双水相萃取
《双水相萃取技术》课件
03
双水相萃取技术的实验操作
实验准备
01
02
03
实验材料
准备双水相萃取所需的试 剂和材料，如蛋白质溶液 、双水相体系、离心管等 。
实验设备
确保实验所需的设备齐全 ，如离心机、天平、量筒 等。
安全措施
确保实验环境安全，穿戴 适当的实验服和护目镜， 避免试剂溅出。
实验步骤
加入蛋白质溶液
将待分离的蛋白质溶液加入离 心管中。
应用范围广泛
该技术在生物、医药、环保等领域有 广泛应用，可用于蛋白质、酶、细胞 等的分离和纯化。
操作简便高效
双水相萃取技术操作简单，分离速度 快，可实现大规模生产。
环境友好
该技术使用无毒或低毒性的物质，对 环境友好，符合绿色化学的发展趋势 。
技术展望
深入研究机理
进一步深入研究双水相萃取技术的机理，提高分 离效率和选择性。
蛋白质回收率测定
测定蛋白质的回收率，评估双水相萃取技术的效 果。
3
数据分析
对实验数据进行统计分析，了解双水相萃取技术 的分离效果和影响因素。
04
双水相萃取技术的优缺点
技术优势
高分离效率
双水相萃取技术能够实现高效率的分离过程，对于一些难以分离 的物质，如蛋白质、酶等，能够实现快速、准确的分离。
低成本
收集上清液
将上清液收集到适当的容器中 ，以便后续分析。
配制双水相体系
按照所需的浓度配制双水相体 系，确保比例准确。
离心分离
将离心管放入离心机中，设定 适当的转速和时间进行离心分 离。
清洗沉淀
清洗离心管中的沉淀，确保蛋 白质的纯度和回收率。
实验结果分析
1 2
双水相萃取详细资料
三步两水相萃取酶的流程：
细胞匀浆液
第一步双水相萃取
+PEG +盐（或是葡聚糖）
分离机
下相 ） 细胞碎片
杂蛋白 （核酸、多糖）
上 相（PEG相
（目标产物）如prot、E +盐
第二步双水相萃取 静置分层
下 相（盐相） 核酸多糖
上 相（PEG相） 目标产物
杂蛋白
（亲水性较强）
+盐
第三步双水相萃取 静置分层
分子间作用力与熵增加相比占主导地位。
➢ 作用力为斥力：形成两个水相，两种高聚物分 别富集于上、下两相。
➢ 作用力为引力：也形成两个水相，但两种高聚 物都分配于一相，另一相几乎为溶剂。
➢ 作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形
成均相的高聚物水溶液
• 聚合物的不相容性：两种聚合物分子间存在斥力，在 达到平衡后，分成两相，两种聚合物分别进入到一相 中。
优点：1.与固定床反应器相比，不需载体，不存在多孔载体中的 扩散阻力，故反应速度快，生产能力较高；2.生物催化剂在两水 相系统中教稳定；3.两相间表面张力低，轻微搅拌即能形成高度 分散的系统，分散相液滴在10μm一下，有很大的表面积，有利于 底物和产物的传递。
PEG系统中细胞碎片分配到下相中较容易 分配在上相中的蛋白质可通过加入适量的盐（有时也可 加入适量的PEG），尽兴第二次双水相萃取，以除去多 糖和核酸，它们的亲水相较强因而容易分配在盐相中， 而蛋白质就留在了PEG相中；在第三步萃取中，应该使 蛋白质分配在盐相中（例如：调节pH），以使和主体 PEG分离。色素由于其疏水性，通常分配在上相。主体 PEG可循环使用，而盐相蛋白质则可用超滤方法去除残 余的PEG以提高产品的纯度。
双水相萃取名词解释
双水相萃取名词解释双水相萃取是一种分离和提取物质的物理化学方法，它基于物质在两种不相溶的水相中的分配差异来实现。
其中，一相为有机溶剂相，另一相为水相。
双水相萃取能够实现目标物质从混合物中的分离纯化，常用于生物化学、制药、环境监测等领域。
与传统的单相溶剂萃取相比，双水相萃取具有高选择度、高灵敏度、快速分离和减少环境污染等优点，在实际应用中具有广泛的应用前景。
双水相萃取的核心原理是不同物质在两相之间的分配差异。
混合物溶解在有机溶剂相中后，目标物质会因其在两相中的溶解度不同而分配到两相中。
根据目标物质在两相中的分配系数，可以通过调整两相的物理化学性质，例如溶剂种类、pH值和离子强度等，来控制目标物质的转移和分离。
在双水相萃取中，通常使用的有机溶剂相为水不溶性有机溶剂，例如丁醚、乙醚、正己烷等。
水相通常为含有盐或酸碱调节剂的水溶液。
混合物溶解在有机溶剂相中后，通过搅拌、超声波处理等方法，使混合物中的目标物质与两相中的溶剂发生混溶，然后静置使两相分层。
最后，可以通过分液、离心等方式分离出两相，从而得到纯净的目标物质。
双水相萃取在实际应用中，常常与其他分离和纯化技术相结合，例如薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱等，以实现更精确、高效的分离和纯化。
该技术不仅适用于分离化学品、天然产物、有机合成产物等有机化学领域，也可用于生物分子、生物体内代谢产物等在生物化学、制药等领域中的应用。
总之，双水相萃取是一种基于物质在两种不相溶的溶剂相中分配差异来实现目标物质的分离和纯化的物理化学方法。
它具有许多优点，广泛应用于化学、生物化学、制药和环境监测等领域，并与其他分离和纯化技术相结合，促进了科学研究和工业生产的发展。
蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术
蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术双水相萃取是一项蛋白分离和蛋白纯化技术，是利用物质在两相间的选择分配差异而进行分离提纯的，目前已经被广泛应用与医药化学、细胞生物学、生物化工和食品工业等领域。
双水相萃取技术用于提取蛋白质等生物活性物质时，具有操作简单、体系含水量高，在萃取过程中可以保持物质的构象稳定、蛋白不易失活并获得高的萃取率的特点。
1、双水相萃取技术可分离和纯化蛋白双水相萃取技术可以用于蛋白分离和蛋白纯化，包含在一些蛋白分离公司提供的服务。
早期，如在20世纪60年代，有研究者全面进行了生物大分子在双水相系统中的分配行为的研究，得到了蛋白质、酶、核酸、病毒、抗体抗原复合物以及细胞等的分配数据。
双水相系统具有温和的操作条件，对于在极性条件下易造成变性失活的蛋白质和酶的提取中表现出了很大的优势。
双水相萃取法进行蛋白分离和蛋白纯化的原理是：聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间由于分子空间阻碍作用形成了双水相。
当待分离物质进入体系后，由于各组分表面性质、电荷作用和各种力的作用和溶液环境的影响，使其在上、下相中的分配系数不同，通过调节体系参数使被分离物质在两相间选择性分配，从而实现目标组分的分离纯化。
