生物化学--第三章 核酸化学-核酸(4-6节)

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HN—CH3
m7G
帽子0
功能 保证转录的正确起始
抗5’－3‘核酸外切酶的活性。
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U系列核内小RNA（snRNA）也有5‘帽子结构，
但它们的帽子是三甲基鸟苷三磷酸（m32， 2，7G5’ppp5’Np）
有些病毒也有帽子和尾结构，有些没有
PolyA尾：
9~40S
蛋白质合成 的模板
转运 胞浆及细胞核 tRNA
4S，74-95个核苷酸
转运氨基酸
RNA 线粒体
mt tRNA 3.2~4S
核糖体 胞浆及细胞核 rRNA RNA
28S，5400个核苷酸 18S，2100个核苷酸
与蛋白质共同 构成核糖体
5.8S，160个核苷酸
5S，120个核苷酸
16S，1650个核苷酸
突环（ 150nm，每个突环大约75000bp）
玫瑰花结（ 300nm ，6个突环）
螺旋圈（ 700nm，每圈30个玫瑰花）
染色体（ 1400nm，
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每个染色体含10个玫瑰花200bp）
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线粒体DNA
在真核细胞中， DNA除了存在于细胞 核内，还有少量的DNA位于细胞的线粒体 中，称为线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）。mtDNA与细菌的DNA相似，也 是超螺旋双链环状分子，裸露而不与组蛋白 结合，分散在线粒体基质的不同区域
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原核及真核生物核糖体的组成
核糖体
原核生 物(70S)
亚单位
rRNA 蛋白质
小亚基(30S) 16S rRNA 21种
大亚基(50S) 5S rRNA 31种
23S rRNA
真核生 物(80S)
小亚基(40S) 大亚基(60S)
18S rRNA 5.8S RNA 5S rRNA 28S rRNA
DNA变性时，将紫外吸收增加量达最大增量一半时的
温度值称为溶解温度、 Tm值。
–DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。
• 一般DNA的Tm值在82～95C之间。
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DNA的Tm值的影响因素：
1.G和C的含量 2.DNA的均一性 3.离子强度、pH 4.变性剂等
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G+C含量对Tm的影响
经验公式： （G+C)%=(Tm-69.3)×2.44
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（二）复性：
1.定义：除去变性因素后，互补的单链DNA 又可以重新结合为二级双链DNA并恢复生物 活性的现象，称为复性或退火 。 Tm－25℃
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tRNA 的二级结构
三叶草形
氨基酸臂
识别核蛋白体
DHU 环
识别氨酰－tRNA合成酶
反密码环
识14.m12.2R02N0 A上的密码子
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TC 环 额外环 (可变的)
作为分类的依据
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（三）tRNA 的三级 结构－倒 L 形
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第四节 RNA的结构与功能
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RNA与DNA的比较
碱基
RNA
A、G、C、U
DNA
A、G、C、T
戊糖
β-D-核糖
β-D-2脱氧核糖
碱基含量
A与U的含量不一定相同；G与C 的含量也不一定相同
碱基互补配对
U与A，G与C
A=T G=C A与T，G与C
分子大小 结构
不等，从几十至数千个核苷酸 单链，局部互补配对形成双螺旋
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第五节 核酸的性质
一般性质 紫外吸收 变性与复性 核酸的分子杂交
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一、一般性质：
1. 粘度 高 长度与直径之比高达107 2. 密度 浮力密度 DNA＞1.7，RNA，
1.6，蛋白质，1.35～1.40。 线形双螺旋DNA、线形单链DNA、超螺旋
二、信使RNA的结构与功能
mRNA作为指导合成蛋白质的模板，含量3-5%. 种类多、拷贝少、寿命短、修饰成分少是其特点。 mRNA的主体序列是编码区，在其上游5’侧和下游3’
侧都有非编码区。 真核生物mRNA分子两端还有5’帽子和3’尾部结构
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原核细胞mRNA的结构特点
由先导序列,编码区和末端序列等组成,为多顺反子结构
因物种不同而异，但较 RNA大得多
