行。

判断标准:（1）IP、FEP敏感，而CTX、CTD/Cla和CTX/Cla耐药;（2）IP、FEP敏感，在CTX、CTD/Cla和CTX/CIa的抑菌环内存在散在的菌落;（3）IP敏感，而FEP、CTD/Cla和CTX/Cla耐药。以上3种结果提示，待检菌株产AmpC酶。最后一种表型提示，待检菌株产AmpC酶的同时，产生其他β内酰胺酶，如产ESBLs。

此方法操作简便、快速省时，较三维试验简单得多，结果基本可靠，与三维试验的符合率达89.58%。可以在各临床微生物实验室推广应用。

2.4 氟氯西林（FCC）双抑制剂扩散协同试验氟氯西林（FCC）可抑制AmpC酶的活性，使产AmpC酶的菌株不能及时水解和破坏头孢菌素，保留了这些抗生素的抗菌活性。利用这一特性，可选用FCC与其他超广谱头孢菌素（ESC）进行双抑制剂扩散协同试验（double inhibitors diffuse synergy test，DIDST），观察其有无协同作用。因PCC在琼脂中扩散能力较差，故试验过程中不直接选用FCC纸片，而是将FCC药液直接加在空白纸片上进行扩散，这样才能观察到协同试验的效果。

具体操作方法:在M-H平板上均匀涂布待检菌株，中央贴一空白纸片，并在其周围20～25mm处贴上CTD、头孢曲松（CRO）、头孢哌酮（CFP）、氨曲南（ATN）、CTX和CPI纸片，再在空白纸片上滴加10mg/ml FCC20μl，35℃孵育18～24h，观察纸片之间的抑菌环情况。

FCC与任何一种头孢菌素协同为阳性，提示产AmpC酶。

此方法与AmpC酶表型筛选试验相仿，即采用纸片扩散方法即可快速检测AmpC酶，操作简便、快速省时。结果基础可靠，可以在各临床微生物实验室推广应用。

2.5 等电聚焦及氟氯西林抑制试验［6，8，10］ AmpC酶的等电点相对集中，为6.0～10.0，且≥9.0，故可用物理方法先将其从待检菌细胞中释放出来，制成酶的粗提物，再用等电聚集的方法在琼脂糖凝胶板上将其与其他β内酰胺酶或其他蛋白成分分开。头孢硝噻吩（nitrocephin）是一种标记有硝基环的头孢菌素，溶于水后呈黄色，被β内酰胺酶（包括AmpC酶）水解后呈红色。氟氯西林可以抑制AmpC酶的活性，而对其他β内酰胺酶的活性则无明显的抑制作用。若先用氟氯西林对凝胶板上的酶进行抑制，再用头孢硝噻吩进行显色反应，被抑制掉的条件即可能为AmpC酶条带。

具体操作方法:用超声粉碎法制备待检细菌中的β内酰胺酶粗提物，再用Phastsystem电泳法进行等电聚焦（用两份同种β内酰胺酶粗提物跑出两块凝胶板，电泳的条件完全相同）。将一用氟氯西林（1mmol/L）浸润的滤纸条覆盖在第一块凝胶板（A板）上，而第二块凝胶板（B板）上仅覆盖用无菌蒸馏水浸润的滤纸条。30秒后去除两块凝胶板上的滤纸，再分别覆盖上浸润头孢硝噻吩（500μg/ml）的滤纸条。1min后揭去滤纸条，观察凝胶板上各条带的显色情况。

结果判断:如果A、B两块凝胶板上的条带颜色不同，即在B板上变色（由黄变红者）、而在A板上不变色（仍为黄色）的条带，即为AmpC酶，表明待检菌株产AmpC酶。

与三维试验相同，该方法也是利用酶的粗提物而不是活菌作检测，不受抗生素的诱导影响，也是用来检测（却阻遏）持续高产AmpC酶的方法，也可检测质粒AmpC酶。但缺点是较三维试验繁琐、费时，不宜在临床微生物实验室推广应用。

以上综述了目前检测AmpC酶的各种方法。头孢西丁敏感试验（包括纸片扩散法和肉汤稀释法）因操作简便，可作为临床微生物实验室检测AmpC酶的日常筛选方法。AmpC酶表型筛选试验和氟氯西林双纸片扩散协同实验均利用纸片扩散法对产AmpC酶的菌株进行检测，操作简便，快速省时，结果基本可靠，可以在各临床微生物实验室推广应用。三维试验和等电聚焦及氟氯西林抑制试验均是检测细菌胞体内AmpC酶的活性，不存在抗生素的诱导作用，故检测的是（去阻遏）持续高产AmpC 酶，AmpC酶也可检测质粒AmpC酶。尤其是三维实验是目前公认的质粒AmpC酶或（却阻遏）持续高产的经典方法。但两种方法缺点是需增菌、破碎菌细胞并提取酶的粗提物，操作繁琐、费时，难以在临床微生物实验室常规应用。

近年来，随着β内酰胺类抗生素、尤其是头孢菌素的广泛应用，产AmpC酶的革兰阴性杆菌越来越多见，尤其是出现了（去阻遏）持续高产AmpC酶和质粒介导的AmpC酶，导致耐药菌株广泛传播和临床对该类细菌感染的治疗困难，已引起临床