双水相萃取技术进行蛋白分离和蛋白纯化具有以下优点：（1）易于放大，各种参数可以按照比例放大而不降低产物收率[1]；（2）双水相系统传质和平衡过程速度快，回收效率高、能耗较小；（3）易于进行连续化操作、设备简单，且可以直接与后续提纯工序相连接，无需进行特殊处理；（4）相分离条件温和，双水相体系的张力很小，有利于保持生物分子的活性，可以直接用在发酵液中；（5）影响双水相体系的因素比较复杂，可调参数多，便于改变操作条件提高纯化效果。
美迪西提供蛋白质分离纯化技术服务，可以根据客户要求，提供从小试到规模生产全程的蛋白分离纯化服务，并根据工艺的要求结合产品特点给客户定制适用的工艺和系统。
2、双水相萃取技术分离和纯化物质的研究α-淀粉酶是一类用途十分广泛的酶，在粮食、食品加工，以及医药行业等都经常使用，由于α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶，周内外很多课题组对它进行了研究。
双水相萃取名词解释
双水相萃取名词解释双水相萃取是一种分离技术，是通过在混合液体中将一种物质分离出来的过程。
该过程常用于将两种不同物质分离开来，如果它们具有相同的电荷和形状，它们就可以在混合液体中被有效分离。
双水相萃取基于一种叫作分配系数的概念。
分配系数是物质之间的电荷和形状的比率，它决定了物质在混合液体中的分布情况。
根据分配系数的不同，被萃取的物质将分布在两个不同的表面上。
在双水相萃取中，混合液体会被分为两个相分离部分，一部分富含物质A，而另一部分富含物质B。
在双水相萃取过程中，混合液体会被放入一容器中，然后以静态或动态的方式搅拌，使物质A和B之间的分配系数得到改变。
当混合液体中的物质A和B改变分布率时，它们就会被从中分离出来。
这种技术可以极大地提高物质分离的速度，从而使分离的效率极高，而且还可以分离出非常精细的物质，如大小不一的纳米粒子等。
双水相萃取技术在药物分离、石油分离、食品加工等领域具有广泛应用，可以帮助工程师们解决大量问题，提高产品质量与生产效率。
此外，双水相萃取还可以用于能源转换，可以将太阳能和风能有效转换为其它形式的能源，以满足人类的能源需求。
综上所述，双水相萃取是一种重要的技术，它可以解决大量混合液体中不同物质的分离问题，在药物分离、石油分离、食品加工等领域有着广泛应用，帮助工程师们极大地提高分离的速度和效率，并可以将能源有效转换。
虽然双水相萃取技术带来了诸多好处，但是它也有一定的局限性。
由于其基本原理是以分配系数为基础的，在进行双水相萃取时，受到混合液体种类的限制，只能用于水基混合液体。
此外，双水相萃取过程中所产生的废水也不能直接排放，必须经过处理才能安全排放。
因此，在进行双水相萃取之前，需要进行充分的技术评估，确保双水相萃取过程安全有效。
双水相萃取技术的发展越来越快，它不仅帮助我们解决了大量的分离问题，而且还能帮助满足人类能源需求。
未来，双水相萃取技术将会得到更深入的研究，希望有一天它能够应用到更加广泛的领域，为促进人类社会发展作出更多的贡献。
双水相萃取
2.2％的葡聚糖水溶液
0.72％甲基纤维素钠的水 ％ 溶液 葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系
{
发现, 早在1896年,Beijerinck发现 当明胶与琼 年 发现 脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时,得到一个 混浊不透明的溶液，随之分为两相,上相富含 明胶,下相富含琼脂(或淀粉), 这种现象被称 聚合物的不相溶性（ 为聚合物的不相溶性（incompatibility） 聚合物的不相溶性 ） 从而产生了双水相体系(Aqueous two phase 双水相体系(Aqueous 双水相体系 ATPS)。 system, ATPS)。
当两种高聚物水溶液相互混合时， 当两种高聚物水溶液相互混合时， 它们之间的相互作用分为三类： 它们之间的相互作用分为三类： 互不相溶(imcompatibiliy) 互不相溶 复合凝聚(complex coacervation) 完全互溶(complete miscibility)
2.2 双水相体系的组成
pH影响蛋白质中可离解基团的离解度，而改变蛋 影响蛋白质中可离解基团的离解度，而改变蛋
白质所带电荷和分配系数。
离子环境也有影响。
5.3 疏水反应的影响 疏水反应的影响
消除电化学效应后， 消除电化学效应后，粒子表面的疏 水性占主要地位。 水性占主要地位。如被分配的蛋白 质具有疏水性的表面，则其分配 可以改变。 系数可以改变。
(4)分相时间短，自然分相时间一般 5min～15min； 为5min～15min； (5)界面张力小(10-7～ 10-4mN／m)， (1010-4mN／m)， 有助于两相之间的质量传递； 有助于两相之间的质量传递； 不存在有机溶剂残留问题， (6)不存在有机溶剂残留问题，高 聚物一般是不挥发物质， 聚物一般是不挥发物质，对人体 无害； 无害；
双水相萃取
各种双水相系统
聚合物1 聚合物1 聚丙二醇 聚合物2 聚合物2或盐 甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇， 甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇， 聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖， 聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡聚 糖 聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖 聚乙烯醇，葡聚糖， 羟甲基葡聚糖，葡聚糖 羟甲基葡聚糖， 葡聚糖 葡聚糖 葡聚糖 硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，酒 硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠， 石酸钾钠， 石酸钾钠，磷酸钾
4、电化学分配 、 i、盐的种类及浓度 、
pH 升高, H2PO4- HPO42- PO43在PEG / K2HPO4 系统使带负电蛋白 蛋白有较高的K。 蛋白
ii、 pH 值的影响 改变两相的电位差 如体系pH 值与蛋白质的等电点相差越大， 则蛋白质在两相中分配越不均匀。 pH 值的变化也会导致组成体系的物质电 性发生变化，也会使被分离物质的电荷发 生改变，从而影响分配的进行。