双链，形成双螺旋结构
功能
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多样，涉及遗传信息表达的各个 携带遗传信息
方面
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真核细胞内RNA的种类及功能
种类
细胞定位 英文缩写 分子大小及沉降系数
功能
信使 RNA
胞浆及细胞核 线粒体
mRNA mt mRNA
取决于编码蛋白质的大小， 1000~10,000个核苷酸
33种 49种
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rRNA的结构特征
rRNA一级结构的一个特征就是甲基化残基 的存在，主要的修饰位点在β-D-核糖的C2'-OH。 二级结构的模型也已构建出来，rRNA分子内部 局部碱基互补，形成许多“茎－环”结构，为核 糖体蛋白的结合与组装提供了结构基础。
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防止mRNA被核酸酶降解
与mRNA其出核有关
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三、核糖体RNA的结构与功能
核糖体RNA（rRNA）是细胞内含量最多 的RNA，约占RNA总量的75 % ~80%。rRNA 与蛋白质共同构成核糖体或称为核蛋白体 （ribosome），是细胞内蛋白质生物合成的 场所。
原核生物与真核生物的核糖体均由大亚基和 小亚基构成。
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限制性核酸内切酶：在分子生物学研究中最有应 用价值。例如EcoRI
能够切割DNA的双链，水解不需要ATP。
可以特异性的水解核E酸co中RI，某一些种限特制定性内碱切基酶 顺序部位。
即识别二倍对称性的回文序序列列，做交错切割，产生粘性末端， 可以形成重组分子。常用于克隆和序列分析
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帽子结构通常有三种类型：
O型：m7G5’ppp5’Np Ⅰ型：m7G5’ppp5’NmpNp Ⅱ型：m7G5’ppp5’N mpNmpNp G：N： m在字母左侧表示碱基被甲基化，在右侧表示核糖被甲基化
右上角数字表示甲基化位置，右下角的数字表示甲基数目
4. 转运RNA约占细胞中RNA总量的10 % ~15%
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(DHU)
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R
次黄嘌呤核苷 (I)
NH
5
C
R
假尿嘧啶核苷 ()
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（二）tRNA的二级结构
一级结构中存在一些能局部互补配对 的核苷酸序列，可以形成局部双链，使 tRNA的二级结构呈三叶草形（cloverleaf） (1965, Holley)
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原核生物
16S rRNA的 二级结构
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四、其它小分子RNA及RNA组学
RNA组学研究小的非信使RNA（small nonmessenger RNA）
小的非信使RNA包括； 核内小RNA 核仁小RNA 胞质小RNA 催化性小RNA（核酶） 小片段干扰RNA等
明显增加。
应用；检测核酸变性的情况。 例如，天然状态的DNA在完全变性后，紫外吸收(260 nm)值增 加25～40%，而RNA变性后，约增加1.1%。
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5.熔解温度（melting temperature Tm）：
加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度。
也称为熔点、 Tm值。
2.变性因素：温度升高、过酸过碱、纯水、甲醛和 尿素等的存在
3.变性实质：双链间氢键断开，成为两条单链
并不涉及磷酸二酯键的断裂，其一级结构(碱基
顺序)保持不变。
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DNA变性后，它的一系列性质也随之发生变化，如粘度降 低、浮力密度增加，失去部分或全部的生物活性，紫外吸收 (260 nm)值升高等。 4.增色效应与减色效应： 增色效应：当双链DNA解链成单链时， 260nm的紫外吸收值
成2′-或3′-磷酸核苷
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核酸酶的分类：
1.按作用底物：RNase DNase 2.按对底物的作用方式：
核酸内切酶 核酸外切酶 3.按对磷酸二酯键的断裂方式： 3’－OH与磷酸之间断裂：蛇毒磷酸二酯酶 5’ －OH与磷酸之间断裂：牛脾磷酸二酯酶 4.按水解磷酸二酯键的专一程度 特异性水解： 非特异性水解
顺反子
顺反子
顺反子
5´
3´
先导区
插入顺序
插入顺序
末端顺序
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原核细胞mRNA的结构特点
重叠基因 (overlapping gene)
DNA I
PO a
bc
转录
DNA