6、双水相萃取的工艺流程 、 工艺流程主要由三部分构成：目的产物的萃取; 工艺流程主要由三部分构成：目的产物的萃取 PEG的循 的循 无机盐的循环。 环; 无机盐的循环。
一、目的产物的萃取： 目的产物的萃取： 第一步，匀浆液与PEG和无机盐在萃取器中混合，然后进 和无机盐在萃取器中混合， 第一步，匀浆液与 和无机盐在萃取器中混合 入分离器分相。一般使目标蛋白质分配到上相（ 入分离器分相。一般使目标蛋白质分配到上相（PEG相）， 相 而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相（ 而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相（富盐 相） 。 第二步，在上相中加盐，形成新的双水相体系， 第二步，在上相中加盐，形成新的双水相体系，将目标蛋白 质转入富盐相，从而将蛋白质与PEG分离，以利于使用超 分离， 质转入富盐相，从而将蛋白质与 分离 滤或透析将PEG回收利用。 回收利用。 滤或透析将 回收利用 的回收循环： 二、PEG的回收循环： 的回收循环 加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收PEG; ①加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收 相通过离子交换树脂， ②将PEG相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去 相通过离子交换树脂 用洗脱剂先洗去PEG，再 ， 洗出蛋白质。 洗出蛋白质。 无机盐的循环： 三、无机盐的循环： 冷却，结晶，以离心机分离收集。除此之外还有电渗析法、 冷却，结晶，以离心机分离收集。除此之外还有电渗析法、 膜分离法回收盐类或除去PEG相的盐。 相的盐。 膜分离法回收盐类或除去 相的盐
双水相萃取技术
新型功能双水相系统
温度敏感型双水 相体系
聚合物浓度的影响
聚合物分相的最低浓度为临界点，系线的 长度为零，此时分配系数为1，即组分均 匀的分配于上下相. 随着成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合 物的总浓度增大，系统远离临界点，系线 长度增加，两相性质的差别(疏水性等)增 大，蛋白质分子的分配系数将偏离临界点 处的值(K=1)，即大于1或小于1。因此,成 相物质的总浓度越高，系线越长，蛋白质 越容易分配于其中的某一相。
盐的种类影响
在双聚合物系统中，无机离子具有各自的分配系数， 不同电解质的正负离子的分配系数不同，从而产生不 同的相间电位。由于各相要保持电中性，使得带电生 物大分子，如蛋白质和核酸等分别向两相移动分配。
盐浓度的影响
盐的浓度不仅影响蛋白质的表面疏水性，而且扰 乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相 体积比。 例如，PEG/磷酸盐体系中上下相的PEG和磷酸 盐浓度及Cl-在上下相中的分配平衡随添加NaCl 浓度的增大而改变，这种相组成即相性质的改变 直接影响蛋白质的分配系数，如图。 离子强度对不同蛋白质的影响程度不同，利用这 一特点，通过调节双水相系统的盐浓度，可有效 地萃取分离不同的蛋白质。
lnK=lnK0+lnKe+lnKh+lnKb+lnKs+lnKc
式中，下标e、h、b、s、c分别表示静电作用、疏水作用、生 物专一性、分子大小、形态结构对分配系数的贡献。lnK0是 包括其他因素（盐的水合作用、配体相互作用）在内的分配 系数。
静电作用
非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影 响，利用相平衡热力学理论可推导下述分配系数表 达式： lnK=Mλ/RT M-溶质的相对分子质量；λ-与溶质表面性质和 成相系统有关的常数;R-玻尔兹曼常数；T-绝对温度。 生物大分子物质的M值一般很大，λ的微小变化 会引起分配系数很大的变化。因此利用不同的表面 性质，可以达到快速分离非电介质型的大分子溶质 的目的。
双水相萃取
双水相萃取技术
实验原理
双水相系统中使用的双水相是由两种不相溶的高分子溶液或者互不相溶的盐溶液和高分子溶液组成。
双水相系统的制备，一般是将两种溶质分别配成一定浓度的水溶液，然后将两种溶液按照不同的比例混合，静止一段时间，当两种溶质的浓度超过某一浓度范围时，就会产生两相。
实验器材
聚乙二醇、硫酸钠（硫酸铵）、烧杯、玻璃棒、量筒、分析天平实验步骤
1、双水相系统的制备
（1）分别配制浓度为6g/100ml、10g/100ml、14g/100ml聚乙二醇溶液各50ml。
（2）配制50ml浓度为14g/100ml的硫酸钠溶液三份。
（3）将不同浓度的聚乙二醇溶液与硫酸钠溶液混合，充分搅拌，静置分层，得到3份双水相系统。
2、观察双水相系统，高浓度双水相系统如不成两相，可定量添加聚乙二醇和硫酸钠的高浓度溶液。
3、向双水相体系加入反应液。
双水相萃取的名词解释
双水相萃取的名词解释双水相萃取是萃取的一种方法。
两种水溶性不同的聚合物，或一种聚合物和无机盐的混合溶液，在一定的浓度下，其体系会自然分成互不相溶的两相。
当被分离物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷间作用和各种作用力等的影响，被分离物质在两相间的分配系数不同，导致其在上下相的浓度不同，即可达到分离的目的。
早在1896年人们就已观察到，明胶与琼脂，或明胶与可溶性淀粉溶液混合时，会得到一种不透明的混合溶液。
静置后可分为两相，上相中含有大部分的明胶，下相中含有大部分琼脂（或淀粉），这种现象称为聚合物的不相容性，从而产生了双水相。
双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。
当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水键、氢键和离子键等）的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同。
分配系数K等于物质在两相的浓度比。
各种物质的K值不同，例如各种类型的细胞粒子、噬菌体等分配系数都大于100或小于0.01，酶、蛋白质等生物大分子的分配系数在0.1~10之间，而小分子盐的分配系数在1.0左右。
因而，双水相体系对生物物质的分配具有很大的选择性。
双水相的优势ATPE作为一种新型的分离技术，对生物物质、天然产物、抗生素等的提取、纯化表现出以下优势：(1)含水量高(70％--90％)，在接近生理环境的体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；(2)可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质（或者酶），还能不经过破碎直接提取细胞内酶，省略了破碎或过滤等步骤；(3)分相时间短，自然分相时间一般为5min～15 min；(4)界面张力小(10-7～10-4mN／m)，有助于两相之间的质量传递，界面与试管壁形成的接触角几乎是直角；(5)不存在有机溶剂残留问题，高聚物一般是不挥发物质，对人体无害；(6)大量杂质可与固体物质一同除去；(7)易于工艺放大和连续操作，与后续提纯工序可直接相连接，无需进行特殊处理；(8)操作条件温和，整个操作过程在常温常压下进行；(9)亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的选择性。
双水相萃取技术
三、双水相萃取3.1 双水相萃取的原理及特点3.1.1 双水相萃取的原理双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。
当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。
分配系数K等于物质在两相的浓度比，由于各种物质的K值不同，可利用双水相萃取体系对物质进行分离。
3.1.2 双水相萃取的特点双水相体系萃取具有如下特点：(1)含水量高(70%~90%)，是在接近生理环境的温度和体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；(2)分相时间短，自然分相时间一般为5~15min；(3)界面张力小(10-7~10-4mN/m)，有助于强化相际间的质量传递；(4)不存在有机溶剂残留问题；(5)大量杂质能与所有固体物质一同除去，使分离过程更经济；(6)易于工程放大和连续操作。
由于双水相萃取具有上述优点，因此，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。
3.2 双水相萃取在分离和提取各种蛋白质(酶)上的应用用聚乙二醇(PEG)/羟丙基淀粉酶(Reppal PEG)体系经两步法可从黄豆中分离磷酸甘油酸激酶(PGK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。
在黄豆匀浆中加入PEG4000，可絮凝细胞碎片及大部分杂蛋白。
在上清液中加入PEG4000(12%)-ReppalPES(40%)，PGK在上相、GAPGH在下相的收率均在80%以上。
萃取过程的放大采用离心倾析机连续处理匀浆液，用离心萃取器完成双水相体系的两相分离，整个工艺具有处理量大、接触时间短、酶收率高的特点。
用PEG/(NH4)2SO4双水相体系，经一次萃取从A-淀粉酶发酵液中分离提取α-淀粉酶和蛋白酶，萃取最适宜条件为PEG1000(15%)-(NH4)2SO4(20%)，pH=8，α-淀粉酶收率为90%，分配系数为19.6，蛋白酶的分离系数高达15.1。
07双水相萃取法
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由于高聚物对生物活性物质有稳 定作用，在大规模生产中多采用常 温操作，从而节省冷冻费用。但适 当提高操作温度，体系黏度较低， 有利于分离。
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2.2 双水相萃取过程
双水相萃取过程包括以下几个步 骤：
双水相的形成； 溶质在双水相中的分配； 双水相的分离。
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2.2 双水相萃取过程
在实际操作中，经常将固状(或浓 缩的)聚合物和盐直接加入到细胞匀 浆液中，同时进行机械搅拌使成相 物质溶解，形成双水相。
溶质在两相中发生物质传递，达 到分配平衡。
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聚合物和盐的溶解多为萃取过程 的速率控制步骤。达到分配平衡后 的两相分离可采用重力沉降(静置分 层)或离心沉降法。
易定量控制； 水溶性的高聚物难以挥发，使反萃
必不可少发展
1．双水相萃取与细胞破碎过程相结合 2．亲和双水相萃取 3．双水相萃取与膜分离相结合 4．使用带配基的吸附剂微粒特异性地吸附待
分离的生物大分子，利用微粒与杂蛋白分配系 数的差别，分离某些难以分离的生物大分子。 5．双水相萃取与生物转化过程结合
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1.2 相图
把双水相体系中的组成成分，分 别以不同的浓度相混，然后观察其 成相过程，把此过程以图的形式描 绘下来，即称为此种双水相体系的 相图。
不同的双水相体系，其成相条件 是不同的，相图常被用于研究不同 双水相体系中的成相现象。
9
10
用A点代表体系总组成，B点和C点分别代 表互相平衡的上相和下相组成，称为节点。
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2.3 双水相萃取的优点▲
双水相萃取对于生物物质的分离和 纯化表现出特有的优点和独有的技 术优势，具体表现在以下方面： ①易于放大。各种参数可以按比 例放大而产物收率并不降低。
双水相萃取技术
三、双水相萃取3.1双水相萃取的原理及特点3.1.1双水相萃取的原理双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。
当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水键、氢键和离子键等）的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。
分配系数K等于物质在两相的浓度比，由于各种物质的K值不同，可利用双水相萃取体系对物质进行分离。