翻译
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蛋白A 蛋白B 蛋白C
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真核生物mRNA的结构
1 种类多,拷贝少,序列短,修饰碱基少;2 由5’帽子结构,非编码 区,编码区,非编码区和3’polyA结构等组成,为单顺反子结构. 3 5’帽子结构与蛋白质合成的正确起始有关,可对抗核酸外 切酶。
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பைடு நூலகம்
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五. 真核生物细胞中DNA的组装
核 小 体
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60bp
缠绕1.75圈 约140~160bp
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DNA 真核生物染色体DNA组 （2nm） 装不同层次的结构
核小体链（ 11nm，每个核小体200bp）
纤丝（ 30nm，每圈6个核小体）
粘性末端
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内切酶作用于特异的回文序列,可产生 2种末端中的其中一种 1.粘性末端 2.平头末端
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二、紫外吸收 核酸中的嘌
呤环与嘧啶环 在260nm处有 最大紫外吸收。
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OD260的应用
1. DNA或RNA的定量 OD260＝1.0相当于：
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50
热复性在基因测序中被广泛应用
缓
慢
冷
高温变性
却
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急 速 冷 却
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2.复性的影响因素：
（1）温度和时间： 一般认为比Tm 低25℃左右的温度是复性的最佳条件。复性 时温度下降必须是一缓慢过程
（2）DNA浓度和片段大小： （3）DNA顺序的复杂性：
简单顺序的DNA分子，如多聚(A)和多聚(U)这二种单链序列 复性时，互补碱基的配对较易实现。而顺序复杂的序列要 实现互补，则困难得多。 （4）离子强度
线粒体
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mt rRNA 1h2S，1100个核苷酸
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（续表）真核细胞内RNA的种类及功能
种类 不均一 核RNA
细胞定位 胞浆及细胞核
英文缩写 hnRNA
分子大小及沉降系数
功能
成熟mRNA及其 他RNA的前体
小核 RNA
胞浆及细胞核 snRNA 100~300个核苷酸
参与hnRNA的 剪接、转运
小核仁 RNA 小胞质 RNA
胞浆及细胞核 snoRNA
胞浆及 粗面内质网
scRNA/ 129个核苷酸 7SL-RNA
rRNA的加工 与修饰
信号识别颗粒的 组成成分，选择 分泌蛋白
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一、转运RNA结构与功能 p496
（一）一级结构 1.分子较小，由74~95个核苷酸构成, S＝4非标准 碱基配对 2. 3’-CCA-OH，5‘末端多为G 3. tRNA是修饰成分最多的核酸（10～20%) 如DHU、TΨC等稀有碱基。
酸、碱或酶水解
• 核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。 • DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。
酸易水解N-糖苷键，DNA的嘌呤碱在pH2以下即脱落而 成无嘌呤酸。
碱易水解磷酸酯键，RNA在0.3N碱中即被水解，DNA对 碱相对较稳定。
RNA在0.1 mol/L NaOH溶液生成环状磷酸二酯，进而生
50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA(RNA) 20μg/ml寡核苷酸 2. 判断样品的纯度
DNA纯品： OD260 /OD280达到1.8
RNA纯品： OD260 /OD280达到2.0
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三、DNA变性与复性
(一) 核酸的变性
1.概念：指核酸双螺旋区的的氢键断裂，变成单链 无规则线团结构的过程。
DNA沉降系数之比为1:1.14:1.4。
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3.酸碱性：两性偏酸 4.溶解性： 固体，都溶于水，不溶于一般 有机溶剂 5.颜色反应（定糖法测定含量）
RNA与盐酸、苔黑酚（甲基间苯二酚）反应呈 绿色；
DNA与二苯胺酸性时共热，生成蓝色产物。
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6.核酸的水解