3.1.2双水相萃取的特点双水相体系萃取具有如下特点：（1）含水量高（70%〜90%），是在接近生理环境的温度和体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；（2）分相时间短，自然分相时间一般为5~15min ；⑶界面张力小（10-7〜10-4mN/m），有助于强化相际间的质量传递；⑷不存在有机溶剂残留问题；（5）大量杂质能与所有固体物质一同除去，使分离过程更经济；（6）易于工程放大和连续操作。
由于双水相萃取具有上述优点，因此，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。
3.2双水相萃取在分离和提取各种蛋白质（酶）上的应用用聚乙二醇（PEG）/羟丙基淀粉酶（Reppal PEG）体系经两步法可从黄豆中分离磷酸甘油酸激酶（PGK）和磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）。
在黄豆匀浆中加入PEG4000，可絮凝细胞碎片及大部分杂蛋白。
在上清液中加入PEG4000（12%）-ReppalPES（40%），PGK在上相、GAPGH 在下相的收率均在80%以上。
萃取过程的放大采用离心倾析机连续处理匀浆液，用离心萃取器完成双水相体系的两相分离，整个工艺具有处理量大、接触时间短、酶收率高的特点。
用PEG/（NH4）2SO4 双水相体系，经一次萃取从A-淀粉酶发酵液中分离提取a淀粉酶和蛋白酶，萃取最适宜条件为PEG1000（15%）-（NH4）2S04（20%），pH=8，a淀粉酶收率为90%，分配系数为19.6，蛋白酶的分离系数高达15.1。
双水相萃取全解
双水相体系的双结线模型
a 系线 两相区
双节线 均相区
b
双节线 均相区
两相区 系线
临界点
二、双水相萃取工艺流程操作
工艺流程主要由三部分组成：
• 目标产物的萃取 • 聚合物（PEG)的循环 • 无机盐的循环
双水相萃取工艺流程图
萃取液 相似相溶原理
上相
PEG
ATPE
无机盐
相体系回收示意图
PEG的循环
2）聚合物及其相对分子质量
不同聚合物的水相系统，疏水性不同； 同一聚合物，疏水性随分子量增加而增加， 其大小的选择取决于萃取过程的目的和方 法，在PEG/Dex体系中，PEG分子量的 减少，会使萃取液在两相中的分配系数增 大，当PEG的分子量增加时，在质量浓度 不变的情况下，亲水性蛋白质不再向富含 PEG相中聚集而转向另一相。
R=Vt／Vb，K=Ct／Cb，G=1/RK， Y=（1+1／RK）-1 ×100％
式中：R－相比；Vb－下相体积，mL；
Vt－上相体积，mL； K－分配系数； Cb－下相溶质的质量浓度，g／mL； Ct －上相溶质的质量浓度，g／mL； G－上、下相溶质的质量比； Y－萃取率，％。
(3) 双水相相图制作
综合利用以上因素，可通过实验确定最佳双 水相萃取系统。以PEG/硫酸铵双水相体系萃取 一种蛋白质为例： （1）固定硫酸铵为某一浓度，用梯度浓度的 聚乙二椁与其形成一系列双水相体系，萃取分 离蛋白质，分别测量上、下相蛋白质的含量， 确定PEG的最佳浓度。 （2）选取（1）中的最佳PEG浓度，在此浓度 下与梯度浓度的硫酸铵形成双水相体系，进行 蛋白质的萃取分离，测定上、下相中蛋白质的 含量，确定出最佳的硫酸铵浓度。
双水相体系的双结线模型
双水相萃取法
lnm=-Mλ/RT
m-分配系数；M-溶质的相对分子质量；λ-与溶质表面性质和 成相系统有关的常数; R-气体常数，J/(mo1．K)；T-绝对温度， K。
因此，溶质的分配系数的对数与相对分子质量之 间呈线性关系，在同一个双水相系统中，若λ>0，不 同溶质的分配系数随相对分子质量的增大而减小。同 一溶质的分配系数随双水相系统的不同而改变，这是 因为式中的λ随双水相系统而异。
图a和b分别为PEG/Dx和PEG/KPi系统的典型相图 a
系线 两相区 双节线 双节线
b
两相区 系线
均相区
均相区
均相区
临界点
在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而 体积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即
上下相组成分别为T和B,
系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长， 两相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时， 即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中的 分配系数均为1，因此K点称为临界点(critical point)。
在生物分子回收和纯化以后，怎样从含有目标产物残余物的 水溶液中回收聚合物或盐就成为一个重要的问题。例如从 1000kg面包酵母中萃取反丁烯二酸酶需要用680kgPEG-1550和 533kgK3PO4，若不回收利用，化学品的消耗会使生产成本大幅 度上升。如果产品是蛋白质，并且分配在盐相，则盐可以在 错流过程操作方法下，用超滤或渗析膜过滤回收。如果蛋白 质积聚在聚乙二酵中，可以通过加入盐来精制，加入的盐导 致蛋白质在盐相中重新分配。PEG的分离同样可以用膜分离来 实现，即用选择性孔径大小的半透膜来截留蛋白质，同时排 除PEG进行回收。 另一种力法是通过盐析或使用水-可混溶性 的溶剂来沉淀蛋白质，但是固体(产物)的去除被存在的PEG阻 碍。也可使用离子交换和吸附，它们是通过蛋白质与基质的 选择性相互作用进行的。然而，当黏性聚合物溶液通过柱被 处理的时候，会出现高的压力降。在上述的三种方法中，膜 分离是分离和浓缩被纯化的蛋白质并同步去除聚合物的最佳 方法。
双水相萃取专业知识
两相物性旳差别，使双水相萃取具有本身旳特征。
特征：
操作条件温和 表面张力大大低于有机溶剂相与水相间旳表面张力； 两相分散旳耗能低，分散程度高，传质面积大，传质速率快； 在温和旳萃取条件下，到达较高旳萃取效率。
安全性能高 药物生产，双水相萃取质量和安全性好； 高聚物一般为不易挥发物质，操作环境对人体无害。
这种易于放大旳优点对于新药研制 中生产工艺旳开发极为有利
双水相萃取技术旳进展
用变性淀粉PPT替代昂贵旳Dextran。PPT-PEG体系 已被用于从发酵液中分离过氧化氢、β-半乳糖甘 酶等。PPT-PEG体系比PEG-盐体系稳定，和PEGDextran体系相图非常相同，并具有下列优点：
伴随生物技术旳发展,必将增进双水 相萃取体系旳完善,从而更显示出双水 相体系萃取分离技术在生物物质分离 中旳独特优点.
在双水相系统中旳被分离物传质速度快，因而到达 分配旳时间短，但因两相密度相差小，分配困难， 是其主要矛盾。
利用离心沉淀可加紧相分离速度
体系旳选择和优化
1）、体系选择旳原则： 根据目旳pro和共存杂质旳HFS\M\pI\Z等旳差别, 综合利用静电、 疏水和添加合适种类和浓度旳盐，可选择性萃取目旳产物。
双水相旳类型： 离子型高聚物－非离子型高聚物 PEG－DEXTRAN 高聚物－相对低分子量化合物 PEG－硫酸铵
当两种高聚物水溶液混合物混合后旳总构成点 落在两相区（如：点M）可形成互不相溶旳两 相T和B。两相旳构成和密度均不同。一般，T 相为上层，高聚物PEG含量较高；B相为下层， 高聚物KPI含量较高。
双水萃相取旳理论基础
表面电荷
当盐旳正、负离子对上下相有不同旳亲和力，即 正负离子旳分配系数不同步，就会产生电位。
双水相萃取
（2）双水相体系形成的原因：
聚合物的不相溶性（空间位阻）
聚合物的不相溶性：各个聚合物分子，都倾向于在其
周围有形状、大小和极性相同的分子，同时，由于不同
类型分子间的斥力大于同它们的亲水性有关的相互吸引 力，因此聚合物发生分离，形成两个不同的相。
对于某些聚合物溶液与一些无机盐溶液相混时，只要
浓度达到一定范围时，体系形成双水相的机理尚不清楚。
这种影响与蛋白质相对分子质量也存在关系，相对分子质量越
大，影响也随之增大。
（2）高聚物的浓度：
成相物质的总浓度越高，蛋白质越容易分配于其中的某一相；
而对于细胞等颗粒来说，在临界点附近细胞大多分配于其中的
某一相。
（3）盐的种类和浓度：
盐的种类和浓度对分配系数的影响，主要反映在相间电位和
蛋白质的疏水性差异上，这是由于当双水相系统中存在这些
加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收 PEG；B)将 PEG
相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去 PEG，再洗出蛋 白质。 无机盐的循环：将含无机盐相冷却，结晶，然后用离 心机分离收集。除此之外还可用电渗析法、膜分离法回
收盐类或除去 PEG相的盐。
（3）双水相萃取在药物分离中的应用
①细胞匀浆液中 蛋白质的纯化
液膜萃取
反胶团萃取
内容提纲：
1.双水相体系 2.双水相萃取的基本原理 3.影响双水相分配的主要因素
4.双水相萃取技术的发展
5.双水相萃取操作及应用
1.双水相体系
（1）双水相系统：一定浓度的两种水溶性高聚物或一
种高聚物与盐类在水中能形成两层互不相溶的匀相水溶液， 这样的水相系统称为双水相系统。
5%PEG6000 上层组成：2%Dextran500 93%水 3%PEG6000 下层组成：7%Dextran500 90%水
双水相萃取
双水相系统的分类
按照物质在双水相系统的分配作用类型，可分为空 间排阻分配、电化学分配、构型相关性分配、亲和分配、 疏水分配和手性分配等类型。
分配类型 空间排阻分配 电化学分配 构型相关性 分配 亲和分配 典型相系统 PEG/EDX PEG/盐 影响因素 相系统因素 聚合物分子大小 相界面静电位 聚合物分子空间 构型 配基亲和性能 主要可调因素 溶质性质 表面积 表面电荷 空间构型 特异的亲和位 点 表面疏水性 聚合物分子量、浓度 pH、盐种类、聚合物 电荷性质 聚合物分子量、浓度、 pH、温度 配基种类、浓度、pH
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选择双水相的原则
• 能够获得高的产物回收和生物活性回收， 高的分离纯化倍数； • 系统的物理化学性质有利于大规模的应 用，有良好的工艺性能，系统黏度低， 相分离快，达到相平衡时间短，工艺参 数容易控制，工艺条件可调性范围大； • 系统经济，成本低，无毒，适合大规模 应用。
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双水相系统相图
PEG (%)
离子分配萃取
利用共价键将离子交换基团如 -NH2，-COOH， -PO43-， -SO42-结合在成相水溶性聚合物上，构成双 水相系统，与酶蛋白分子的相互作用进行分配的双 水相萃取，其分配行为在很大程度上与蛋白质的表 面电荷性质有关，也受到系统的各种因素，如pH、 盐浓度和种类、温度等条件的影响。由于这一类功 能团配基与酶的相互作用的选择性并不很高，萃取 效率和纯化倍数虽然比一般双水相萃取系统高，但 低于其他亲和萃取系统。 例如利用PEG-磷酸酯/磷酸盐系统进行β-干扰素 的提取，分配系数可达到630，杂蛋白几乎完全分配 在下相。 20
相图的双节点线的位置和形状与相系统组成及相系统组分的物理化 学性质有关，如聚合物的分子量和分子形状。在PEG/葡聚糖系统，如 果PEG分子量不变，增加葡聚糖的分子量，相分离所需的葡聚糖浓度 越低；两种聚合物分子量相差越大，双节点线的形状越不对称。 15 在PEG/盐系统中，PEG分子量越大，双节点线也越陡立。
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同一聚合物的疏水性随分子量的增
大而增大，当PEG的分子量增加时， 在质量浓度不变的情况下，其两端羟 基数减少，疏水性增加，亲水性的蛋 白质不再向富含PEG相中聚集，而转 向另一相。 那么，分子量降低时，蛋白质就易 分配于富含PEG的相了
(2)高聚物浓度——界面张力的影 响
当成相系统的总浓度增大时， 系统远离临界点，系线长度增加， 两相性质的差别(疏水性等)增大， 界面张力也随着增大，蛋白质分子 的分配系数将偏离临界点处的值 (m=1)，即大于1或小于1。
• (2) 与常用的亲和层析相比，双水相萃取能够 在较少的溶液量和较短的操作时间内获得较高 产量的产品。另外，操作能够容易、精确地按 比例放大，非常适合大规模应用，可进行连续 生产。而亲和层析由于操作难于放大，应用受 到限制。 • (3) 聚合物的浓度和分子质量、无机盐的种类 和浓度、 pH 以及温度等均能影响被分配物质 在两相间的分配，所以操作容易进行控制，进 而达到目的产物的最佳萃取条件。 • (4) 可与细胞破碎相结合，即细胞悬浮液中加 入PEG和无机盐后再通入珠磨机进行破碎，然 后用离心机分相。既节省了萃取设备和时间， 又避免了胞内酶的损失。
各种类型的双水相体系
类 型 形成上相的聚合物 形成下相的聚合物
葡聚糖 聚乙二醇 非离子型聚合物/ 非离子型聚合 物 聚乙烯醇 聚乙二醇
聚丙二醇
聚乙烯吡咯烷酮 高分子电解质/非离子型聚合物 高分子电解质/高分子电解质 聚合物/ 低分子量化合物 羧甲基纤维素钠 葡聚糖硫酸钠 葡聚糖 聚乙二醇 羧甲基纤维素钠 丙醇 磷酸钾 聚合物/ 无机盐 聚乙二醇
• 双水相萃般与水-有机相萃取的原理相似， 都是依据物质在两相间的选择性分配， 但萃取体系的性质不同。 当物质进入双 水相体系后，由于表面性质、电荷作用 和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的 存在和环境因素的影响，在上相和下相 间进行选择性分配，这种分配关系与常 规的萃取分配关系相比，表现出更大或 更小的分配系数。
双水相系统的相图可由实验测定： 将一定量的高聚物P浓溶液置于试 管内，然后用已知浓度的高聚物溶液 Q来滴定。 • 随着高聚物Q的加入，试管内溶液 由均相突然变混浊，记录Q的加量。 然后再在试管内加入l ml水，溶液又 澄清，继续滴加高聚物Q，溶液又变 混浊，计算此时系统的总组成。
•
3.4 双水相萃取的基本原理
• 1979年，Kula和Kroner等人将双水相体系 用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，使 胞内酶的提取过程大为改善。此后，对于 双水相体系的研究和应用逐步展开并取得 很大进展。现在双水相萃取已被广泛用于 蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器 等生物产品的分离和纯化，并逐步向工业 化生产迈进，展现了在食品工业、生物学 研究和生物工程方面的巨大应用前景。
• (5) 能进行萃取性的生物转化。在一些双 水相体系中可将发酵生产过程中的生物 转化与下游处理的第1步相结合，即生物 反应在其中一相中进行，同时生成的反 应产物被连续萃取到另一相中。不仅解 决了产物反馈抑制作用造成的产量低的 问题，而且酶在高聚物溶液中比在缓冲 液中更稳定，活性更大。因为生物反应 和生物产物的提取同时进行，尤其适于 连续生产。
（二）发展历史
• 1896年Beijerinck观察到当把明胶与琼脂 和可溶性淀粉的水溶液混合时先得到一个 混不透明的溶液，随之分为两相，上相富 含明胶，下相富含琼脂（或淀粉），从而 产生了双水相体系。 • 1956年，瑞典伦德大学的Albertsson重新 发现此体系并第一次用来提取生物物质。
发展历史
作用力为斥力：形成两个水相，两种高 聚物分别富集于上、下两相。 作用力为引力：也形成两个水相，但两 种高聚物都分配于一相，另一相几乎为溶剂。 作用力没有强烈的引力或斥力：完全互 溶，形成均相的高聚物水溶液 高聚物与高聚物形成两相是由于高聚物 的不相容性 高聚物与无机盐溶液也能形成两相，这 是由于盐析作用。
•
由于高聚物对生物活性物质有稳 定作用，在大规模生产中多采用常 温操作，从而节省冷冻费用。但适 当提高操作温度，体系黏度较低， 有利于分离。
3.6 双水相萃取的特点
双水相萃取对于生物物质的分离 和纯化表现出特有的优点和独有的 技术优势，具体表现在以下方面： • 1 易于放大。各种参数可以按比 例放大而产物收率并不降低。
（三）双水相的形成与相图
3.1概念
把两种或两种以上具有一定浓度的亲水性 聚合物溶液混合后静置，这些亲水性的高 分子聚合物并不混为一相，而是分成多个 液相，这种现象称之为聚合物的不相容性。
定义:
由于这些聚合物都是以水作为溶剂;因 此形成上述的两个相体系就称双水相体系。
利用双水相的成相现象及待分离组分 在两相间分配系数的差异，进行组分分离 或多水相提纯的技术就叫做双水相萃取技 术。
(3) 盐类
• 在双水相聚合物系统中，加入电解质， 首先阴阳离子会有不同的分配。
• 盐的正负离子在两相间的分配系数不同， 由于各相应保持电中性，因而在两相中形 成电位差，这对带电生物大分子的分配， 产生很大的影响。
在pH6.9时溶菌酶带正 电，卵蛋白带负电。当 加入NaCl时，其浓度低 于50mmol/L时可见上 相电位低于下相电位， 使溶菌酶分配在上相， 从而分配系数增大。 而卵蛋白的分配系数减 小。
• (6) 亲和萃取(亲和分配) 可大大提高分配系数和 萃取专一性。由于目标蛋白质与其他杂蛋白的 理化性质相近，造成其萃取专一性不高。亲和 萃取就是将一种和目标蛋白质有很强亲和力的 配基与一种成相聚合物共价结合，该成相聚合 物与另一种成相聚合物形成双水相体系进行萃 取时，目标蛋白质专一性地进入结合有配基的 那种成相聚合物所在相中，其它杂蛋白则进入 另一相。此技术已用于乙醇脱氢酶、丙酮酸激 酶和核酸内切酶等酶以及细胞、细胞器、膜等 粒子的提取。
硫酸铵
葡聚糖（Dextran） 与聚乙二醇 （PEG）按一定 比例与水混合，溶 液混浊，静置平衡 后，分成互不相溶 的两相，上相富含 PEG、下相富含 葡聚糖，见左图
3.2 双水相的形成
• 两种亲水性聚合物混合 1 混合熵的增加 2 分子间作用力 对大分子而言，由于相对分子质量较 大，分子间作用力与熵增加相比占主导地 位。
3.8 双水相萃取技术缺点：
• 易乳化、相分离时间长，成相聚合 物的成本较高，水溶性高聚物大多 数黏度较大，不易定量控制；水溶 性的高聚物难以挥发，使反萃必不 可少，高聚物回收困难等。
若A向双节线移 动，B、C两点接 近，系线长度趋 向于零时，即A 点在双节线K点 时，体系变成一 相，K称为临界 点。在同一系线 上不同的点，总 组成不同，而上、 下两相组成相同， 只是两相体积VT、 VB不同，但它们 均服从杠杆原理。
• B相和C相质量之比等于系线上CA 与AB的线段长度之比。又由于两 相密度相差很小(双水相体系上相 和下相密度常在1.0～1.1kg／dm3 之间)，故上下相体积之比也近似 等于系线上CA与AB线段长度之比， 即：
第一，pH值会影响蛋白质分子所带电荷的性 质和数量。 第二，pH值影响磷酸盐的离解程度，从而改 变H2PO4-和HPO42- 之间的比例，进而影响 相间电位差。这样蛋白质的分配因pH值的 变化发生变化。pH值的微小变化会使蛋白 温度
温度影响双水相系统的相图， 从而影响蛋白质的分配系数。温度 越高发生相分离所需的高聚物浓度 越高。在临界点附近对双水相体系 形成的影响更为明显。但一般来说， 当双水相系统离双节线足够远时， 1～2℃的温度改变不影响目标产物 的萃取分离。
结论：加入适当的 盐类，会大大促进 带相反电荷的生物 大分子的分离。
研究还发现，当盐类浓度增加到 一定程度，由于盐析作用蛋白质易 分配于上相。分配系数几乎随盐浓 度成指数增加，且不同的蛋白质增 大程度各异。利用此性质可使蛋白 质相互分离。KCl对分配的影响与 NacI类似。
(4) pH值
pH值对分配的影响源于两个方面的原因。
• 2 双水相系统之间的传质和平衡过 程速度快，回收效率高，能耗较小， 速度快。如选择适当体系，同收率 可达80％以上，提纯倍数可达2～ 20倍。 • 3 易于进行连续化操作，设备简 单，且可直接与后续提纯工序相连 接，无需进行特殊处理。
4 双水相体系的相间表面张力大 大低于有机溶剂与水相之间的相间 张力，相分离条件温和，因而会保 持绝大部分生物分子的活性，可直 接用在发酵液中。
双水相萃取技术
（Two-aqueous phase extraction）
目录
• • • • • • 一 背景 二 发展历史 三 双水相的形成与相图 四 双水相萃取的工艺流程 五 应用 六 发展方向
（一）背景
• 现代生物技术中，基因工程产品如蛋白质和酶往 往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化， 细胞颗粒尺寸的变化给固-液分离带来了困难，同 时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子强 度等环境因素特别敏感。由于它们在有机溶剂中 的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃取法 并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生 反胶束的办法可克服这些问题，但同样存在相的 分离问题。因此基因工程产品的商业化迫切需要 开发适合大规模生产的、经济简便的、快速高效 的分离纯化技术。其中双水相萃取技术(又称水溶 液两相分配技术)是近年来出现的引人注目、极有 前途的新型分离技术。
• 5 影响双水相体系的因素比较复杂，可以 采取多种手段来提高选择性或提高收率。 • 6 操作条件温和，整个操作过程在常温常 压下进行。 • 7 不存在有机溶剂残留问题，高聚物一般 是不挥发性物质，因而操作环境对人体无 害。
• 8 亲和双水相萃取技术可以提高分配系数 和萃取的专一性。
3.7 双水相萃取的优点
•
适宜的工艺条件主要通过实验 方法得到。 • 这些因素直接影响被分配物质 在两相的界面特性和电位差，并 间接影响物质在两相的分配。通 过选择合适的萃取条件，可以提 高生物物质的收率和纯度，也可 以通过改变条件将生物物质从双 水相体系中反萃出来。